L’analyse commune du profil des acides aminés et des acylcarnitines par la MS/MS pour un test de dépistage néonatal de première ligne

L’utilisation de la MS/MS pour le dépistage néonatal des EIM repose sur l’analyse de deux classes de métabolites, les acides aminés et les acylcarnitines qui produisent chacun, après fragmentation, des ions fi ls caractéristiques. Comme mentionné précédemment, l’analyse simultanée des profi ls d’acides aminés et d’acylcarnitines à partir d’échantillons de sang séché est possible depuis 1995. En réalité, cette méthode consiste en une alternance à grande vitesse de trois modes de balayage [Garg et Dasouki, 2006; Cheillan et al., 2004; Carpenter et Wiley, 2002; Chace et al., 2002; Rashed et al., 1995]. Le tableau 10 résume et l’annexe G (paragraphe G3) détaille l’ensemble des étapes requises : la préparation des échantillons comportant l’extraction des métabolites d’intérêt à partir des échantillons de sang séché, leur butylation et leur reconstitution en solution; l’injection d’aliquotes de cette solution dans l’appareil afi n qu’ils atteignent la source d’ionisation; le processus d’ionisation par pression atmosphérique au moyen de l’ESI; le mode d’analyse utilisé pour la production simultanée des profi ls d’acides

aminés et d’acylcarnitines; et enfi n la détection et la production des résultats. La

littérature révèle que nombre de particularités techniques relatives aux différentes étapes de l’analyse, sont susceptibles d’infl uer sur la performance de la MS/MS [CDC, 2001].

Or, les publications récentes révèlent aussi une variabilité assez importante sur le plan des choix technologiques d’un centre de dépistage néonatal à l’autre. Cette variabilité et ses conséquences sur l’interprétation des données disponibles seront discutées au chapitre 6 portant sur la performance de la MS/MS. Toutefois, il importe d’examiner dès à présent les facteurs les plus importants qui infl uencent la performance de la MS/MS.

TABLEAU 10

Principales étapes de l’analyse concomitante par la MS/MS du profil des acides aminés et des acylcarnitines dans le cadre du dépistage néonatal

La préparation de l’échantillon

1. Extraction des acides aminés et des acylcarnitines

Poinçonnage des cartes de Guthrie et chargement sur plaques multipuits Élution dans une solution contenant du méthanol et des standards internes Incubation et agitation pendant l’extraction

Transfert de la solution contenant les extraits vers une 2^e plaque multipuits Élimination du méthanol en excès par évaporation

2. Butylation

Ajout d’acide butanolique aux extraits

Incubation à une température favorisant la conversion des métabolites en esters butyliques

Élimination de l’acide butanolique en excès par évaporation Reconstitution en solution

L’analyse MS/MS

1. Prélèvement automatique d’aliquotes et injection dans l’appareil à débit programmé 2. Processus d’ionisation par ESI

3. Passage dans l’analyseur programmé pour réaliser de façon séquentielle trois modes de balayage

Mode de balayage d’ions parents à ratio m/z de 85 Da pour l’analyse des acylcarnitines Mode de balayage en perte de fragment neutre de 102 Da pour l’analyse des acides aminés acides et neutres

Mode de balayage en perte de fragment neutre de 119 Da pour les acides aminés basiques

4. Détection et production des résultats

Détection du signal correspondant à la gamme des ratios m/z sélectionnée Quantifi cation par référence aux standards internes

Conversion par ordinateur des signaux en spectre de masse

Comparaison des taux de métabolites et des ratios de métabolites aux valeurs limites préétablies

Étant donné que l’analyse par la MS/MS est quantitative (semi-quantitative pour une minorité de métabolites), les résultats dépendent de la quantité de métabolites extraits de l’échantillon de sang séché. La quantité de sang à partir de laquelle se fait l’extraction dépend de l’hématocrite, du diamètre du poinçon et des conditions de prélèvement et de transport de l’échantillon sanguin [Holub et al., 2006; Lindner et al., 2006; Al-Dirbashi et al., 2005; Nagy et al., 2003; Santer et al., 2003]. Le processus d’extraction vise à séparer les métabolites d’intérêt des protéines et des sels présents dans le sang qui pourraient interférer avec la suite de l’analyse. Seule une extraction au méthanol permet le mélange subséquent des métabolites aux standards internes qui sont disponibles en solution

seulement. Des analogues isotopiques³⁶ correspondants aux acylcarnitines et acides aminés d’intérêt sont ajoutés comme marqueurs de référence pour la quantifi cation [Cheillan et al., 2004; Fearing et Levy, 2003; Chace et al., 2002; Clarke, 2002]. Ce processus d’extraction serait généralement effi cient à 90 % mais cela peut varier selon les métabolites et selon les détails du protocole technique, en particulier à l’étape de dilution isotopique et à la durée et température de l’incubation [Chace et al., 2003a].

La butylation convertit les métabolites et les étalons standards en esters butyliques [Nagy et al., 2003]. Ce processus stabilise les composés organiques en des formes volatiles à température appropriée pour la MS/MS [McCandless, 2004; Carreiro-Lewandowski, 2002; Chace et al., 2002]. De plus, la butylation simplifi e l’étape suivante car elle rend le processus d’ionisation similaire pour les acides aminés basiques, acides et neutres [Casetta et al., 2000]. Lorsqu’on utilisait la FAB/FIB-MS/MS comme processus d’ionisation, la butylation était indispensable. Cependant, depuis l’avènement de la ESI-MS/MS plusieurs acides aminés et acylcarnitines peuvent être analysés sans

butylation ce qui pourrait être avantageux car cette étape présente certains inconvénients qui sont discutés plus loin [Casetta et al., 2000]. En fait, les travaux s’intensifi ent pour mettre au point des protocoles analytiques de MS/MS qui excluent l’étape de butylation [Garg et Dasouki, 2006; Schulze et al., 2003b; Trinh et al., 2003; Qu et al., 2002]. Toutefois, ces protocoles nécessitent encore une optimisation à tous les niveaux analytiques et une comparaison rigoureuse de la performance des approches avec et sans butylation [Garg et Dasouki, 2006; Schulze et al., 2003b; Trinh et al., 2003; Qu et al., 2002].

Une fois préparé, l’échantillon est injecté dans la machine où il subit en premier lieu l’ionisation des molécules. L’analyse procède ensuite selon trois modes réalisés de façon séquentielle à grande vitesse [Cheillan et al., 2004; Carpenter et Wiley, 2002; Chace et al., 2002; Rashed et al., 1995]. Le mode de balayage d’ions parents à m/z 85 Da permet l’analyse des acylcarnitines dont les esters butylés produisent tous un ion fragment commun de m/z de 85 Dalton (Da). Les ions parents ayant produit cet ion fragment sont sélectionnés, de sorte que tous les acylcarnitines dont la taille varie entre deux et 20 carbones peuvent être quantifi és [Casetta et al., 2000]. La carnitine libre, quant à elle, produit un fragment de 85Da et un de 103Da, ce dernier ne pouvant toutefois être détecté qu’après butylation.

Le mode de balayage en perte d’un fragment neutre de 102Da est utilisé pour l’analyse des acides aminés acides et neutres³⁷ [Cheillan et al., 2004; Carpenter et Wiley, 2002;

Chace et al., 2002; Rashed et al., 1995]. Le fragment de 102 Da correspond à une molécule de butylformate qui s’est formée lors de l’étape de butylation à partir d’un groupement d’acide formique commun à tous ces acides aminés [Chace et al., 2002].

Le dosage quantitatif de tous ces métabolites ne peut cependant pas être réalisé car il est impossible de séparer les acides aminés isomasses. C’est le cas de la leucine, l’isoleucine et l’allo-isoleucine pour lesquelles seule la quantité totale des trois acides aminés peut être estimée, ce qui correspond à un dosage semi-quantitatif. De plus, puisque la butylation transforme la glutamine et l’asparagine, respectivement, en acide glutamique et en acide aspartique, la MS/MS ne quantifi e que la quantité totale de l’acide aminé et de son dérivé (glutamine et acide glutamique, d’une part; asparagine et acide aspartique, d’autre part). Il est également important de noter que la glycine produit un signal très faible pouvant échapper à la détection, de sorte qu’on préconise de la doser

36. Les standards internes, marqués au 2H ou au 13C par exemple, sont ajoutés en solution stable et à des concentrations connues.

37. Parmi ceux-ci fi gurent les acides aminés suivants: alanine, sérine, proline, valine, glutamine, glycine, leucine, isoleucine, alloleucine, méthionine, histidine, phénylalanine, tyrosine, asparagine.

individuellement en mode MRM. Enfi n, un troisième mode de balayage, en perte d’un fragment neutre de 119 Da, est requis pour les acides aminés basiques, soit la citrulline, la lysine, l’arginine et l’ornithine [Cheillan et al., 2004; Carpenter et Wiley, 2002; Chace et al., 2002; Rashed et al., 1995].

Les étapes décrites ci-dessus correspondent à une utilisation de la MS/MS en première ligne pour un dépistage néonatal non sélectif visant à détecter le plus possible

d’anomalies métaboliques liées au métabolisme des acides aminés et des acylcarnitines.

Plus d’une trentaine d’erreurs innées du métabolisme des acides aminés, des acides gras et des acides organiques sont dépistables par une telle approche. Le tableau 11 regroupe les EIM les plus souvent citées dans la littérature ainsi que les métabolites qui sont dosés par la MS/MS pour le dépistage de chacune d’entre elles. Il est toutefois possible de suivre la procédure décrite ci-dessus en mode MRM pour une analyse ciblée de certains acides aminés et (ou) acylcarnitines pour les fi ns d’un dépistage sélectif de l’une ou l’autre des EIM listées dans le tableau 11 [Dooley, 2003; Elgstoen et al., 2001].

La littérature décrit également d’autres types de protocoles analytiques MS/MS

spécifi ques à une EIM utilisés en première ou en deuxième ligne pour le dépistage ciblé de maladies individuelles ne pouvant être détectées au moyen du profi l commun. Nous détaillons dans le prochain paragraphe un exemple de profi l analytique spécifi que, soit celui ciblant le dosage de la succinylacétone, vu son application possible au dépistage néonatal de la TH1, une maladie dépistée au Québec compte tenu de son incidence élevée surtout au Saguenay Lac-St-Jean. D’autres exemples de profi ls analytiques MS/MS spécifi ques à une EIM et applicables à un test de dépistage de première ou deuxième ligne sont décrits dans l’annexe H.

TABLEAU 11

Erreurs innées du métabolisme dépistables par la MS/MS sur la base de profils analytiques établis pour les acides aminés et les acylcarnitines [CDC, 2001]

ERREUR INNÉE DU MÉTABOLISME (ABRÉVIATION DU NOM) MÉTABOLITE Aminoacidopathies

Phénylcétonurie et hyperphénylalaninémie (PCU) Tyrosinémie héréditaire de type 1 (TH1)

Homocystinurie

Maladie du sirop d’érable ou Leucinose (MSUD)

Phénylalanine Tyrosine Methionine

Leucine, Isoleucine, Valine Troubles du cycle de l’urée

Arginémie ou défi cit en arginase (ARG) Défi cit en arginosuccinate lyase (ASL)

Citrullinémie ou défi cit en arginosuccinate synthétase (ASS) Hyperméthioninémie

Arginine Citrulline Citrulline Méthionine Défi cit de la béta-oxydation des acides gras

Défi cit en carnitine/acylcarnitine translocase (CAT) Défi cit en carnitine palmitoyl transférase de type I (CPTI) Défi cit en carnitine palmitoyl transférase de type II (CPTII) Acidémie glutarique de type II (GAII)

Défi cit en acyl-CoA déshydrogénase des acides gras à très longues chaînes (VLCADD)

Défi cit en 3-hydroxy acyl-CoA déshydrogénase des acides gras à lon-gues chaînes ou en protéine trifonctionnelle mitochondriale (LCHADD) Défi cit en acyl-CoA déshydrogénase des acides gras à chaînes moyen-nes (MCADD)

Défi cit en acyl-CoA déshydrogénase des acides gras à chaînes courtes (SCADD)

Défi cit en 3-méthylcrotonyl-coA carboxylase (3-MCC) Défi cit en 3-hydroxy-3-méthylglutaryl-coA lyase (HMG)

C3