I. INTRODUCTION
I.2.2 Altération de l’axe CXCL12/CXCR4 et Mutations de CXCR4
A. CXCL12 et son récepteur CXCR4
Les chémokines sont de petites cytokines dotées d’une activité chimiotactique. Leur profil de sécrétion gouverne le trafic cellulaire et le recrutement de cellules effectrices à leur site d’action (3). CXCL12 ou SDF1 (Stromal cell –derived factor-1) est une CXC chimiokine (groupe α) produite de façon constitutive par les cellules stromales de la moelle osseuse (3, 271). CXCR4 ou CD184 est un récepteur membranaire qui a pour unique ligand CXCL12 (3). CXCR4 a été initialement décrit comme le corécepteur avec le CD4 du virus de l’immunodéficience humaine 1 (VIH) (316).
Le gène codant pour CXCR4 se situe sur le chromosome 2 en q21 (53, 316). Sa séquence comprend deux exons séparés par un intron. Le premier exon code pour les 5 premiers acides aminés et la région 5’UTR, le second pour les 247 acides aminés et la région 3’ UTR. La protéine comprend 352 acides aminés et est constituée d’un domaine extracytoplasmique comprenant le domaine N terminal et 3 boucles extracellulaires (ECL1, 2 et 3), de 7 domaines transmembranaires et d’un domaine intracytoplasmique formé de 3 boucles intracellulaires et de l’extrémité C terminale (ICL, 1,2 et 3) (5, 271, 316).
CXCR4 est un récepteur couplé aux protéines G, exprimé de façon ubiquitaire sur des cellules normales du système hématopoiétique. Un équilibre dynamique existe entre le pool membranaire et intracytoplasmique de CXCR4 (90). Une relation exclusive avec CXCL12 avait été évoquée sur la base des phénotypes comparables des souris invalidées pour l’un ou l’autre gène (213, 331). Un nouveau récepteur pour CXCL12 a été ensuite identifié, CXCR7 ou ACKR3 (91).
Sur le plan fonctionnel, l’interaction de CXCL12 avec CXCR4 induit un changement de conformation de CXCR4 déclenchant l’activation des protéines G et la mobilisation d’effecteurs intracellulaires impliqués dans différents processus cellulaire (Figure 5). L’activation des différentes voies de signalisation associées à CXCR4 telles que PI3K/mTOR, Ras ou MAPK/ERk induit une
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réponse en terme de différenciation, de prolifération cellulaire, de survie cellulaire et production de médiateurs solubles comme CCL3 ou CCL4 (3, 45, 61, 69, 209). L’activation de petites protéines G des familles Rac, Rho et Ras contribuent à la réponse chimiotactique en conduisant à la polymérisation de l’actine, au réarrangement du cytosquelette, à l’activation d’intégrines et la formation d’uropodes. Après l’interaction de CXCL12 avec CXCR4, un système de rétrocontrôle négatif appelé désensibilisation est alors rapidement initié. Il débute par la phosphorylation de différents acides aminés localisés dans le domaine C terminal intracellulaire (C ter) par des kinases spécifiques, les GRK (G protein-coupled receptor kinases) (3, 271). Des études par troncation du domaine C terminal de CXCR4 ont caractérisé les sites de régulation du récepteur : 3 thréonines et 15 sérines sont pour la plupart phosphorylées et contribuent activement au cycle d’activité du récepteur. La sérine en position 338 constitue un élément clé dans ce processus (5, 48). Des protéines adaptatrices, les β arrestines, sont alors recrutées et empêchent le couplage de CXCR4 à une nouvelle protéine G et la connection du récepteur à de nouvelles voies de signalisation gouvernant en particulier l’endocytose du récepteur (163). Des modifications post traductionnelles de type ubiquitination s’opèrent alors ce qui oriente CXCR4 vers un processus de dégradation lysosomale (189). Toutefois, il est à noter, qu’une faible proportion du récepteur internalisé peut être directement recyclée à la membrane (289). Cette internalisation rapide du complexe, qui est donc dépendante de l’état de phosphorylation de la région C terminale de CXCR4, se traduit par une diminution du niveau d’expression membranaire de CXCR4 (3, 5, 289).
L’axe CXCL12/CXCR4 joue un rôle essentiel dans la domiciliation et la retention des progéniteurs hématopoiètiques CD34+ et la lymphopoïèse B mais aussi dans les processus de réparation et régénération cellulaire (3,33, 45). CXLC12 exerce son rôle de facteur chimiotactique pour différents sous type cellulaires parmi lesquels les lymphocytes B et T (32, 33). Ainsi, l’interaction CXCL12/CXCR4 participe au processus de domiciliation des précurseurs B précoces (cellules pré B et pro B) ainsi que des cellules matures comme les plasmocytes dans les niches spécifiques au niveau de la moelle osseuse ou des tissus lymphoïdes secondaires (33, 107). Une modulation du profil d’expression de CXCR4 est observée au cours de la lymphopoïese et contribue à la répartition des différents sous populations cellulaires au sein de la niche médullaire et ganglionnaire (219). Il est à noter toutefois que le niveau d’expression de CXCR4 n’est pas strictement corrélé à la sensiblité des cellules à CXCL12 (33, 107). Le microenvironnement cytokinique pourrait donc aussi participer à la régulation de l’axe CXCL12/CXCR4 (45, 46).
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Figure 5 : Signalisation de l’axe CXCR4/CXCR7/CXCL12 (271). CXCL12 interagit avec 2 récepteurs, CXCR4 et CXCR7, récepteurs transmembranaires couplés aux protéines G. CXCR4 et CXCR7 peuvent former des homodimères ou des hétérodimères. CXCR7 a pour ligand CXCL12 et CXCL11. CXCR4 utilise préférentiellement les voies de signalisation associées aux protéines G. Le monomère Gα1 inhibe l’activité adénylyl cyclase participant à la régulation de la survie cellulaire, de la prolifération et du chemotactisme. Bienque Gα1 active les voies PI3K/AKT/mTOR et ERK1/2, le dimère Gβγ induit un flux calcique intracellulaire via PLC. Lors de la liaison de CXCL12/CXCR7, le récepteur induit un signal via les β-arrestines, inhibe la signalisation associée aux protéines G et active la voie des MAPK. CXCR7 induit aussi un signal médié par PLC/MAPK impliqué dans la survie cellulaire. L’hétérodimère CXCR4–CXCR7–β-arrestine peut alors activer la phosphorylation dépendante de GRK afin d’internaliser CXCR4 et de participer au contrôle de la survie cellulaire par l’activation de ERK1/2. Un processus de désensibilisation des récepteurs se produit. Les signaux d’activations sont représentés par les traits pleins, les signaux d’inhibitions par les lignes en pointillées.53
B. Le syndrome de WHIM
Le syndrome de WHIM (OMIM : 193670) est un déficit immunitaire rare de transmission autosomique dominant, dont l’acronyme décrit l’association de signes cliniques définissant ce syndrome : (W) verrues liées à des infections récurrentes par le virus de papillome (HPV), (H) hypogammaglobulinémie, (I) infections bactériennes à répétitions, (M) myélokathexis ou rétention anormale des polynucléaires neutrophiles dans la moelle osseuse (5, 119). Depuis sa description en 1964, un peu plus d’une soixantaine de patients atteint du syndrome de WHIM sont à ce jour rapportés parmi lesquel de très rares cas sporadiques (5, 27, 108).
La neutropénie, souvent sévère, associée à l’hypogammaglobulinémie conduit à une susceptibilité accrue aux infections bactériennes. Les cas d’infections sévères à pyogènes (méningites, septicémies,..) sont peu fréquentes et peuvent être traitées efficacement par antibiothérapie (27). Une modification de la répartition des sous populations lymphocytaires T et B est observée dans les syndromes de WHIM. Un déficit en lymphocytes B mémoires CD27+ IgM+ ou IgD+ est décrit (108). La lymphopénie T ne favorise toutefois pas la survenue d’infections à germes opportunistes. La profondeur du déficit immunitaire observé chez les patients contraste avec une symptomatologie clinique parfois modérée : une dissociation génotype/phénotype caractérise donc le syndrome de WHIM (5, 27, 108, 199, 288).
Le syndrome de WHIM est associé à des mutations constitutionnelles du gène CXCR4. Ces mutations sont hétérozygotes et de type non sens. Les mutations de type frame shift ou faux sens sont en revanche rares (5, 108, 119, 177, 178, 288). Un cas exceptionnel de chromothripsis conduisant à la perte de l’allèle muté CXCR4 et donc à la normalisation du phénotype a été rapporté (197). Les mutations de CXCR4 sont localisées dans le domaine C terminal du récepteur et conduisent le plus souvent à une perte des 10 à 19 derniers acides aminés comprenant les différentes sérines essentielles dans le processus de désensibilisation du récepteur (5, 48). Un défaut d’internalisation du récepteur et de découplage de CXCR4 avec les protéines G est mis en évidence. Une augmentation de sensibilité à la chémokine CXCL12 est alors observée (21). Ces mutations de CXCR4 associées au syndrome de WHIM sont donc des mutations de type gain de fonction par défaut d’inactivation du récepteur CXCR4 (5, 21). Des mutations de type perte de fonction de CXCR4 ont été identifiées dans un autre déficit immunitaire rare : la lymphopénie T CD4 idiopathique (5).
Il n’a pas été rapporté de risque accru aux syndromes myélodysplasiques ou aux leucémies aigues dans les syndromes de WHIM. La survenue de syndromes lymphoprolifératifs (lymphomes T, DLBCL,...) a été en revanche décrite (27, 58, 133). Les cancers ano-génitaux liés aux virus HPV et les complications pulmonaires secondaires aux infections répétées constituent les principales complications observées chez les patients à long terme (5, 27). Outre la prise en charge des complications infectieuses (antibiotiques, administration d’immunoglobulines polyvalentes,..), le
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schéma thérapeutique des patients est en train d’évoluer au regard des résultats intéressants obtenus par l’utilisation d’un antagoniste spécifique de CXCR4, le plerixafor ou AMD3100 (196).
Figure 6 : Représentation de la structure de CXCR4 et des mutations de CXCR4 dans le syndrome de WHIM (5). Les acides aminés sont représentés par des cercles bleus. Les sérines (losanges oranges) et les thréonines (triangles verts) du domaine intracytoplasmique sont présentées. Les mutations de CXCR4 décrites dans le syndrome de WHIM sont signalées par la couleur rouge.
C. Axe CXCL12 /CXCR4 dans la MW
Dans la MW, les études en transcriptome et en protéomique ont montré une dérégulation de l’expression de différentes chémokines suggérant une dérégulation de l’interface fonctionnelle entre la cellule tumorale et son microenvironnement (65, 110, 113, 304). Une grande hétérogénéité du profil d’expression de chimiokines a notamment été observée pour les récepteurs, les récepteurs d’adhésion (VLA4 et LFA-1) et leurs ligands (VCAM-1 et ICAM-1) (215). Les cellules tumorales de MW présentent donc une altération du profil d’expression de différentes molécules d’adhésion et de récepteurs de chémokines parmi lesquel figure CXCR4 (215).
CXCR4 est exprimée par les cellules tumorales isolées de la MO de patients atteints de MW comme dans les lignées cellulaires BCWM1 et MCWM1 (49, 81, 124, 215). De plus, une augmentation de l’expression de CXCL12 est observée au niveau médullaire. Les cellules tumorales sécretent du CXCL12 (132). La surexpression de CXCR4 et de son ligand CXCL12 suggére l’existence d’une boucle autocrine/paracrine de signalisation de la voie CXCR4. Différents facteurs
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comme un contexte d’hypoxie pourraient contribuer à la régulation de l’axe CXCL12/CXCR4 (45, 46, 211). Après interaction entre CXCL12 et son récepteur CXCR4, une activation de différentes voies de signalisation intracellulaires comme MAKP/ERK, AKT et PKC est observée dans la MW (215). Une réponse chémotactile est alors observée. CXCR4 est un acteur essentiel de processus de homing médullaire dans la MW (101, 215). Src participe aussi à la régulation des processus d’adhésion et de migration cellulaire induits par CXCL12 (216). En revanche, la balance des protéines anti/proapoptiques (bcl2,..) n’est pas régulée par CXCL12 (50). Au total, CXCR4 est un acteur primordial dans les mécanismes de domiciliation médullaire des cellules tumorales dans la MW.
Différents agents pharmacologiques modulent l’interaction de la cellule tumorale avec son microenvironnement. Une inhibition pharmacologique par l’ibrutinib (inhibiteur de BTK) ou l’idélalisib (inhibiteur de PI3K kinase) entraine une diminution des interactions adhésives entre les cellules tumorales et leur microenvironnement (75). L’inhibition spécifique de CXCR4, le plerixafor ou plus récemment le BMS936564/MDX1338, ainsi que l’invalidation de CXCR4, est associée à une diminution des capacités de migration et d’adhésion des cellules de MW in vitro (215, 260). Une diminution de l’infiltration tumorale est observée dans des modèles murins traités par le BMS936564 (260). En présence d’inhibiteur de CXCR4, une sensibilisation des cellules tumorales au bortezomib est également mise en évidence dans un contexte de co-culture avec des cellules stromales ce qui suggère l’implication d’une dérégulation de l’axe CXCL12/CXCR4 dans certains profils de chimiorésistance des cellules tumorales de MW (215, 260).
Les intégrines forment une superfamille de glycoprotéines hétérodimériques qui participent aux processus d’adhésion cellulaires et à l’interaction avec la matrice extracellulaire. Elles jouent un rôle crucial dans les réseaux fonctionnels s’établissant lors des processus de régulation de la migration et de l’adhésion cellulaires au sein de la niche médullaire (45, 70). Le VLA4 ou CD49d est un récepteur à la fibronectine et au VCAM1 (CD106) exprimé par l’endothélium activé (70). L’interaction directe entre l’intégrine CD49d et CXCR4 participe activement à la dérégulation de la survie cellulaire, à l’activation de différents réseaux de signalisation intracellulaires essentiels pour la cellule tumorale et aux processus de domiciliation cellulaire au sein de la niche médullaire dans la MW (3, 260). Cibler l’axe CXCL12/CXCR4/CD49d par le développement d’antagonistes de CXCR4 ou du CD49d seul ou en association avec d’autres agents pharmacologiques pourrait donc être envisagé dans la prise en charge thérapeutique de la MW.
D. Mutation de CXCR4 dans la MW
Les études de séquençage complet du génome ont identifié des mutations somatiques du gène CXCR4 chez 8 des 30 patients analysés (27%) dans la maladie de Waldenström. L’analyse d’une cohorte de validation de 147 patients a permis de confirmer par séquençage Sanger la fréquence élevée
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des mutations CXCR4 (29%) (131). Les mutations du gène CXCR4 constituent donc le deuxième groupe de variants le plus fréquemment identifié dans la MW après la mutation MYD88L265P.
Ces mutations somatiques sont identiques ou comparables sur le plan fonctionnel à celles initialement décrites dans le syndrome de WHIM (5, 51, 260). Dans la MW, deux classes de mutations de CXCR4 de type non sense (CXCR4NS) ou frameshift (CXCR4FS) dans le domaine C terminal ont été observées représentant respectivement 49% et 51% des patients, principalement mutés MYD88L265P. Les mutations aboutissent donc à la synthèse d’une protéine CXCR4 tronquée au niveau du domaine intracytoplasmique C terminal. Les mutations les plus fréquentes sont la substitution de la cytosine en position 1013 par une adénine (C1013A) ou par une guanine (C1013G) identifiées dans respectivement 4 et 7.5 % des cas dans une cohorte de 175 MW (131). La sérine en position 338 est donc affectée par ces mutations dans près de la moitié des MW mutés CXCR4 (MW CXCR4Muté). L’équipe d’I Ghobrial a développé un test de PCR en temps réel, plus sensible que le séquençage en Sanger, pour rechercher la mutation CXCR4 C1013G qui a été détectée dans 30% des 135 cas de MW inclus dans cette étude (260). Toutefois, plus de 30 mutations différentes de CXCR4 ont donc été rapportées à ce jour dans cette hémopathie (24, 275, 300). Plusieurs mutations de CXCR4 peuvent être identifiées dans près d’un tiers des patients en combinant des techniques de séquençage Sanger à partir d’ADN extrait de cellules CD19+ et de PCR allèle spécifique (335).
Les variants somatiques de CXCR4 ont été recherchés dans d’autres hémopathies lymphoides B. La mutation CXCR4C1013G n’a pas été détectée dans les LLC, les leucémies à tricholeucocytes, les myélomes à IgM, les MGUS à IgG, A ou IgG, les lymphomes lymphoplasmocytaires et les amyloses (260, 335). En revanche, cette mutation a été mise en évidence dans environ 10% des cas de DLBCL et des lymphomes de la zone marginale dans de petites séries (260, 275). L’analyse des données de séquençage exomique ou du génome complet ne rapporte que de rares cas d’altération de CXCR4 dans ces hémopathies (183, 191, 229, 251, 262, 313). La mise en évidence de mutation CXCR4 de type WHIM constitue donc principalement une caractéristique de la MW (131, 260).
La valeur pronostique clinique des mutations de CXCR4 a été étudiée dans une série rétrospective de 175 patients (300). Le suivi médian était de 58 mois (8 – 281). Les mutations de CXCR4 étaient plus fréquentes dans les groupes des patients avec une MW de type symptomatique. Le groupe des patients mutés CXCR4 présentait un profil clinico biologique particulier au diagnostic caractérisé par un infiltrat plus important de la moelle osseuse, une plus faible incidence des adénopathies, une thrombopénie plus importante et une fréquence plus élevée de syndrome d’hyperviscosité conduisant à l’initiation de plasmaphèreses. Un pic d’IgM plus élevé a d’ailleurs été observé dans le groupe CXCR4Mutés même si la fréquence des patients avec plus de 70g/l, facteur pronostique indépendant, n’est pas significativement différente entre les 2 groupes (205, 300). En revanche, même si une association des mutations de CXCR4 aux formes symptomatiques de MW a été montrée, ces variants ne présenteraient pas de valeur pronostique clinique dans cette étude
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rétrospective (300). En revanche, un taux plus faible de réponse à l’ibrutinib a été récemment rapporté dans le groupe des patients mutés CXCR4 dans une cohorte de 63 patients (301B).
E. Caractérisation fonctionnelle des mutations CXCR4 dans le MW
Deux études menées par les groupes de S Treon et d’I Ghobrial ont analysé l’impact fonctionnel de la mutation la plus fréquente CXCR4 S338X en utilisant des stratégies expérimentales différentes (49, 260). Une augmentation de la prolifération cellulaire et du taux de sécrétion d’IgM sont observés dans un modèle murin CXCR4C1013G. La survie de ces souris est diminuée par rapport au groupe de référence. Les souris présentent par ailleurs une infiltration tumorale extramédullaire comprenant des localisations rénales et pulmonaires (260). Un défaut d’internalisation de CXCR4 après stimulation par CXCL12 est rapporté, ce qui suggère une anomalie du processus de désensibilisation du récepteur CXCR4. Des anomalies comparables ont été observées dans la modélisation des syndromes de WHIM (5, 21, 22, 260). Une augmentation du niveau d’expression de la protéine CXCR4 en cytométrie de flux est par ailleurs observée chez les patients mutées CXCR4C14013G dans une série de 11 échantillons. La modélisation de la mutation dans les lignées BCWM1 ou MCWM1 par infection lentivirale a confirmé l’existence d’une dérégulation de plusieurs réseaux fonctionnels comme des gènes impliquées dans la régulation des protéines G, RGS1 (Regulator of G-protein), et RGS13 ou des phosphatases DUSP4 (Dual specificity phosphatase) ou DUSP5 par analyse du transcriptome (132, 260). D’autre part, une activation des voies de signalisation intracellulaire AKT et ERK est mise en évidence ainsi qu’une augmentation de la survie cellulaire dans les cellules mutées CXCR4C1013G (49). La mutation CXCR4S338X a été associée à profil de chimiorésistance à différents classes thérapeutiques in vitro. Ainsi, une diminution de sensibilité à l’inhibiteur de BTK, l’ibrutinib et à l’idélalisib, un inhibiteur de la voie PI3K, est décrite dans ces modèles précliniques de MW (49, 260). L’exposition de cellules tumorales mutées CXCR4 à du CXCL12 induit une diminution de la sensiblité à l’ibrutinib et à l’idélalisib (49). En revanche, aucune modification significative du profil de sensibilité aux inhibiteurs de protéasome, bortézomib ou carfizomib, n’est observée. La diversité des mutations observées dans la MW rend difficile la modélisation fonctionnelle de l’ensenble de ces variants. Toutefois, des effets comparables à ceux de la mutation CXCR4S338X sont rapportés lors de l’étude de la modélisation d’autres mutations de type frame shift dans le MW (51). Cibler directement MYD88 par l’utilisation d’inhibiteurs spécifiques a montré le rôle prépondérant de la mutation MYD88L265P dans la survie cellulaire de la MW dans ces modèles mutés CXCR4 (51).En conclusion, les mutations du gène CXCR4 pourraient être considérées comme des mutations gain de fonction dans la MW.