Amplification : l’amplification est assurée par l’ADN polymérase et grâce à

l’utilisation de l’enzyme AmpErase® et de déoxyuridine triphosphate. L’AmpRase reconnait et catalyse la destruction des brins d’ADN contenant de la désoxyuridine mais non pas le brin contenant de la désoxythymidine. Le thérmocycleur des analyseurs COBAS TaqMAn® chauffe le mélange réactionnel afin de dénaturer l’hybride ARN :cADN et d’exposer les séquences cibles de l’amorce spécifique. Pendant que le mélange refroidit les amorces s’hybrident à l’ADN cible. L’analyseur COBAS TaqMan répète automatiquement cette opération pendant un nombre défini de cycles, chaque cycle doublant effectivement la quantité d’amplicons ADN.

4.

détection en temps réel de l’accumulation des produits de la PCR par la mesure de l’intensité de l’émission de fluorophores rapporteurs libérés durant la procédure d’amplification. La fluorescence s’opérant au moment où le fluorophore rapporteur et le fluorophore quencher se séparent et sont libérés lors de l’extension pendant de la transcription-amplification (voire principe de la PCR en temps réel) ;

Les deux appareils sont gérés par un ordinateur équipé d’un logiciel simplifiant le travail des différentes étapes : AMPLILINK^® 3.0.

 Résultat :

Plus le titre du VIH-1 d’un échantillon est élevé, plus tôt la fluorescence du fluorophore rapporteur de la sonde VIH-1 dépasse le niveau de fluorescence de base. La concentration est ajustée en conséquence dans les échantillons. Et l’appareil donne la quantité de charge virale calculé sur le maximum (plateau) de la courbe de l’évolution de la charge virale du patient sur fiche logarithmique (3.7E+5copies/mL dans notre exemple ; voir Fig. 27).

Figure 27. Exemple d’une fiche logarithmique* des résultats de la Charge virale VIH-1

-*(log 10 = copies/mL)

- La courbe en rouge représente l’évolution de la charge virale du patient (Target) et celle en bleu le standard de quantification interne (QS)

II.2.4. Test de mesure du taux des CD4

La détermination du taux de CD4 par la technique COULTER EPIC XLTM se fait grâce à une méthode dite directe faisant intervenir de fluorosphères « Flow-Count (sous forme de suspension de billes fluorescentes) » permettant la détermination directe des valeurs absolues et des pourcentages des populations lymphocytaires et des sous-populations dans le sang périphérique.

 Principe

L’utilisation du Flow-Count Fluorospheres (méthode directe) est une alternative à la méthode standard (indirecte) de calcul des valeurs absolues et fournit cette mesure en utilisant directement la plate-forme unique d’analyse d’immunophénotypage cytométrique en flux. Lorsque les volumes de l’échantillon biologique et de Flow-Count Fluorospheres sont identiques, un rapport entre le nombre de cellules de l’échantillon et les fluorosphères est établi. Les cellules d’intérêt et les fluorosphères sont ensuite comptées sur EPICS XL/XL-MCL.

Puisque la concentration de fluorosphères est connue, la valeur absolue des cellules peut être déterminée grâce à la formule suivante :

Valeur Absolue (Cellules/μL)=(Nombre Total de Cellules Comptées) x Fluorospheres total testés Fluorosphères total comptées

 Réactifs

Les Flow-Count Fluorospheres se composent de fluorosphères en polystyrène de 10 μm (diamètre nominal) en suspension dans un milieu aqueux contenant un surfactant et du formaldéhyde à 1 %. Chaque fluorosphère contient un marquage présentant une plage d’émission de fluorescence de 525 nm à 700 nm lorsqu’il est excité à 488 nm.

 Réalisation du test *Préparation des échantillons:

Les fluorosphères Flow-Count sont utilisées directement, telles quelles, sans dilution. Un mélange adéquat (vortexer 10 à 12 secondes) est néanmoins nécessaire avant pipetage dans le flacon. Les échantillons préparés avec ajout de Flow-Count

*Analyses hématologiques:

Les prélèvements sanguins ont été réalisés sur des tubes EDTA. Ils sont conservés à température ambiante et acheminés le plus rapidement possible au laboratoire de virologique. La numération sanguine est faite sur le BECKMAN-COULTER.

La valeur absolue des leucocytes donnée par l’automate est utilisée ensuite pour le calcul des valeurs absolues des sous-populations lymphocytaires séparées en cytométrie en flux. Une formule leucocytaire est systématiquement faite pour vérifier le taux de lymphocytes périphériques.

* Analyse cytométriques :

Pour les analyses en cytométrie en flux nous avons utilisé un cytomètre EPICS XL (BECKMAN-COULTER) avec un laser Argon (Excitation à 488 nm).

Pour réaliser un double marquage nous avons utilisé les opticlones (BECKMAN COULTER) contenant en même temps deux anticorps monoclonaux directement marqués, l’un à la fluorescéine (FITC), l’autre à la phycoérythrine (PE).

La technique utilisée est la méthode de l’immunofluorescence directe : après lyse des globules rouges par une solution hypotonique, un volume de 20µl de chaque anticorps est ajouté à 100 µl de sang total ajusté à 5000/mm3, puis incubé pendant 20 minutes à l’obscurité et à 4°C. Une fois l’incubation terminée. Les cellules sont prêtes à l’analyse après passage dans l’automate IMMUNOPREP qui permet de faire automatiquement une lyse des globules rouges.

Le panel utilisé pour ces bilans immunitaires est l’un des panels recommandés par le CDC (Centers for Disease Control) ⁹⁸. Les cellules T sont définies par l’expression du CD3. Pour les sous-populations lymphocytaires T, seules les cellules doublement marquées sont considérées comme positives, c’est-à-dire les cellules CD3/CD4+ pour les cellules T4 et les cellules les CD3+CD8 pour les cellules T8.

 Etapes de cytométrie en flux :

2. Vortexer Flow-Count Fluorospheres pendant 10 à 12 secondes, tout en évitant tout mélange excessif pour minimiser la formation de bulles d’air.

3. Ajouter 100 μl de Flow-Count Fluorospheres dans le tube

4. Vortexer le tube à 50 % de sa hauteur pendant 5 secondes. Vortexer de nouveau immédiatement avant l’analyse en cytométrie en flux.

5. Vérifier que le cytomètre en flux est correctement aligné et standardisé pour la diffraction laser et l’intensité de fluorescence, et que la compensation de couleur est ajustée.

6. Créer un histogramme bi-paramètrique à deux paramètres puis tracer un contour d’intérêt rectiligne autour de Flow-Count Fluorospheres et le nommer sous l’appellation “CAL”.