Analyse des EV libérées par les THP1 en réponse à l’exposition aux PM 2.5

L’un des objectifs de ces travaux de thèse était d’observer l’effet d’une exposition aux particules fines sur les EV libérées en réponse. Pour cela, nous avons isolé les EV du milieu de culture des THP1. Après les avoir quantifiées, nous avons analysé deux marqueurs protéiques retrouvés à la surface des EV : CD63 et CD81. Enfin, nous avons quantifié des miARN, dans le but d’observer si les modifications d’expression des miARN retrouvées dans les macrophages étaient transmises dans les EV, mais également de savoir si le profil en miARN était différent entre les EV libérées suite à l’exposition et celles libérées spontanément par les THP1.

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a) Notation des échantillons des EV de THP1

Nous avons obtenu 9 échantillons, correspondant aux 9 conditions d’exposition (tableau 15).

Tableau 15 : Notation des échantillons de THP1

6h 24h 48h

Témoin T.6h T.24h T.48h

12,5µg/ml [12,5].6h [12,5].24h [12,5].48h

50µg/ml [50].6h [50].24h [50].48h

b) Microscopie électronique des EV de THP1

Nous avons observé par microscopie électronique la présence d’EV dans les surnageants de culture de THP1. Cette observation montre une population relativement homogène au niveau de la morphologie et de la taille (figure 54).

Figure 54 : Images de microscopie électronique à balayage des EV libérées par les THP1 Les « T » correspondent aux THP1 non exposées (0 µg /mL) aux 3 temps d’exposition (6h, 24h et 48h)

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c) Dosage des EV de THP1

La taille et la quantité des EV ont également été analysées par une technique de suivi individuel (figure 55 et tableau 16).

Figure 55 : Quantification de l'échantillon d'EV [50].48h par Nanoparticle Tracking Analysis

Graphique représentatif d’une analyse individuelle de particules réalisée au Nanosight®

Tableau 16 : Quantification des échantillons d'EV libérées par les THP1 suite à l'exposition aux PM2.5

Analyse individuelle de particules réalisée au Nanosight®

Echantillon ^{Taille moyenne des} EV

(nm)

Nombre d’EV par échantillon Nombre de cellules (THP1) exposées aux PM2.5 Nombre d’EV libérées par cellules T.6h 149,8 +/- 2,5 0 ,135 x 1013 2,626 x 108 5 140 [12,5].6h 149,2 +/- 2,5 1,054 x 1013 2,598 x 108 40 572 [50].6h 142,3 +/- 4,5 1,029 x 1013 2,526 x 108 40 728 T.24h 186,6 +/- 3,4 1,824 x 1013 2,746 x 108 66 423 [12,5].24h 185,7 +/- 3,8 2,288 x 1013 2,536 x 108 90 220 [50].24h 139,3 +/- 2,4 3,440 x 1013 1,520 x 108 226 315 T.48h 193,8 +/- 2,4 2,064 x 1013 3,965 x 108 52 055 [12,5].48h 188,4 +/- 2,0 6,045 x 1013 2,511 x 108 240 740 [50].48h 189,9 +/- 1,8 7,264 x 1013 2,471 x 108 293 970

L’analyse au Nanosight® montre que les EV ont un diamètre moyen allant de 139 nm à 193 nm (tableau 16). Les mesures révèlent aussi que les vésicules obtenues après 6h présentent une taille comprises entre 140 et 150 nm, alors que celles produites à partir de 24h, présentent une taille supérieure comprise entre 185 et 190 nm (à l’exception de l’échantillon [50].24h) Les épaulements observés sur le profil granulométrique de

159 l’échantillon d’EV [50].48h montré en exemple (figure 55) correspondent à des multiples de la taille moyenne minimale observée, suggérant la formation d’agrégats d’EV. Il est possible également que le stimulus provoqué par l’exposition aux particules, entraine la libération d’EV de tailles différentes, comme montré dans des études précédentes (Bonzini et al., 2017; Pergoli et al., 2017).

Puis, nous avons calculé le nombre d’EV libérées par cellule en réponse à l’exposition aux PM2.5. Les résultats obtenus montrent une augmentation du nombre d’EV en fonction du temps d’exposition et de la concentration en PM2,5 (figure 56). Ce type de résultat a déjà été montré par Bonzini et al dans le sang de 51 volontaires exposés aux PM2.5 et par Pergoli et al lors de leurs travaux sur les EV libérées par des macrophages et des plaquettes en réponse à l’exposition aux PM2.5 (Bonzini et al., 2017; Pergoli et al., 2017).

Figure 56 : Nombre d’EV libérées par cellule après exposition des THP1 aux PM2.5

Quantification réalisée après dosage des EV au Nanosight® et quantification du nombre de cellules exposées au Cellometer®

Cette analyse nous donne différentes informations. Tout d’abord, les cellules libèrent plus d’EV en réponse à l’exposition aux PM2.5, même après un court temps d’exposition comme 6h. Ensuite, nous observons une libération croissante des EV par les THP1 avec une dose croissante de PM2.5. Cela montre que l’exposition aux particules déclenche une libération des EV dépendante de la dose et du temps d’exposition.

De manière à compléter l’analyse des EV, deux marqueurs protéiques CD63 et CD81, marqueurs spécifiques des exosomes (chapitre I.E.1.) (Kowal et al., 2014) ont été analysés par western blot.

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Figure 57 : Analyse protéique de CD63 et CD81 dans les EV de THP1 après exposition aux PM2.5

Analyse réalisée par Western Blot

Le résultat (figure 57) semble montrer une augmentation de la quantité de ces marqueurs en fonction du temps d’exposition et de la concentration en PM2.5, à l’exception de l’échantillon [50].24h, qui semble contenir moins de CD63 et CD81 que les deux autres échantillons d’EV libérées après 48h d’exposition.

A l’exception de l’échantillon [50].24h, l’analyse par western blot rejoint la quantification au Nanosight® et traduirait une augmentation du nombre d’EV suite à l’exposition des THP1 aux PM2.5.

Ces différentes analyses permettent de confirmer que l’exposition aux PM2.5 entraine une libération plus importante d’EV, croissante avec l’augmentation de la concentration en PM2.5 et la durée d’exposition.

d) Quantification des miARN dans les EV de THP1

Tout d’abord la concentration en miARN a été quantifiée par Bioanalyzer®. Les résultats obtenus montrent une modification de la concentration en miARN après exposition aux PM2.5 (tableau 17).

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Tableau 17 : Concentration en miARN dans les EV de THP1 après exposition aux PM2.5

Dosage réalisé par Bioanalyzer®

Échantillon Concentration en miARN (pg/µl)

T.6h 1 589,50 [12,5].6h _{4 131,20} [50].6h _{1 334,70} T.24h _210,60 [12,5].24h _2079,20 [50].24h _381,00 T.48h _2687,10 [12,5].48h _499,1 [50].48h 51,60

Après 6h d’exposition, nous observons une augmentation de la concentration en miARN dans les échantillons exposés à 12,5 µg/mL de particules. En revanche, la concentration entre les miARN des EV libérées par des cellules témoin et par les cellules exposées à 50 µg/mL de PM2.5 semble être légèrement diminuée. Après 24h d’exposition, nous observons toujours une augmentation importante de la quantité de miARN après exposition à 12,5 µg/mL de PM2.5. La concentration en miARN dans les EV de cellules exposées à 50 µg/mL de particules est augmentée également par rapport à celle retrouvée dans les EV témoin, cependant elle est bien moindre qu’après exposition à 12,5 µg/mL de PM2.5. Enfin, nos résultats montrent une diminution importante de la concentration en miARN dans les EV libérées après 48h d’exposition, dépendamment de la concentration en PM2.5.

Les analyses ont ensuite été poursuivies par la quantification des miARN par qPCR (figure 58). Il n’existe actuellement pas de miARN de référence dans les EV. Nous avons déterminé par analyses statistiques miR-16 comme meilleur candidat, celui-ci ayant de plus déjà été utilisé comme miARN de référence pour la quantification des niveaux de miARN dans les EV (Masè et al., 2017), notamment lors d’une étude précédente menée au laboratoire (Héliot et al., 2017) (Cf Matériels et Méthodes, Analyses statistiques).

Nous avons testé 16 miARN dans les EV de THP1 après exposition aux PM2.5 : 7a, let-7g, 19a, 21, miR27a, 29a, 29b.1, 125, 128, 146a, miR-155, miR-193, miR-200c, miR-222, miR-223 et miR-421. La figure 61 présente les résultats pour 3 des 16 miARN : let-7a, miR-21 et miR-146a. Les résultats obtenus montrent un profil identique pour tous les miARN (annexe IV). Nous observons une augmentation des niveaux après 6h d’exposition, une diminution après 24 h d’exposition et pour finir une

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nouvelle augmentation des 3 miARN après 48 h d’exposition pour la concentration 12,5 µg/mL et une diminution après 48h d’exposition pour la concentration 50 µg/mL.

Figure 58 : Analyse des niveaux de let-7a, miR-21 et miR-146a dans les EV libérées par les THP1 après

exposition aux PM2.5

Quantification relative normalisée sur la quantité de miR-16. A : let-7a ; B : miR-21 ; C : miR-146a

Ces résultats sont différents des résultats obtenus pour les miARN dans les THP1 (figure 53). Il y a donc une différence entre l’expression des miARN dans les cellules et celle dans les EV libérées par ces cellules.

Cette partie de l’étude a permis de montrer que l’exposition des macrophages aux PM2.5 entraine une libération plus importante d’EV et que les EV libérées voient leur profil en miARN modifié en fonction du temps et de la dose en PM2.5.

Cette phase d’optimisation a mis en évidence qu’une exposition des THP1 aux PM2.5

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le stress oxydant ainsi qu’une libération plus importante d’EV par les cellules. Ce travail nous a également permis de déterminer les conditions expérimentales et d’optimiser les protocoles que nous utiliserons pour la suite des travaux, sur les macrophages primaires, isolés à partir de poches de sang.