Analyse comparative de processus opérationnels pour la RASP

Associações entre os resultados sorológicos e a classificação clínica dos animais de acordo com a área estudada foram mostradas na Tabela 12. Em área periurbana 73.8% dos cães com sorologia positiva para Leishmania através do rK39 foram classificados como assintomáticos, 11.9% oligossintomáticos e 14.3% polissintomáticos. Em áreas rurais o percentual de animais positivos assintomáticos foi de 81.8%, os demais cães positivos apresentaram-se polissintomáticos (18.2%). No CCZ identificou-se através do antígeno rK39 32.7% de assintomáticos, 36.6% de oligossintomáticos e 30.7% de polissintomáticos. A partir do antígeno rK39, não houve diferença

significativa durante a análise estatística entre a resposta sorológica e a classificação clínica em área periurbana (p=0.0869). Diferentemente, em ambientes rurais houve uma associação entre cães rK39 positivos e um quadro clínico polissintomático (p=0.0437), assim como no CCZ, os cães positivos oligossintomáticos foram significativamente mais prevalentes (p<0.0001).

Ao se utilizar o antígeno solúvel de Leishmania (SLA) observou-se no grupo dos soropositivos de área periurbana que 75.2% não apresentaram sinais sugestivos da infecção por Leishmania, 15.5% foram considerados oligossintomáticos e 9.3% polissintomáticos. Os cães positivos das áreas rurais de São Miguel estiveram assintomáticos em 90.8% dos casos, seguidos de 4.6% de oligossintomáticos e 4.6% de polissintomáticos. A partir dos resultados do ELISA, através do antígeno SLA nos cães do CCZ, 41.3% dos animais mostraram-se assintomáticos, 30.1% oligossintomáticos e 28.6% polissintomáticos (Tabela 12). Destas avaliações, o teste qui-quadrado estabeleceu associações entre cães positivos e polissintomáticos de área periurbana (p=0.0093) e cães sintomáticos do CCZ (p=0.0086); em meio rural não se observou associação significativa (p=0.7066).

Verificou-se, em área periurbana, que dos cães soropositivos 70.6% eram assintomáticos, 16.2% oligossintomáticos e 13.2% polissintomáticos. Em área rural, 87.5% dos cães foram classificados como assintomáticos, 6.3% oligossintomáticos e 6.2% polissintomáticos. No CCZ, os cães assintomáticos representaram 36.2% da população IgG1 positiva, os oligossintomáticos 30.8% e os polissintomáticos 33%. A aplicação do teste Qui-Quadrado permitiu o encontro de associações significativas entre os títulos de IgG1 anti-Leishmania positivos e a condição polissintomática nos cães de área periurbana (p=0.0164)

e do CCZ (p=0.0084), porém esta associação não se repetiu em meio rural (p=0.3580).

Dos cães que produziram títulos positivos da imunoglobulina IgG2 em área periurbana, 77.5% encontraram-se assintomáticos, 15% oligossintomáticos e 7.5% polissintomáticos. Nos resultados observados em área rural, os assintomáticos representaram 88.1% dos cães IgG2 positivos, enquanto os percentuais de oligossintomáticos e polissintomáticos foram 6.8% e 5.1%, respectivamente. A classificação clínica dos cães IgG2 positivos no CCZ identificou 42.9% de assintomáticos, 29.3% de oligossintomáticos e 27.8% de polissintomáticos (Tabela 12). As análises estatísticas através do teste Qui- Quadrado identificaram associações significativas entre cães IgG2 anti-

Leishmania positivos e a presença de sintomas sugestivos de LV nas áreas

Tabela 12: Associações entre as respostas sorológicas e a condição clínica dos cães

Teste População canina

Sorologia N Classificação Clínica (%) P(*) Qui- Quadrado Assinto mático Oligossinto mático Polissinto Mático rK39 Periurbana + 42 73.8% 11.9% 14.3% 0.0869 - 285 81.7% 13.7% 4.6% Rural + 11 81.8% 0.0% 18.2% 0.0437 - 86 94.2% 4.6% 1.2% CCZ + 101 32.7% 36.6% 30.7% <0.0001 - 45 73.3% 8.9% 17.8% SLA Periurbana + 161 75.2% 15.5% 9.3% 0.0093 - 166 86.1% 11.5% 2.4% Rural + 43 90.8% 4.6% 4.6% 0.7066 - 54 94.5% 3.7% 1.8% CCZ + 133 41.3% 30.1% 28.6% 0.0086 - 13 84.6% 7.7% 7.7% IgG1 Periurbana + 68 70.6% 16.2% 13.2% 0.0164 - 259 83.4% 12.7% 3.9% Rural + 32 87.5% 6.3% 6.2% 0.3580 - 65 95.4% 3.1% 1.5% CCZ + 94 36.2% 30.8% 33% 0.0084 - 52 58.3% 25.0% 16.7% IgG2 Periurbana + 226 77.5% 15.0% 7.5% 0.0318 - 101 88.1% 9.9% 2.0% Rural + 59 88.1% 6.8% 5.1% 0.0259 - 38 100.0% 0.0% 0.0% CCZ + 140 42.9% 29.3% 27.8% 0.0073 - 6 100.0% 0.0% 0.0%

O grau de associação entre a presença de sinais clínicos (cães sintomáticos) e o resultado dos testes sorológicos rK39, SLA, IgG1 e IgG2 em cada área de estudo foram mostrados nas tabelas 13, 14, 15 e 16. Na Tabela 13 observa-se que somente nos cães provenientes do CCZ existiu associação significativa entre o resultado da sorologia pelo antígeno rK39 e a presença de sinais clínicos, isto é, o risco de resultado positivo no teste rK39 em animais sintomáticos é 5.667 vezes o mesmo risco em animais assintomáticos provenientes do CCZ. Embora o resultado não tenha sido significativo para os cães das outras duas áreas avaliadas, o risco relativo varia na mesma direção, sugerindo que a presença de sinais clínicos triplica a chance de um resultado positivo através do rK39.

Tabela 13 – Previsibilidade dos resultados da sorologia através do antígeno rK39 a partir da classificação clínica dos cães das três áreas estudadas

Área K39 N Classificação Clínica p-

valor(*) Odds Ratio (**)

Intervalo 95% Conf.

Sintomático Assintomático Lim.

Inf Sup. Lim. Periurbana + 42 26.2% 73.8% 0.156 1.590 0.751 3.368 - 285 18.2% 81.8% - - - - Rural + 11 18.2% 81.8% 0.179 3.600 0.608 21.317 - 86 5.8% 94.2% - - - - CCZ + 101 67.3% 32.7% P<0.001 5.667 2.596 12.370 - 45 26.7% 73.3% - - - - <0.001 3.069 1.877 5.017 (*) Teste exato de Fisher unilateral;

(**) Estimativa de Mantel-Haenszel da Odds Ratio Comum;

Teste de homogeneidade das Odds-Ratios (Breslow-Day p=0.066)

Associações significativas entre as respostas sorológicas ao antígeno SLA e a presença de sinais clínicos ocorreram nos cães de área periurbana e do CCZ, isto é, a chance de se obter um resultado sorológico positivo através do antígeno SLA em cães sintomáticos de área periurbana e do CCZ é em

média 2.433 vezes maior em relação aos cães assintomáticos dessas mesmas áreas (Tabela 14).

Tabela 14 – Previsibilidade dos resultados da sorologia através do antígeno SLA a partir da classificação clínica dos cães das três áreas estudadas

Área SLA N Classificação Clínica p-

valor(*) Odds Ratio (**)

Intervalo 95% Conf.

Sintomático Assintomático Lim.

Inf Sup. Lim. Periurbana + 161 24.8% 75.2% .009 2.055 1.166 3.624 - 166 13.9% 86.1% - - - - Rural + 43 9.3% 90.7% .374 1.744 .369 8.247 - 54 5.6% 94.4% - - - - CCZ + 133 58.6% 41.4% .003 7.800 1.663 36.590 - 13 15.4% 84.6% - - - - p<0.001 2.433 1.484 3.988 (*) Teste exato de Fisher unilateral;

(**) Estimativa de Mantel-Haenszel da Odds Ratio Comum;

Teste de homogeneidade das Odds-Ratios (Breslow-Day p=0.232).

Títulos sorológicos positivos da subclasse de imunoglobulina IgG1 anti-

Leishmania estiveram associados significativamente com cães sintomáticos de

área periurbana e oriundos do CCZ. As chances de risco variaram no mesmo sentido e de forma homogênea (p=0.793) (Tabela 15). Segundo o teste exato de Fisher todas as associações foram significativas entre os resultados sorológicos da imunoglobulina IgG2 e a presença de sinais clínicos nos cães das áreas de estudo avaliadas. A razão de chances comum foi estimada em 3.100 com intervalo de confiança de 1.624 a 5.920 (Tabela 16).

Tabela 15 – Previsibilidade dos resultados da sorologia da subclasse IgG1 a partir da classificação clínica dos cães das três áreas estudadas

Área IgG1 N Classificação Clínica p-

valor(*) Odds-Ratio (**)

Intervalo 95% Conf.

Sintomático Assintomático Lim.

Inf Sup. Lim. Periurbana + 68 29.4% 70.6% .016 2.093 1.131 3.875 - 259 16.6% 83.4% - - - - Rural + 32 12.5% 87.5% .160 2.952 .619 14.079 - 65 4.6% 95.4% - - - - CCZ + 94 63.8% 36.2% .003 2.824 1.403 5.682 - 52 38.5% 61.5% - - - - p<0.001 2.443 1.572 3.797 (*) Teste exato de Fisher unilateral;

(**) Estimativa de Mantel-Haenszel da Odds Ratio Comum;

Teste de homogeneidade das Odds-Ratios (Breslow-Day p=0.793).

Tabela 16 – Previsibilidade dos resultados da sorologia da subclasse IgG2 a partir da classificação clínica dos cães das três áreas estudadas

Área IgG2 N Classificação Clínica p-

valor(*) Odds-Ratio (**)

Intervalo 95% Conf. Sintomático Assintomático Lim.

Inf Sup. Lim. Periurbana + 226 22.6% 77.4% .015 2.161 1.097 4.261 - 101 11.9% 88.1% - - - - Rural + 59 11.9% 88.1% .027 1.135 1.033 1.246 - 38 .0% 100.0% - - - - CCZ + 140 57.1% 42.9% .007 2.333 1.927 2.825 - 6 .0% 100.0% - - - - 0.001 3.100 1.624 5.920 (*) Teste exato de Fisher unilateral;

(**)Estimativa de Mantel-Haenszel da Odds Ratio Comum;

Teste de homogeneidade das Odds-Ratios (Breslow-Day p=0.072)

Outras associações foram estabelecidas entre os resultados sorológicos e a classificação clínica dos animais, porém, nestes casos, a área de estudo foi incluída como variável independente nas análises a fim de extrair seu efeito. Para os animais rK39 positivos, a razão oligossintomáticos/assintomáticos foi 2.53 vezes a mesma razão entre os cães rK39 negativos (p=0.002), e a razão

polissintomáticos/assintomáticos foi 3.31 vezes a mesma razão entre os rK39 negativos (p<0.0001), demonstrando que os animais diagnosticados positivos pelo ELISA/rK39 apresentaram chances mais elevadas de desenvolver sinais clínicos quando comparados aos cães rK39 negativos (Figura 9). No grupo de cães positivos pelo ELISA/SLA, a razão oligossintomáticos/assintomáticos foi de 1.87 vezes a mesma razão entre os SLA negativos (p=0.029), enquanto que a razão polissintomáticos/assintomáticos mostrou 4.49 vezes mais chances dos cães se apresentarem polissintomáticos em relação à mesma razão nos soronegativos (p<0.0001) (Figura 10).

Figura 9: Associação entre a classificação clínica e o resultado do teste ELISA/rK39

Figura 10: Associação entre a classificação clínica e o resultado do teste ELISA/SLA

Cães com títulos sorológicos positivos de IgG1 anti-Leishmania tiveram 1.84 vezes mais chance de se encontrarem oligossintomáticos (p=0.021) e 3.78 vezes mais chance de estarem polissintomáticos (p<0.0001), quando comparados aos cães com títulos sorológicos negativos da imunoglobulina IgG1 (Figura 11). Por fim, os cães que expressaram respostas sorológicas positivas da IgG2 anti-Leishmania mostraram 2.42 vezes mais chance de se encontrarem oligossintomáticos (p=0.016) e 7.03 vezes mais chance de desenvolverem uma condição polissintomática em relação aos cães que produziram sorologia negativa para IgG2 (p=0.008) (Figura 12).

Figura 11: Associação entre a classificação clínica e o resultado do teste ELISA/IgG1 anti-Leishmania

Figura 12: Associação entre a classificação clínica e o resultado do teste ELISA/IgG2 anti-Leishmania

A partir das associações entre sorologia anti-Leishmania e a classificação clínica dos cães, constatou-se que os animais soropositivos apresentaram chances mais elevadas de desenvolverem sinais clínicos quando comparados aos cães soronegativos através dos dois antígenos testados.

Estes resultados não confirmam o antígeno rK39 como marcador de doença ativa na população canina, considerando que animais SLA positivos também demonstraram maior associação com a presença de sintomas (BADARO et al., 1996; BISUGO et al., 2007; IQBAL et al., 2002; METTLER et al., 2005; OLIVEIRA et al., 2010; PORROZZI et al., 2007; REITHINGER et al., 2002; RHALEM et al., 1999).

Associações entre respostas sorológicas das subclasses IgG1 e IgG2 anti-Leishmania e a classificação clínica dos cães sugerem uma ausência de polarização dos isotipos testados quando relacionados à condição clínica do animal, observando-se que as frequências de cães sintomáticos foram significativamente maiores nos grupos de cães soropositivos para as subclasses IgG1 e IgG2 em relação às mesmas associações para os cães soronegativos, reforçando que animais soropositivos tiveram mais chances de serem classificados como sintomáticos.

De acordo com a literatura, as correlações entre respostas das subclasses de IgG em cães sintomáticos e assintomáticos foram discordantes até o momento: enquanto alguns estudos mostraram prevalência de IgG2 quando comparados a IgG1 em cães assintomáticos (CARRILLO et al., 2007; CARRILLO; MORENO, 2009; DEPLAZES et al., 1995; INIESTA; GALLEGO; PORTUS, 2005; NIETO et al., 1999; RAMOS et al., 2008), outros trabalhos revelaram predominância de IgG2 em associação com a doença clínica (ALMEIDA et al., 2005b; BOURDOISEAU et al., 1997; CARDOSO et al., 2007; CAVALIERO et al., 1999; FERNANDEZ-PEREZ et al., 2003; INIESTA et al., 2002; INIESTA; GALLEGO; PORTUS, 2007; LEANDRO et al., 2001; OLIVEIRA et al., 2009; REIS et al., 2006; SOLANO-GALLEGO et al., 2001).

Elevações de todas as subclasses de IgG em cães infectados apresentando doença clínica foram identificadas (CARSON et al., 2010; OLIVEIRA et al., 2009; QUINNELL et al., 2003a), corroborando com os achados deste trabalho. Em humanos com diagnóstico confirmado de LV foi possível identificar uma elevação geral nos títulos das quatro subclasses de IgG, com ausência de polarização entre as subclasses, o que tornaria as respostas humorais humana e canina equivalentes (CARSON et al., 2010; ELASSAD et al., 1994; OLIVEIRA et al., 2009; QUINNELL et al., 2003a; STRAUSS-AYALI; BANETH; JAFFE, 2007). Nessa perspectiva, as respostas de subclasses de IgG na leishmaniose canina poderiam ser mais semelhantes ao modelo humano do que ao modelo murino.

Em última análise, a interpretação do perfil de subclasses de IgG em cães infectados por Leishmania é pouco clara, incerta e controversa atualmente, a qual poderia estar relacionada, dentre outros fatores, com os tipos de anticorpos secundários e os protocolos utilizados na avaliação da resposta imunológica; às diferenças na sensibilidade das técnicas usadas, principalmente no que diz respeito à diluição dos soros e concentração dos conjugados; com o pequeno número de amostras de cães examinados em alguns estudos ou às diferenças nas vias de infecção experimental canina (ALVAR et al., 2004; INIESTA; GALLEGO; PORTUS, 2007; REIS et al., 2006). Além disso, devem-se considerar outros fatores como a grande variação individual entre os cães e a complexidade das respostas imunológicas durante o curso natural da infecção (INIESTA; GALLEGO; PORTUS, 2007; MORENO; ALVAR, 2002). Por fim, é preciso ponderar que embora as populações estudadas sejam de áreas endêmicas para LV canina no Brasil, essas áreas

não são geograficamente idênticas, o que pode contribuir para a falta de consistência entre os achados.

Uma das principais razões para os resultados divergentes, no que diz respeito ao perfil de subclasses de IgG, seria a menor especificidade dos anticorpos policlonais disponíveis comercialmente e usados nos estudos para determinar as subclasses de imunoglobulinas, tendo em vista que estes anticorpos policlonais poderiam apresentar reações cruzadas com os quatro isotipos de IgG canina purificadas (DAY, 2007). Diante deste conflito, sugeriu- se que uma maior especificidade seria encontrada utilizando um painel de anticorpos monoclonais (MAZZA et al., 1994b; MAZZA et al., 1994a). Entretanto, poucos estudos têm utilizado anticorpos monoclonais para mensurar subclasses de IgG em cães com LV em regiões endêmicas do Brasil. Ainda, os resultados de tais estudos indicam que os títulos de IgG1 e IgG2, medidos por ambos os anticorpos monoclonais e policlonais, foram maiores em cães clinicamente sintomáticos quando comparados aos assintomáticos, não diferindo daqueles encontrados anteriormente através dos anticorpos policlonais (CARSON et al., 2010; DAY, 2007; QUINNELL et al., 2003a).

Os resultados decorrentes da avaliação clínica dos cães apontaram um grande percentual de cães assintomáticos entre os cães soropositivos, especialmente em áreas rurais. Neste aspecto, sabe-se que a infecção por

Leishmania frequentemente não coincide com a doença clínica (MIRO et al.,

2008), e os pesquisadores presumem que grande parte dos cães em áreas endêmicas esteja exposta à infecção por Leishmania (BANETH; AROCH, 2008), porém o resultado da infecção é muito variável. Enquanto cães que mostram progressão da doença representam um terço dos animais

soropositivos (FISA et al., 1999), um alto percentual de animais infectados permanece assintomático ou desenvolve poucos sintomas que resolvem espontaneamente (CARDOSO et al., 2007; CARRILLO ; MORENO, 2009).

Relatos sobre frequência de cães soropositivos que não apresentaram nenhum sinal clínico sugestivo de LV foram descritos na literatura, como no estudo realizado na Bahia (OLIVEIRA et al., 2010), revelando um percentual acima de 50% de cães soropositivos e assintomáticos para LV. No Rio de Janeiro, foi encontrada a presença de 50 a 70% de cães assintomáticos infectantes para flebotomíneos (MADEIRA et al., 2004). Da mesma forma, em Cuiabá-MT, foi descrito um percentual de 56.2% de cães assintomáticos (ALMEIDA et al., 2009). Na região metropolitana de Belo Horizonte, 68% dos cães soropositivos foram diagnosticados com ausência de sintomas (SILVA et al., 2001). No Estado do Ceará, obteve-se 86% de infecção inaparente (CUNHA; ALENCAR; NDRADE, 1963).

O papel dos cães assintomáticos no ciclo de transmissão da LV até o momento tem sido confirmado por diversos autores que identificaram animais sintomáticos e assintomáticos apresentando alto parasitismo cutâneo por

Leishmania sendo, portanto, infectantes para o vetor (ABRANCHES et al.,

1991; DE, V et al., 2010; GRADONI et al., 1987; MOLINA et al., 1994). Outros autores observaram pouca diferença na infecção do vetor entre cães sintomáticos, oligossintomáticos e polissintomáticos (BAVIA et al., 2005; REITHINGER et al., 2002), porém, um estudo realizado na Bahia (ALMEIDA et al., 2005b) afirmou que cães oligossintomáticos e polissintomáticos apresentaram maior potencial de infecção para flebotomíneos por

apresentarem um parasitismo disseminado em vários órgãos e também maior concentração de amastigotas na pele (SILVA et al., 2005).

Torna-se importante ressaltar ainda a existência de animais soropositivos assintomáticos exibindo títulos de anticorpos em um nível limítrofe, nos quais artefatos e reações cruzadas são comumente encontrados (ABRANCHES et al., 1991; FISA et al., 1999; LANOTTE et al., 1979; PORTÚS et al., 1987; SIDERIS et al., 1999). Estudos longitudinais têm demonstrado que, em muitos casos, os títulos de anticorpos permanecem nesse nível limítrofe durante anos sem o desenvolvimento da doença (FISA et al., 1991; LANOTTE et al., 1979). Assim, técnicas sorológicas convencionais realizadas durante os inquéritos epidemiológicos muitas vezes não conseguem distinguir entre cães infectados e não-infectados quando baixos níveis de anticorpos são detectados (ASHFORD et al., 1995; INIESTA et al., 2002; METTLER et al., 2005), fazendo com que animais infectados, que não foram diagnosticados através da sorologia e consequentemente não foram retirados para eutanásia pela Secretaria Municipal de Saúde, permaneçam por longos períodos nestas áreas.

Portanto a importância epidemiológica da infecção canina por

Leishmania se deve, principalmente, pela existência de alta freqüência de cães

assintomáticos, agindo como fontes de infecção para o vetor e contribuindo para manutenção da endemia em áreas urbanas e rurais (INIESTA; GALLEGO; PORTUS, 2007; METTLER et al., 2005; REITHINGER et al., 2002). Em consonância, a elevada média de infecção assintomática identificada em humanos no RN mostra que a LV é somente o menor componente neste processo, e que a infecção assintomática é mais freqüente, tornando-se motivo

de preocupação em virtude da endemização da LV em grandes áreas peri- metropolitanas do Brasil (NASCIMENTO et al., 2008).

5.5. Estudo observacional longitudinal dos cães de áreas periurbana e