Analyse des huiles essentielles:

Les analyses des huiles essentielles des six espèces de plantes par CPG-Ir et par RIvIN ont été effectuées au laboratoire de « Chimie et Biomasse» de l'Université de Corse-CNRS.

III.!. Chromatographie en phase gazeuse (CPG):

La CPG est la technique la plus adaptée pour l'analyse des huiles essentielles compte tenu de la volatilité de leurs constituants (Bruneton, 1999).

111.1.1. Conditions opératoires:

Les analyses ont été faites à l'aide d'un chromatographe Perkin-Elmer Autosystem (8500), équipé d'Un détecteur à ionisation de flamme (FID), d'un injecteur diviseur, de deux colonnes capillaires de dimensions 50m x 0,22 mm (épaisseur du film: 0,25 pm):

Une colonne polaire BP20, polyéthylène glycole . Une colonne apolaire BPI, diméthylsiloxane

- Le gaz vecteur est l'hélium (0,8m1/min), avec une pression en tête de colonne de 20psi - La température de l'injecteur est de 250°C, celle du détecteur est de 250°C

- La température linéaire est programmée depuis 60°C jusqu'à 220°C, à raison de 2'C/min, suivie d'un palier de 20 min à 220°C

- Injection automatique : 0,1jtl en mode Split (1/60).

111.1.2 Identification des constituants

Les constituants ont été identifiés par comparaison de leurs indices de rétention (Ir) calculés par rapport à une série d'alcanes (C8-C28) avec interpolation linéaire sur les deux

Partie expérimentale

colonnes, avec ceux des composés de référence, contenus dans la bibliothèque du laboratoire

(Joulain et Knig, 1998).

111.2. Analyse par chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse (CPG-SM) :

Seules les huiles essentielles de Thymus fontanesii et de Ziziphora hispanica ont été analysées par chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse (CPG-SM), réalisée au laboratoire de « Chimie des Produits Naturels » de l'Université de Corse.

111.2.1. Conditions opératoires:

Les huiles essentielles sont analysés à l'aide d'un chromatographe Perkin Elmer Autosystem XL, doté d'un injecteur automatique et d'une colonne capillaire de silice fondue, BP-l(polydiméthylsiloxane, de dimension 60 m x 0.22 mm, épaisseur du film 0.25 tm) ou Rtx-1(polydiméthyl-siloxane) et Rtx-Wax (polyéthylène glycol), couplé à un détecteur de masse Perkin TURBO MASS. Les molécules sont bombardées dans une source d'ionisation de 150°C par un faisceau électronique de 70eV, la détection se fait par un analyseur quadripolaire constitué d'un assemblage de quatre électrodes parallèles de section cylindrique. - Le gaz vecteur est l'hélium (lml/min), exerçant une pression en tête de colonne de 43psi. - La température linéaire est programmée depuis 60°C jusqu'à 230'C, à raison de 2°C/min,

suivie d'un palier de 45min à 230'C

- Spectre de masse à ionisation électrique obtenu au-dessus d'un intervalle de 35-350 Da. - Injection automatique: 0,2d en mode Split (1/80).

111.2.2. Identification des constituants:

La méthode d'identification est basée sur la comparaison du spectre de masse, obtenu pour chacun des composés de l'huile essentielle lors de la fragmentation de nos solutés, avec une banque de spectres de produits de référence (Adams, 1989; Mc Lafferty et Stauffer,

1994; Joulain et K6nig, 1998; National Institute of Standards and Technology, 1999).

Actuellement le laboratoire de «Chimie des Produits Naturels », de l'Université de Corse, possède cinq banques de spectres différentes, deux banques propres au laboratoire et trois banques commerciales.

Partie expérimentale

III.3.Analyse par spectroscopie de la résonance magnétique du carbone 13 (RMN ¹³ C):

La RMN du ¹³C selon la méthode mise au point et développée par l'équipe «Chimie et Biomasse » de l'Université de Corse (Tomi et al., 1995), est basée sur la comparaison des déplacements chimiques des carbones du mélange avec ceux des produits de référence enregistrés dans des conditions expérimentales (solvant, dilution) rigoureusement identiques à celles des huiles essentielles et stockés dans des bibliothèques de spectres propres au laboratoire.

111.3.1. Conditions opératoires:

Les spectres RMN ont été enregistrés dans le chloroforme deutéré, sur spectromètre de marque «Bruker AVANCE 400 », opérant à 100,623 MHz pour le carbone 13, sous les conditions opératoires suivantes: Sonde de 5mm, durée d'impulsion (PW): 4J.Ls (angle 45°), temps d'acquisition: 2,73 s correspondant à une acquisition de 128 K avec une largeur spéciale (SW) de 25000 Hz (250 ppm), résolution digitale: 0,1 83Hz/pt, mode de découplage pulsé (Composite Phase Decoupling), le nombre d'accumulation est compris entre 2000 et 3000 pour chaque enregistrement. Les déplacements chimiques sont des donnés en ppm () (Tétraméthyl Silane) par rapport au TMS pris comme référence interne.

L'analyse d'un mélange est menée sur un échantillon de 40mg dilué dans 0,5 ml de CDC13. Les données du signal de précession libre (FID) sont multipliées avant la transformée de Fourrier par une fonction exponentielle (LB1,OHz).

111.3.2. Identification des constituants:

L'identification est réalisée par la prise en compte du nombre de pics observés par rapport à ceux attendus pour chaque molécule, du nombre de superpositions des signaux et des variations des déplacements chimiques des carbones dans les spectres du mélange par rapport aux valeurs de référence (z\). En plus de ces paramètres qui sont directement accessibles par un logiciel élaborés au laboratoire de «Chimie et Biomasse » à l'Université de Corse (Tomi et al., 1995), l'intensité des raies de résonance permet de contrôler l'appartenance d'un déplacement chimique à un composé donné. Cette Technique permet l'identification de différents composants à une teneur supérieure ou égale à 0,5% sans purification précédente.

111.4. Fractionnement de l'huile essentielle de Ziziphora hispanica:

Dans l'optique de mener une analyse plus approfondie et donc d'identifier un plus grand nombre de composés pour l'huile essentielle de Ziziphora hispanica, il était nécessaire de

Partie expérimentale

combiner un fractionnement sur colonne ouverte de silice avec des analyses par CPG-Ir, CPG-SM et RMN du carbone-13 car cette huile contient un pourcentage élevé en pulégone (77,6 - 79,5%) qui nous a empêcher d'identifier les autres composants qui se trouvent en faibles quantités.

Nous avons procédé à une chromatographie «Flash» de 1g d'huile essentielle de Ziziphora hispanica, sur une colonne de silice (ICN 200-500 im, 10g), avec un solvant pur de pentane, un mélange de pentane/oxyde de diéthyle (95/5) et un solvant pur (oxyde de diéthyle), respectivement (Tableau 14).

Après humidification de 15g de gel de silice (200-500tm) -soit sur une longueur de 10cm-par du pentane, on a placé 1g d'huile essentielle. Des élutions successives de lOOmI de solvant ont été effectuées pour conduire à des fractions de polarité croissante.

Tableau (14) Fractionnement de l'huile essentielle de Ziziphora hispanica

Numéro de fraction Pentane / Oxyde de diéthyle (%) Poids des fractions (mg)

1 100/0 50

2 95/5 828

3 0/100 107

Les fractions ainsi obtenues ont été analysées par CPG-Ir et par RMN

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IV- Etude du pouvoir antibactérien des huiles essentielles des différentes espèces