Analyse des composés aromatiques

Les composés volatils d’un vin sont généralement analysés par chromatographie en phase gazeuse suivi d’une détection par photométrie de flamme (GC-FPD) ou par GC couplée à la spectrométrie de masse (GC-MS).

Dans la plupart des cas, une extraction liquide-liquide en utilisant des solvants comme le dichlorométhane a été nécessaire avant l’étape de chromatographie.

Les composés dosés au cours de ce travail sont analysés en utilisant la GC-MS à l’exception des composés soufrés légers (analysés par GC-FPD).

7.1. Dosage des composés soufrés légers par GC-FPD

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point par Lavigne et al. (1993).

Le vin à doser, placé dans une demi-bouteille de 750 mL, est additionné de 75 µL d’étalon interne (thiophène à 100 µg/L). Après avoir soustrait 150 mL de l’échantillon, celui-ci est fermé hermétiquement à l’aide d’un bouchon à jupe rabattable. Après 24 heures à température ambiante et à l’obscurité afin d’éviter l’apparition d’éventuels « goûts de lumière », on prélève un volume connu de gaz à l’aide d’une seringue à insuline. On injecte 1 mL.

Les sulfures volatils ont été séparés par un chromatographe HP-5890-I, équipé d’une colonne capillaire de type Carbowax 20M (CP WAX 52 CB, CHROMPACK, 50 m×0.22 mm, 0.25 µ).

Le gaz vecteur utilisé est l’hydrogène U (58 kPa, 1.2 mL/min). La température est programmée de 35°C (isotherme initiale : 1 min.) à 230°C (isotherme finale : 5 min), à raison de 3°C/min.

L’injection a été pratiquée à 230°C en mode splitless rapport de division = 70, temps de fermeture : 30 s). Le détecteur utilisé en sortie de colonne est un détecteur à photométrie de flamme (FPD) de type simple flamme HP-19256-A, calé à la longueur d’onde d’émission

λ= 393 nm) grâce à un filtre interférentiel.

Le détecteur est maintenu à 200°C et alimenté par : H₂ = 76 mL/min, O₂+H₂ [80:20] = 90 mL/min., N₂ = 38 mL/min.

7.2. Dosage du sotolon par GC-MS

La méthode utilisée pour l’extraction du sotolon est celle décrite par Pons et al.(2008). Cent microlitres d’étalon interne (octan-3-ol) en solution alcoolique (100 mg/L) et 15 g de sulfate d’ammonium [NH4(SO4)2] sont ajoutés à 100 mL de vin afin de favoriser la volatilisation des composés.

Le vin a été alors soumis à trois extractions liquide-liquide successives (10, 5 et 5 mL de dichlorométhane) sous agitation magnétique (10, 5 et 5 minutes) à 750 rpm.

Les phases organiques sont récupérées, assemblées, séchées au sulfate de sodium anhydre, puis concentrées sous flux d’azote inerte, jusqu’à un volume de 500 µL.

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gazeuse (Star 3400 CX) équipé d'un spectromètre de masse (Varian Saturn).

Deux types de colonnes capillaires ont été utilisées: une colonne de silice fondue recouverte de SPB1 (30 m × 0.25 mm × 1 m) et une colonne de revêtement avec BP-20 (50 m × 0.22 mm × 0.25 m). L'hélium a été utilisé comme gaz vecteur.

Le chromatographe en phase gazeuse Varian 1078 dont la température de l’injecteur est programmable a été utilisé pour injecter les échantillons. La température de l'injecteur a été initialement fixé à 180 º C pendant 0.3 min, puis la température a été augmentée jusqu'à 230°C à 1.7°C/min.

La température du four (SPB1) a été initialement fixée à 45°C pendant 1 min, puis augmentée à 200°C à 3°C/min et à 270°C pendant 10 minutes. Dans le cas de la colonne BP20, la température du four a été initialement mise à 45ºC pendant 1 min et ensuite augmentée jusqu'à 230ºC à 3ºC/min et maintenue à cette température pendant 30 min supplémentaires. L’injection a été réalisée en mode splitless.

7.3. Dosage des thiols volatils (3SH et 4MSP) par GC-MS

Deus méthodes d’extraction ont été utilisées pour l’analyse des thiols 3SH et 4MSP.

La méthode utilisée pour extraire les thiols volatils à partir d’un grand volume de vin, décrite par Tominaga et al. (1998b, 2000b), a été utilisée pour la quantification présentée dans le chapitre 3. La méthode utilisant un volume de 50 mL de vin (Tominaga & Dubourdieu, 2006) a été adoptée pour les analyses dont les résultats sont présentés dans le chapitre 4. Le changement de procédure a été due au fait que la méthode qui concerne l’extraction a partir de 500 mL de vin est longue et, en conséquence, peu pratique pour effectuer le dosage d’un grand nombre d’échantillons.

7.3.1. Extraction des thiols volatils : 500 mL de vin

Un volume de 500 mL de vin a été additionné de 2,5 nmol d’étalon interne (1-méthoxy-3-méthyl-3-butanethiol, 1,3,3-MMB) et extrait par du dichlorométhane (2 × 100 mL). Les phases organiques ont été ensuite rassemblées, centrifugées pendant 10 minutes à 4000 rpm, et séparées dans une ampoule à décanter. Les phases organiques ont été ensuite extraites (2 × 20 mL) avec une solution de p-hydroxymercuribenzote de sodium (p-HMB, 1 mM) dans un

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tampon Trizma base (0.2 M, pH 10).

Les adduits p-HMB/thiols sont fixés sur résine échangeuse d’anions (Dowex 1X2 ; 50-100 mesh) préalablement réactivée à l’aide de l’acide chlorhydrique (0.1 M).

La colonne a été alors lavée par 50 mL d’une solution tampon d’acétate de sodium (0.1 M, pH 7). Les thiols volatils ont été ensuite libérés par 60 mL d’une solution de cystéine (pH 7, 35 mM). L’éluat contenant les thiols volatils a été additionné de 500 µL d’acétate d’éthyle, puis extrait deux fois, sous agitation, au dichlorométhane (4 et 3 mL, 10 et 5 minutes, respectivement, à 750 rpm).

Les deux phases organiques ont été rassemblées et séchées au sulfate de sodium anhydre, puis concentrées sous flux d’azote inerte, jusqu’à 100 µL.

7.3.2. Extraction des thiols volatils : 50 mL de vin

Un volume de 50 mL de vin a été additionné de 1.2 nmol d’étalon interne (1,3,3-MMB) et 7.5 mL d’une solution d’acide p-hydroxymercuribenzoate de sodium (p-HMB) (2 mM). Le pH est ajusté à 7 avec une solution de soude (NaOH, 10 N). La complexation des thiols volatils avec le p-HMB s’est réalisée sous agitation magnétique à 600 rpm pendant 10 minutes.

Les adduits p-HMB/thiols ont été ensuite fixés sur résine échangeuse d’anions (Dowex 1X2 ; 50-100 mesh) préalablement réactivée à l’aide de l’acide chlorhydrique (0.1 M).

La colonne a été alors lavée par 50 mL d’une solution tampon d’acétate de sodium (0.1 M, pH 7). Les thiols volatils ont été ensuite libérés par 60 mL d’une solution de cystéine (pH 7, 35 mM). L’éluat contenant les thiols volatils a été additionné de 500 µL d’acétate d’éthyle, puis extrait deux fois, sous agitation, au dichlorométhane (4 et 3 mL, 10 et 5 minutes, respectivement, à 750 rpm).

Les deux phases organiques ont été rassemblées et séchées au sulfate de sodium anhydre, puis concentrées sous flux d’azote inerte, jusqu’à 25 µL.

7.3.3. Détermination colorimétrique de la concentration en thiols

Les courbes d’étalonnage ont été réalisées en déterminant la concentration en thiols à l’aide du coefficient d’extinction moléculaire (ε = 13600 M-1) du chromophore libéré par la réaction de combinaison d’une molécule thiol au DTNB, comme décrit par Ellman (1959).

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L’échantillon à doser est dilué dans une solution tampon phosphate (0.1 M, pH 8), puis additionné d’une solution tamponnée de l’acide 5,5’-dithiobis(2-nitrobenzoїque) (DTNB, 4 g/L). L’absorbance a été déterminée pour λ=412 nm et la concentration de l’échantillon a été ensuite calculée par la loi de Beer-Lambert.

7.4. Dosage de la MND par GC-MS

Cette méthode permet le dosage des dérivés C13-norisoprénoïdes et des lactones tels que la

β-damascenone, β-ionone, la γ-nonalactone et la 3-methyl-2,4-nonanedione. La méthode

utilisée pour l’extraction du sotolon est celle décrite par Pons et al. (2008).

Cent microlitres d’étalon interne (ethyl-4-acetylbenzoate) en solution alcoolique (1000 mg/L) et sont ajoutés à 100 mL de vin afin de favoriser la volatilisation des composés.

Le vin a été alors soumis à trois extractions liquide-liquide successives (10, 5 et 5 mL de dichlorométhane) sous agitation magnétique (10, 5 et 5 minutes) à 750 rpm.

Les phases organiques sont récupérées, assemblées, séchées au sulfate de sodium anhydre, puis concentrées sous flux d’azote inerte, jusqu’à un volume de 500 µL.

Les analyses de chromatographie en phase gazeuse couplée à un spectromètre de masse MS 4000 (GC-MS) ont été réalisées en utilisant un appareil GC 3400(Varian, USA). L’injection (2 µL) a été effectuée en mode split/splitless. Le temps d’ouverture de la vanne était de 0.8 minute et la pression en tête de colonne de 20 psi. Le gaz utilisé est l’hélium. Le spectromètre de masse, avec une température de la ligne de transfert de 220°C, a permis l’acquisition des spectres de masse en mode impact électronique (mode SIS, énergie d’ionisation : 70 eV).