Algorithme de traitement des images dédié à l’imagerie du réseau mnésique 161

4.7 Conclusion . . . 162

4.1 Introduction : Objectif du projet

Malgré des avancées en neurobiologie, la formation d’un souvenir est loin d’être totale-ment comprise. La principale barrière pour interpréter le code neuronal impliqué lors de la mémorisation est la capacité de suivre l’activité globale du réseau de neurones à l’échelle cellulaire. L’objet de ce chapitre est le regroupement de trois compétences -neurosciences, microscopie optique et analyse quantitative d’images- afin de développer les outils nécessaires à l’analyse en trois dimensions et au cours du temps du centre de la mémoire, à l’échelle du neurone individuel, au cours d’un événement de mémorisation. Le modèle de la drosophile est particulièrement adapté à cette étude. Le centre de la mémorisation, lié à un protocole d’apprentissage associatif olfactif, a été identifié chez la drosophile [3] : il s’agit des corps

pédonculés composés de neurones appelés cellules de Kenyon. Ces neurones sont le point de convergence de l’information olfactive et des signaux de nourriture ou des chocs électriques utilisés lors des expériences de conditionnement [182] (respectivement dans le cas de protocoles appétitif ou aversif). Pour une molécule odorante donnée, les informations olfactives en provenance des lobes antennaires n’activent qu’une très faible population de cellules de Kenyon [27, 183, 184]. Cette réponse est non stéréotypique c’est-à-dire que la position des cellules de Kenyon qui répondent à une odeur donnée est différente entre les individus [185]. En revanche, les informations codant le contexte (appétitif ou aversif) ont un effet beaucoup plus global sur les neurones des corps pédonculés. Le codage de la mémoire ne se fera que dans les neurones ayant associés ces deux stimulations. Il est donc important de pouvoir suivre l’activité de ces neurones de façon individuelle au cours de la formation de la mémoire olfactive.

Les approches optiques dans le domaine de la neurobiologie de la drosophile sont principalement la microscopie confocale ou la microscopie biphotonique. Néanmoins, ces techniques ne sont pas assez rapides pour suivre en temps réel l’activité de l’ensemble des cellules de Kenyon. Pour ce projet, j’ai alors utilisé une microscopie basée sur la technologie “spinning disk” qui permet de paralléliser l’imagerie confocale et ainsi d’augmenter d’un facteur environ dix la rapidité d’imagerie, en comparaison d’un microscope confocal à balayage traditionnel [186].

4.2 Matériel et méthodes

4.2.1 Le dispositif d’imagerie multiconfocale à deux couleurs

4.2.1.1 L’imagerie multiconfocale “spinning disk”

En microscopie confocale traditionnelle, l’acquisition se fait en excitant point par point l’échantillon. Cette technique d’imagerie est alors limitée par la vitesse de balayage latéral du faisceau d’excitation, réalisé soit à l’aide de cales piezo-électriques, soit de miroirs galvanomé-triques. Néanmoins, même pour des techniques de microscopie confocale, où la dynamique du balayage est optimisée grâce à l’utilisation de déplacements non mécaniques assurés par exemple par des déflecteurs acousto-optiques [89,187], la vitesse de balayage est limitée par la brillance de l’échantillon. En effet, pour réaliser de la microscopie confocale rapide, le temps passé par pixel doit être très faible, imposant une grande puissance d’excitation afin de récolter suffisam-ment de photons de fluorescence. Cette caractéristique est une limitation pour l’imagerie in

vivo où l’échantillon doit être préservé au maximum des effets délétères d’une trop forte

exci-tation lumineuse. De plus en microscopie confocale, la durée d’acquisition d’une image dépend grandement de sa taille. Des valeurs typiques de durées d’exposition minimales en fonction de la taille de l’image, pour le microscope confocal que j’ai utilisé durant ma thèse (Olympus Fluo-view FV1000), sont données dans le tableau 4.1. Ces durées ne sont pas adaptées à l’imagerie tridimensionnelle rapide d’un système vivant comme le nécessite notre étude. La microscopie multiconfocale permet de paralléliser le faisceau d’excitation pour augmenter la dynamique temporelle d’imagerie. Son principe de fonctionnement est décrit dans la section 2.1.3.2 du Chapitre 2. Les caractéristiques précises du modèle de microscope multiconfocal utilisé durant

cette thèse seront détaillées dans la section4.2.1.3.

Taille de l’image (pixels) Durée d’acquisition minimale (ms)

128×128 188

512×512 1109

Tableau 4.1 – Tableau récapitulatif de la durée d’exposition minimale pour différentes tailles d’images avec le microscope confocal Olympus Fluoview FV1000.

4.2.1.2 Résultats préliminaires de microscopie multiconfocale obtenus à l’Institut

Curie

Figure 4.1 – Images réalisées sur un microscope “spinning disk” sur la plate-forme d’imagerie de l’Institut Curie avec la collaboration d’Olivier Renaud. (A) Projection maximale d’intensité, sur une épaisseur d’échantillon de 50 µm, de 50 images prises dans la zone des corps cellulaires des cellules de Kenyon, pour une drosophile de génotype 238y-GAL4, UAS-GFP NLS/+. Barre d’échelle : 20 µm. (B) Projection maximale d’intensité, sur une épaisseur d’échantillon de 50 µm, de 50 images des neurones MB-V3, pour une drosophile de génotype G0239-GAL4,

UAS-CD8-GFP/+. Barre d’échelle : 10 µm. Pour (A) et (B), la durée d’exposition est 65 ms.

Le grandissement de l’objectif est 63× (Zeiss 63× ON 1.0 Vis-IR W plan apochromat 421480-9900). (C) Représentation anatomique schématique du cerveau de la drosophile. En vert sont représentés les corps pédonculés où la protéine fluorescente GFP est exprimée grâce au pilote d’expression 238y-GAL4. Les neurones MB-V3, révélés par le pilote d’expression G0239-GAL4, sont représentés en rouge. Ces neurones projettent sur le lobe α des corps pédonculés. Les zones imagées en (A) et (B) sont également indiquées.

Des tests préliminaires de faisabilité ont été réalisés sur un dispositif de microscopie multi-confocale de type “spinning disk”, modèle Zeiss Examiner Axio, de la plate-forme d’imagerie de l’Institut Curie. Ce microscope est équipé d’un capteur CCD CoolSnap HQ2. Deux lignées transgéniques de drosophiles exprimant la protéine fluorescente GFP ont alors été imagées :

238y-GAL4, UAS-GFP NLS/+ et G0239-GAL4, UAS-CD8-GFP/+. La GFP NLS est

expri-mée dans les noyaux tandis que la CD8-GFP s’exprime dans le cytoplasme. Le pilote d’ex-pression 238y-GAL4, correspondant au marquage de l’ensemble des cellules de Kenyon, a été utilisé pour juger la qualité de l’imagerie des corps cellulaires des neurones des corps pédonculés. Le pilote d’expression G0239-GAL4 permet quant à lui l’expression du rapporteur protéique CD8-GFP dans seulement deux paires de neurones par hémisphère du cerveau. Ce pilote d’ex-pression est alors utilisé pour évaluer la sensibilité et la résolution in vivo du microscope car il permet de marquer des axones isolés, dont le diamètre est inférieur à la limite de diffraction. Il permet le marquage des neurones MB-V3 [188] dont les dendrites communiquent avec les lobes verticaux des corps pédonculés. Ces neurones jouent un rôle dans la formation de la mémoire à long terme chez la drosophile [189, 190]. La figure 4.1 montre les images obtenues avec le dispositif de l’Institut Curie. Les noyaux des corps cellulaires des cellules de Kenyon ainsi que les neurones MB-V3 ont pu être imagés jusqu’à une profondeur de 50 µm dans le cerveau de la drosophile.

4.2.1.3 Le dispositif de microscopie “spinning disk”

Le microscope “spinning disk” utilisé précédemment pour les tests préliminaires l’a été sur plate-forme d’imagerie. Les contraintes matérielles de notre expérience -disponibilité des spé-cimens biologiques in vivo, adaptation permanente au microscope d’un système de stimulation olfactive et électrique- ne permettent pas un travail aisé au sein d’une plate-forme. Une schéma-tisation du microscope “spinning disk”, que l’équipe de T. Préat a acquis suite aux tests réalisés à l’Institut Curie, et que j’ai utilisé pour obtenir les résultats présentés dans ce chapitre, est donnée à la figure 4.2. Il s’agit d’un microscope “spinning disk droit”, Zeiss Examiner Z1 Axio, équipé d’un capteur EMCCD (Electron Multiplying Charge Coupled Device, Photometrics Delta Evolve). L’excitation lumineuse est réalisée par deux lasers pompés par diode émettant aux longueurs d’onde de 491 nm et 561 nm (puissance maximale de 50 mW, Roper Scientific). Le balayage de l’échantillon est assuré grâce à une tête confocale de type CSUX1-M1N-E, dont le détail est précisé à la figure 4.2C. Ce disque de Nipkow, constitué d’un arrangement en spirale de 20000 trous de filtrage de diamètre 50 µm espacés les uns des autres de 250 µm, tourne au maximum à une vitesse de 5000 tours par minute de façon synchrone avec un second disque constitué du même nombre de micro-lentilles de diamètre 250 µm. Lorsque les disques sont en rotation, environ 1000 faisceaux laser scannent simultanément l’échantillon. Cette pa-rallélisation des faisceaux laser de balayage augmente alors la rapidité d’imagerie. La fréquence d’imagerie par plan est limitée à 60 Hz, limite imposée par la vitesse de rotation du disque. Un ensemble de filtres optiques interférentiels (modèle 59022 ET - EGFP/mCherry, Chroma) définissent les différentes voies spectrales du microscope. Chacun des filtres est constitué de deux bandes de transmission comme représenté sur la figure 4.3. La lame dichroïque permet de réfléchir la lumière excitatrice vers l’échantillon et de transmettre la fluorescence émise vers la caméra. Deux objectifs de microscope à immersion à eau sont disponibles sur ce dispositif :

Figure 4.2 – (A) Photographie du système d’imagerie “spinning disk” Zeiss Examiner Z1 Axio. (B) Détail du système Dualview d’imagerie simultanée de deux longueurs d’onde d’émission séparées spectralement. BP : filtre à bande passante. (C) Détail de la tête multiconfocale pour le balayage de l’échantillon à l’aide de la rotation de disques de Nipkow. DM : miroir dichroïque.

Zeiss 40× ON 1.0 Vis-IR W plan apochromat 421462-9900 (distance de travail : 2.5 mm) et Zeiss 63× ON 1.0 Vis-IR W plan apochromat 421480-9900 (distance de travail : 2.1 mm). Ces objectifs ont une transmission de l’ordre de 80%, de 400 à 900 nm. Ils sont montés sur une cale piezo-électrique de course 100 µm (Pifoc P-721.SL2, PI) permettant une translation axiale fine de l’objectif, de résolution 5 nm, et l’acquisition rapide de piles d’images en profondeur dans l’échantillon. La fréquence de résonance du Pifoc chargé à 200 g est de 180 Hz. La cadence maximale d’acquisition de 60 Hz n’entre pas en résonance avec celle de la cale piezo-électrique. Le porte-échantillon est monté sur une platine de translation afin d’ajuster sa position latérale-ment. Un ensemble de miroirs et de filtres (Dualview Photometrics DV2) est monté sur la voie d’émission du microscope, en amont de la caméra, afin de permettre l’acquisition simultanée au niveau de la caméra de deux longueurs d’onde. L’ensemble du système est piloté par le logiciel VisiView 2.1.3 (Visitron Systems GmbH) permettant par exemple le contrôle aisé de la durée d’exposition ou du gain de la caméra, l’acquisition multidimensionnelle des images (multispectrales et en fonction du temps) ainsi que l’écriture de macros pour le pilotage de matériels annexes au microscope par signaux logiques.

400 450 500 550 600 650 700 750 -25 0 25 50 75 100 125 150 P o u r c e n t a g e d e t r a n s m i s s i o n Longueur d'onde (nm) filtre d'excitation filtre d'émission lame dichroïque

Figure 4.3 – Spectres de transmission des filtres d’excitation, d’émission et de la lame di-chroïque utilisés dans le microscope “spinning disk” Zeiss. Ces trois filtres proviennent de la société Chroma. Le filtre d’excitation (modèle 59022x) transmet deux bandes spectrales de 450 à 490 nm (rayonnements de couleur bleue) et de 550 à 590 nm (rayonnements de couleur jaune). Le filtre d’émission (59022m) bloque la lumière excitatrice et transmet les bandes 500-550 nm (radiations vertes) et 605-665 nm (radiations rouges). La lame dichroïque, située au niveau des disques de Nipkow permet de séparer spectralement l’excitation de l’émission grâce à un design de transmission à deux bandes 500-540 nm (radiations vertes) et 600-670 nm (radiations rouges). Une portion du spectre de la lumière blanche est donné à titre indicatif.

4.2.1.4 Le système DualView

Ce dispositif (Dualview Photometrics DV2) est détaillé sur la figure 4.2B. Ce système per-met d’imager, dans deux bandes spectrales disjointes, un même objet fluorescent. Son principe de fonctionnement est basé sur la séparation spatiale, à l’aide de miroirs et d’une lame di-chroïque, des deux bandes d’émission. La lame dichroïque réfléchit la composante de l’émission de plus basse longueur d’onde, autour de 520 nm, tandis que la composante de l’émission de plus haute longueur d’onde, vers 610 nm, est transmise. Chaque composante spectrale est ensuite imagée simultanément sur une moitié du capteur EMCCD.

4.2.1.5 Performances optiques du microscope

Afin de déterminer les résolutions latérales et axiales du microscope multiconfocal, j’ai imagé des échantillons de billes fluorescentes de 100 nm de diamètre (Fluosphere, F8803), de longueur d’onde d’excitation 505 nm, et d’émission 515 nm, contenues dans un gel d’agarose polymérisé de concentration massique 2%. La figure 4.4 montre les coupes latérales et axiales de l’image d’une bille de 100 nm pour les deux objectifs de microscope différents. On retrouve l’anisotropie de résolution entre les directions latérales et axiales. On note également que

Figure 4.4 – Imagerie multiconfocale d’une bille fluorescente verte de 100 nm de diamètre dans un gel d’agarose de concentration massique 2% avec deux objectifs différents : Zeiss 63×

ON 1 et Zeiss 40× ON 1. (A) Coupe latérale (x, y) avec l’objectif Zeiss 63× ON 1. Barre

d’échelle : 500 nm. (B) Reconstruction axiale (x, z) avec l’objectif Zeiss 63× ON 1. Barre d’échelle : 1 µm. (C) Coupe latérale (x, y) avec l’objectif Zeiss 40× ON 1. Barre d’échelle : 500 nm. (D) Reconstruction axiale (x, z) avec l’objectif Zeiss 40× ON 1. Barre d’échelle : 1 µm.

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 0 10000 20000 30000 PROFIL LATERAL I n t e n s i t é d e f l u o r e s c e n c e ( U . A . ) distance (µm) Objectif 63x Objectif 40x

Figure 4.5 – Profils latéraux d’intensité de fluorescence pour les deux objectifs de microscope. n = 5 billes fluorescentes de 100 nm. 1 2 3 4 5 6 7 0 10000 20000 30000 40000 PROFIL AXIAL Objectif 63x Objectif 40x I n t e n s i t é d e f l u o r e s c e n c e ( U . A . ) distance (µm) PROFIL AXIAL

Figure 4.6 – Profils axiaux d’intensité de fluorescence pour les deux objectifs de microscope. n = 5 billes fluorescentes de 100 nm.

les résolutions latérales et axiales sont affectées par l’objectif utilisé. Afin de quantifier ces résolutions, des profils d’intensité de fluorescence latéraux et axiaux moyennés sur 5 billes fluorescentes ont été tracés pour les deux objectifs (figures 4.5 et4.6).

En modélisant la figure d’Airy par une fonction gaussienne et en appliquant la formule 2.20

du Chapitre 2 reliant la largeur à mi-hauteur F W HM de la modélisation gaussienne à la ré-solution spatiale, on obtient les résultats résumés dans le tableau 4.2. Les valeurs théoriques ont été déterminées en utilisant les équations 2.16 et 2.17 du Chapitre 2. On trouve expéri-mentalement des résolutions latérales de 218 ± 13 nm et 450 ± 13 nm respectivement pour les

objectif 63× ON 1 objectif 40× ON 1 théorie ON 1 taille d⁰un pixel 102 nm 161 nm F W HM_x,y 270 ± 10 nm 450 ± 10 nm F W HM_x,y déconvoluée 170 ± 10 nm 350 ± 10 nm ∆_x,y 218 ± 13 nm 450 ± 13 nm 315 nm F W HM_z 1.3 ± 0.1 µm 2.2 ± 0.1 µm F W HM_z déconvoluée 1.2 ± 0.1 µm 2.1 ± 0.1 µm ∆_z 1.5 ± 0.1 µm 2.7 ± 0.1 µm 1.4 µm

Tableau 4.2 – Tableau récapitulatif des largeurs à mi-hauteur latérales et axiales F W HM_x,y et F W HM_z des modélisations gaussiennes de la fonction d’Airy et comparatif des résolutions latérales ∆x,y et axiales ∆z expérimentales et théoriques pour les deux objectifs utilisés. Les valeurs en gras sont des déterminations expérimentales.

objectifs de grandissement 63× et 40×. Les mesures expérimentales de la résolution latérale sont plutôt en accord avec la valeur théorique, qui est de 315 nm. On constate néanmoins que l’on obtient une résolution latérale expérimentale plus petite que la valeur théorique pour l’objectif de grandissement 63×. Cet effet est probablement dû à un artefact d’échantillonnage. Le critère de Shannon-Nyquist impose un échantillonnage à une fréquence spatiale au moins double de celle de la limite de diffraction, soit environ deux pixels pour la largeur à mi-hauteur, ce qui est tout juste satisfait ici. On peut également remarquer que l’on obtient des résolutions axiales différentes pour les deux objectifs bien qu’ils aient la même ouverture numérique qui est le seul paramètre de l’objectif qui intervient dans le calcul théorique de la résolution axiale. Pour l’objectif 63×, la valeur expérimentale mesurée pour la résolution axiale ∆_z est proche la valeur théorique où c’est le phénomène de diffraction qui limite la résolution spatiale. Pour l’ob-jectif 40×, la résolution axiale correspond au double de la valeur théorique. On peut toutefois noter que les valeurs théoriques ne s’appliquent que si l’on considère un système optique sans aberration. Une dégradation de la résolution expérimentale par rapport aux valeurs théoriques peut être due par exemple à un mauvais remplissage de la pupille de l’objectif. En considé-rant la formule 2.17 et la valeur expérimentale ∆_z mesurée pour l’objectif 40×, il est possible de calculer l’ouverture numérique ON effectivement utilisée pour l’imagerie. Le calcul donne une valeur de 0.8 pour l’ouverture numérique effective de l’objectif 40× utilisé sur ce système optique. Une autre hypothèse, plus plausible dans notre cas, expliquant la dégradation de la résolution spatiale par rapport à la limite de diffraction, est l’utilisation d’un seul et même disque de Nipkow avec une taille de trous fixe pour les deux objectifs. La taille des trous confo-caux du disque est alors parfaitement adaptée à l’objectif de grandissement 63× et non à celui de grandissement 40×.

4.2.2 Le système de stimulation

4.2.2.1 La cellule environnementale

Un dispositif de stimulation, qui peut s’incorporer sur le système d’imagerie optique, a été développé afin de pouvoir délivrer à la drosophile deux types de stimuli : olfactif et électrique. Le but est à terme de permettre l’apprentissage des drosophiles directement sous le microscope, grâce à des protocoles de conditionnement associatif olfactif aversif.

Figure 4.7 – (A) Vue globale de la cellule de stimulation des drosophiles. (B) Partie de la cellule constituant le dispositif de stimulation : tuyaux pour la stimulation olfactive et bras mobiles pour la stimulation électrique. (C) Vue de côté de la cellule de stimulation.

Le matériau composant la cellule de stimulation est du dural, alliage aluminium/cuivre, choisi pour sa facilité d’usinage par rapport à d’autres métaux. La figure4.7présente différentes vues de la cellule de stimulation. La drosophile, préparée pour l’imagerie, est positionnée au centre de la cellule. Une rondelle permet de créer un petit réservoir hermétique où du liquide physiologique est versé afin de baigner le cerveau. L’odeur est présentée à la drosophile grâce à un système de tuyaux. Le flux arrive au niveau de sa tête, et surtout au niveau de ses antennes, puis est recapté par un tuyau conique relié à une pompe aspiratrice. La cellule est fermée afin de permettre une bonne extraction des odeurs présentées. La partie stimulation électrique est assurée par deux bras mobiles indépendants qui permettent de positionner de façon précise les électrodes sur le corps de la drosophile. La position des électrodes est décrite en détail au Chapitre 5, où la stimulation électrique a joué un rôle capital (figure 5.6C).

Figure 4.8 – (A) Schématisation du système de contrôle de l’envoi des odeurs vers la cel-lule pour l’imagerie fonctionnelle des réponses à une stimulation olfactive. P et D désignent respectivement les pompes et les débimètres. Les chiffres de 1 à 6 correspondent aux diffé-rentes électrovannes du circuit. MCH : 4-méthylcyclohexanol. OCT : octan-3-ol. (B) Tableau récapitulant les niveaux logiques TTL des différentes électrovannes, numérotées de 1 à 6, pour les configurations suivantes : configuration par défaut, envoi de l’air dit “contrôle”, envoi de l’odeur MCH, envoi de l’odeur OCT. Les signaux de déclenchement des électrovannes EV2 et EV3 ainsi que EV5 et EV6 sont deux à deux identiques. (C) Photographie du système où l’on peut voir les débimètres, les électrovannes, le circuit de tuyaux ainsi que les bouteilles contenant le mélange huile/“odeur”.

4.2.2.2 Le dispositif de stimulation olfactive

Le système de stimulation olfactive est schématisé sur la figure 4.8A. En amont du sys-tème se trouvent deux pompes. Une des deux pompes alimente un circuit de tuyaux contrôlé par une série d’électrovannes. Ces électrovannes permettent de générer différentes configura-tions de stimulation. Les tuyaux plongent dans des bouteilles contenant de l’huile de paraffine neutre, pour les configurations “air défaut” et “air contrôle”, ou additionnée de produit chi-mique : 4-méthylcyclohexanol (MCH, pureté égale à 99%, Fluka 66360, Sigma-Aldrich) ou octan-3-ol (OCT, pureté supérieure à 95%, Fluka 74878, Sigma-Aldrich). Ces produits étant hydrophobiques, les solutions sont préparées dans l’huile de paraffine inodore (VWR internatio-nal, Sigma-Aldrich). Ces deux odeurs chimiques sont des alcools naturellement répulsifs pour les drosophiles et traditionnellement utilisées dans tous les protocoles de conditionnements

as-sociatifs faisant intervenir l’olfaction. 3 mL de produit sont dissous dans 100 mL d’huile de paraffine. Le flux sortant de cette partie du montage correspond à un tiers du flux total déli-vré à la drosophile. Les deux autres tiers du flux sont générés par une seconde pompe. Cette seconde pompe est reliée à un tuyau plongé dans une bouteille remplie d’huile de paraffine neutre qui crée un flux d’air principal constant au niveau de la drosophile quelque soit la configuration de stimulation choisie. En tenant compte de la dilution des produits chimiques dans l’huile de paraffine ainsi que du rapport entre le flux d’odeur et le flux d’air principal, la concentration finale en odeur arrivant au niveau des antennes de la drosophile est de 1%. Le flux principal continu permet de minimiser les variations brusques de débit au niveau de