Analyse de l’extrait par HPLC-TOF/MS

L’importance biologique des polyphénols et en particulier des flavonoïdes et des tanins ne cessent d’augmenter ce qui justifie le grand intérêt qui leur est consacré. De ce fait, leur caractérisation qualitative et quantitative dans les divers milieux représente un véritable enjeu.

Notre extrait a été analysé par HPLC-TOF/MS afin d’identifier le maximum de molécules phénoliques qui entrent dans sa composition. Toutes les molécules détectées ont été caractérisées par étude de leur fragmentation obtenue en mode négatif. Des témoins ont

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également été analysés dans les mêmes conditions chromatographiques afin de comparer leurs caractéristiques à celles des composants de l’extrait d’étude.

La figure 27 représente le profil chromatographique obtenu avec assignation des pics majoritaires. Le chromatogramme de l’extrait aqueux brut de L. guyonianum peut être divisé en 3 parties distinctes : la première de 1.5 à 6.0 min, la deuxième s’étale entre 6.0 et 19.0 min et enfin la troisième située de 19.0 à 28.5 min de temps de rétention. Le profil révèle la présence de 11 pics majeurs détectés avec des temps de rétention variant entre 2.372 et 18.915 min.

Figure 27 : Chromatogramme de l’extrait aqueux de de L. guyonianum obtenu sur un

chromatographe HPLC équipé d’un détecteur LC-MS 6210 TOF et d’une colonne ZORBAX SB-C18 (4.6 x100 mm, 3.5 µm).

Dans la 1ère _{partie 1.5-6.0 min, le profil HPLC a montré un ensemble de pics bien résolus} caractérisés par un épaulement de pics plus ou moins marqué. Cette partie est représentée par 6 pics dont un pic majoritaire avec un temps de rétention de 3.19 min. Quatre composés à savoir l’acide fumarique, l’acide gallique, l’acide gentisique et la catéchine (flavanol) ont été détectés. La 2ème _{partie du chromatogramme est moins étoffée caractérisée par la présence de petits pics} dans l’ensemble, plus ou moins résolus dont un pic majoritaire avec un temps de rétention de 18.915 min. En outre, une élévation de la ligne de base du profil d’élution est bien constatée dans cet intervalle. Ce type de comportement traduit souvent la présence de tanins condensés, sous famille hétérogène de polyphénols très abondante dans le règne végétal. On parle alors de bosse de tanins (Lantto et al., 2009). En tout, 7 composés phénoliques ont été détectés dans

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cette partie, 4 acides phénoliques (acide hydroxybenzoique, acide vanilique, acide syringique et acide cinnamique), 1 flavanone (naringine) et 2 flavones (diosmine et eupatorine). D’autre part, la présence de pics marqués tout au long de cette bosse laisse supposer que d’autres composés polyphénoliques seraient co-élués en même temps. Ceci nous permet de prédire la présence forte possible d’autres composés appartenant aux différentes sous-familles de polyphénols. Enfin, la 3ème _{partie du chromatogramme est caractérisée par la présence d’une} crête de pics de 24 à 28 min et qui n’a permis de détecter aucun composé.

La caractérisation chimique de l’extrait aqueux de L. guyonianum réalisée par analyse détaillée de l’extrait par HPLC-TOF/MS avec une ionisation en mode négatif (mode le plus sensible et le plus informatif) nous a permis de démontrer la richesse particulière de l’extrait en acides phénoliques. En effet, parmi les onze composés identifiés, six sont des acides phénoliques ce qui représente 54.54 % des composés détectés de l’extrait brut et l’acide fumarique. Le reste des composés appartiennent aux classes des flavones aglycones, des flavanols et des flavanones glycosylés. Les composés phénoliques identifiés ainsi que leurs structures sont consignés dans le tableau 07.

De même, sur le plan quantitatif l’analyse HPLC a révélé que l’extrait aqueux est composé essentiellement d’acide fumarique (35.52 %), d’acides phénoliques (21.80 %) et de flavonoïdes (42.68 %) dont les quasi-totalités sont des flavones (39.25 %). L’extrait, particulièrement riche en acides phénoliques, est caractérisé par sa forte teneur en acide fumarique qui représente 61.97 % des acides quantifiés soit 35.52 % de la composition globale de l’extrait. On note la richesse de l’extrait en flavones (91.96 % des flavonoïdes) avec une prédominance nette de l’eupatorine qui représente 65.01 % des flavonoïdes soit 27.75 % de l’extrait. Cette analyse a révélé aussi que la diosmine est le 3ème _{composé majeur de l’extrait} (11.5 %) contrairement à la naringine qui se trouve à l’état de traces (0.05 %).

Trabelsi et al. (2012) ont démontré la forte présence de 3 dérivés cathéchiques à savoir la gallocatechine, l’epigallocatechine et l’epigallocatechine-3-O-gallate chez L. guyonianum et qui sont vraisemblablement les mêmes composés majeurs du thé (Li et al., 2010). De même, l’acide p-coumarique, la catéchine, l'épigallocatéchine-3-O-gallate, la gallo-catéchine et l'acide sinapique ont été identifiés dans différentes fractions de L. guyonianum (Trabelsi et al., 2013a). En outre, ces mêmes auteurs ont pu isoler le limoniastramide, un dimère formé de deux monomères naturels N-E-caféoyl tyramine et le N-E-féruloyl tyramine.

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Tableau 07 : Proportions et structures chimiques des composés phénoliques identifiés de

l’extrait aqueux de L. guyonianum

Composés identifiés Teneur (mg/Kg) Structure Classe

Acide gallique 0.46 Acides phénoliques

66+Acide gentisique 0.67 Acides phénoliques

Catéchine 0.67 Flavanols

Acide

4-hydroxybenzoique

0.48 Acides phénoliques

Acide vanilique 0.55 Acides phénoliques

Acide syringique 1.36 Acides phénoliques

Naringine 0.01 Flavanones

Diosmine 2.28 Flavones

Acide cinnamique 0.80 Acides phénoliques

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Il a été rapporté que l’extrait aqueux des galles de L. guyonianum est relativement riche en tanins condensés où une forte hétérogénéité structurale a été observée avec une prédominance accrue de l'épigallocatéchine gallate. Les résidus de galloyle, les oligosaccharides et l’épicatéchine ont été aussi identifiés (Krifa et al., 2014a). En 2010, Medimagh et al. ont déjà signalé la présence de gallocatéchine et de trans-syringine dans les racines de L. guyonianum.

Plusieurs travaux portant sur l’étude des composés phénoliques du genre Limonium ont été publiés dans la littérature au cours des dernières années. Même s'il n'existe pas beaucoup de travaux concernant l'identification de composés polyphénoliques dans L. guyonianum voire même de son genre Limoniastrum, il est nécessaire de cibler les études faites sur des espèces voisines. Ceci est surtout important dans l’avenir pour mettre au point un modèle polyphénolique caractéristique qui permet d'établir des relations taxonomiques entre les différentes espèces (Lahtinen, 2003). Il est connu que différents composés secondaires peuvent être spécifiques aux ordres, familles, espèces, et parfois même aux taxa (Laitinen, 2000), parmi lesquels les flavonoïdes qui sont utilisés dans la chimiotaxonomie végétale (Swain, 1963 ; Alston et Turner, 1963 ; Lebreton et Meneret, 1964 ; IdrissiHassani, 1985).

Malgré qu’au cours de cette étude on n’a pas pu identifier la totalité des composés phénoliques présents dans l’extrait aqueux des feuilles, nos résultats concordent bien avec ceux de plusieurs recherches quant à la richesse des extraits des feuilles de plusieurs espèces

Limoniastrum en composés phénoliques et plus particulièrement en acides phénols et en

flavonoïdes. Le tableau 08 montre certains métabolites secondaires isolées de quelques espèces des genres Limoniastrum et Limonium.

A l’heure actuelle de nombreuses études s'intéressent à l'identification des polyphénols chez les halophytes d’une manière générale et plus particulièrement chez le genre Limonium. Ces études portent surtout sur les variations qualitatives et quantitatives du contenu de composés phénoliques sous l'influence de facteurs biotiques et abiotiques. D’après la revue bibliographique qu’on a fait sur l'identification et la quantification de polyphénols de L.

guyonianum, notre étude montre pour la première fois la présence de l’acide fumarique,

l’eupatorine, la diosmine, l’acide syringique, l’acide cinnamique, l’acide gentisique, l’acide vanilique, l’acide hydroxybenzoique et la naringine.

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Tableau 08 : Principaux métabolites secondaires isolées de quelques espèces des genres Limoniastrum et Limonium

Espèce Composés identifiés Référence

L. feei Acide gallique, myrciaphenone, myricétine-3-O-β- galactopyranoside, gallate d'épigallocatéchine, myricétine 3- O-α-rhamnopyranoside, quercétine et myricétine.

Chaabi et al. (2008)

L. feei quercétine,kaempférol-3-O-β-D-glucopyranoside (astragaline) et quercétine-7-O-β-D-glucopyranoside

Ziane et al. (2015)

L. monopetalum 7 acides phénoliques : gallique, p-hydroxybenzoïque, chlorogénique, syringique, vanillique, férulique, et l’acide trans-cinnamique. 4 flavonoïdes : quercétine, apigénine, amentoflavone et flavone

Trabelsi et al. (2010)