Activité antioxydante in vitro 1 Effet piégeur du radical DPPH•

Le DPPH• (2,2-phényl-1-picryl hydrazyl) est un radical libre de couleur violette qui est réduit en DPPH-H (2,2-phényl-1-picryl hydrazine), de couleur jaune, en présence de donneurs de protons. L’intensité de la coloration est inversement proportionnelle à l’activité anti- radicalaire. Ce test est réalisé selon le protocole décrit par Que et al. (2006). Un volume de 500 μl de la solution de DPPH• 0.1 mM est ajouté à 500 μl des solutions de l’extrait ou du standard (BHT) à différentes concentrations, le mélange est vigoureusement agité puis laissé à l’obscurité et à température ambiante pendant 30 min. Les absorbances sont lues à 517 nm contre un contrôle contenant un volume égal de méthanol et de DPPH•. Les essais sont réalisés en triplicata et les résultats sont exprimés en activité antiradicalaire.

Activité antiradicalaire I (%) = [(Ac - At)/Ac] x 100 Ac : Absorbance du contrôle

At : Absorbance de l’échantillon

La concentration minimale inhibitrice à 50 % (IC50) est déterminée sur le graphe représentant le pourcentage d’inhibition du DPPH en fonction des concentrations des extraits et du standard (Molyneux, 2004). Afin de mieux caractériser l’activité antiradicalaire calculée pour chaque concentration, 2 autres paramètres ont été déterminés à savoir la concentration effectrice à 50 % (EC50) et le pouvoir antiradicalaire (ARP) qui n’est que l’inverse de l’EC50.

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IV.1.2. Test de réduction du radical-cation ABTS•+

Le test de piégeage du radical ABTS•+ (2,2-azino-bis-3-ethylbenzothiazoline-6- sulfonique) est basé sur la capacité d’un antioxydant de le réduire. En réagissant avec le persulfate de potassium (K2S2O8), l’ABTS forme le radical ABTS+• de couleur bleue à verte. L'ajout de donneur d’hydrogène permet de réduire ce radical et provoque la décoloration du mélange. Cette décoloration est mesurable à 734 nm (Marc et al., 2004).

Ce test a été réalisé selon le protocole décrit par Re et al. (1999).Un volume de 30 μl d’extrait ou de méthanol sont additionnés à 2970 μl de solution d’ABTS+•. L’absorbance est mesurée à 734 nm après 1 heure d’incubation à l’obscurité et à température ambiante. Le radical ABTS est préalablement généré en mélangeant à volume égal d’une solution méthanolique de persulfate de potassium 3 mM et d’une solutionméthanolique d'ABTS 8 mM, le mélange est placé à l'abri de la lumière et à température ambiante pendant 16 h avant son utilisation (Awika et al., 2005). La solution obtenue est diluée avec du tampon phosphate (0.2 M, pH 7.4) contenant 150 mmoles/l de NaCl pour obtenir une absorbance de 1.5. Un volume de 2.9 ml de cette solution fraichement préparée est ajouté à 0.1 ml d'extrait et l’absorbance est mesurée après 30 min d’incubation à température ambiante. Les résultats sont exprimés en pourcentage d’inhibition et en activité antiradicalaire (IC50) de la même façon que ceux décrits précédemment pour le test DPPH (Re et al., 1999).

IV.1.3. Test de blanchissement du β-carotène

La capacité antioxydante est déterminée en mesurant l’inhibition de l’oxydation du β- carotène par les produits d’oxydation de l’acide linoléique. Le test est réalisé selon le protocole décrit par Tepe et al. (2005). Une émulsion β-carotène/acide linoléique est préparée par dissolution 0.5 mg de β-carotène dans 1 ml de chloroforme, auxquels sont additionnés 25 μl d’acide linoléique et 200 mg de Tween 40. Le chloroforme est complètement éliminé par évaporation à 40°C. Par la suite, 100 ml d’eau distillée saturée en oxygène sont ajoutés et l’émulsion résultante est vigoureusement agitée. Enfin, 350 μl de la solution d’extrait sont ajoutés à 2.5 ml de cette émulsion et le mélange est incubé pendant 2 heures à 50 °C dans un bain-marie. Deux tubes témoins sont préparés : l’un contenant le BHT (témoin positif) et l’autre sans antioxydant (témoin négatif) où l’échantillon est remplacé par 350 µl d’eau distillée. La décoloration de l’émulsion est suivie à 470 nm à des intervalles de temps réguliers pendant 48 heures.

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Tous les essais sont réalisés avec 3 répétitions et l’activité antioxydante relative de l’extrait (AAR) est calculée selon l’équation suivante :

AAR = [Aech / A BHT] x 100

Aech : Absorbance de l’échantillon après 48 heures

ABHT : Absorbance du BHT après 48 heures

IV.1.4. Pouvoir réducteur (FRAP)

La méthode FRAP (Ferric Reducing Antioxydant Power) permet de mesurer la capacité antioxydante totale des extraits de plantes en évaluant la réduction du fer ferrique en fer ferreux (Pellegrini et al., 2003). La formation d’une couleur bleue intense permet de réaliser les mesures du pouvoir réducteur à 700 nm.

Le pouvoir réducteur de l’extrait est déterminé selon la méthode décrite par Li et al. (2007) qui consiste à mélanger 1 ml de l’extrait ou de BHT à différentes concentrations avec 2.5 ml de tampon phosphate 0.2 M à pH 6.6 et 2.5 ml d’une solution de de ferricyanide de potassium [K3Fe(CN)6] à 1 % (m/v). Le mélange est incubé pendant 20 min à 50°C, puis 2.5 ml d’acide trichloracétique (TCA) à 10 % sont alors ajoutés pour stopper la réaction. Après centrifugation à 3000 rpm/10 min, 2.5 ml de surnageant sont mélangés avec 2.5 ml d’eau distillée et 0.5 ml de chlorure de fer 0.1 % (FeCl3) fraichement préparé dans de l’eau distillée. Les essais sont répétés trois fois et les résultats permettent de calculer graphiquement la concentration effectrice (EC50).

IV.1.5. Chélation du fer ferreux

La capacité chélatrice de l’extrait aqueux a été évaluée selon le protocole décrit par Li et al. (2007) basé sur le pouvoir inhibiteur de la formation du complexe Fe(II)-Ferrosine une fois que les échantillons sont traités avec les ions Fe2+_{. Un volume de 700 μl de l’échantillon} ou du standard (EDTA) à différentes concentrations sont mélangées avec 50 μl de FeCl2 (0.6 mM) auxquels sont ajoutés 50 μl de ferrosine (5 mM) après une incubation de 5 min. Le mélange obtenu est bien agité puis incubé à température ambiante pendant 10 min. La complexation du fer résiduel génère un chromophore rouge (Fe(II)-Ferrozine) avec un maximum d’absorption à 562 nm. L’effet chélateur de l’extrait vis-à-vis du fer est exprimé en pourcentage de chélation.

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Activité chélatrice (%) = [(Ac- At)/Ac] x 100 Ac : Absorbance du contrôle

At : Absorbance du test

L'efficacité antioxydante de l’extrait peut être mieux caractérisée en exprimant l'activité chélatrice en mg d'équivalent d'EDTA/g d'extrait, et en calculant la concentration qui produit 50 % d'effet chélateur (EC50).

IV.2. Effet préventif de l’extrait contre l’hématotoxicité causée par le nickel