Absence de détection l'AgHBs et des transcrits PréS2/S

Dans la compréhension des infections occultes, Hass et al. ont rapporté un cas pour lequel une mutation silencieuse dans le gène S interférait avec les processus post-transcriptionnels de l’ARN PréS2/S (Hass, Hannoun et al. 2005). Le patient HIV (+) a réactivé une OBI. L’analyse des populations virales du HBV a montré que deux quasi-espèces étaient présentes dont l'une avec une substitution G A dans le gène S à la position 458. L'étude fonctionnelle des isolats portant la substitution sG458A a montré que les isolats étaient répliquants. Mais après transfection une faible sécrétion (i) des particules virales encapsidées (ii) de l'AgHBs dans le milieu des cellules transfectées étaient observées. L'analyse des transcrits ne montre aucunes perturbation l'ARNpg ni de l'ARN PréS1. En revanche, les transcrits PréS2/S sont eux fortement affectés et ne sont pas détectés par Northern Blot. Ce résultat explique l’absence de détection de l’AgHBs dans le milieu cellulaire des cellules transfectées. La mutation sG458A se trouve être adjacente à un site d’épissage 5' dans l’ARNm du gène S. Les expériences menées in vitro montrent que les mutants sont défectifs pour l’utilisation de ce site d’épissage. Les analyses complémentaires ont montré que cette substitution affectait des processus post-transcriptionnels au niveau de l’accumulation des transcrits dans le noyau et/ou de l’export de ce dernier dans le cytoplasme. L’élément de régulation post-transcriptionnel (PRE) est positionné à l’extrémité 3’ de l’ARNm S, soit environ 750 nt en aval de la mutation sG458A. On peut supposer qu’il n’y ait pas d’interaction directe de la mutation sur le PRE. Hass et al. ont proposé un modèle pour lequel l'épissage des transcrit en 5' se fait par le recrutement de facteurs cellulaires afin de former le splicéosome. Ces facteurs sont également nécessaires pour l'export des transcrits PréS2/S non-épissés vers le cytoplasme. La mutation sG458A jouerait un rôle lors de la première étape impliquée dans les processus d’épissage et empêcherait l’assemblage du splicéosome et du complexe de la jonction d’exon, empêchant à la fois l'épissage et l'export nucléaire. Cet exemple souligne l’importance des mutations dites silencieuses et de leur impact sur la transcription ou sur les processus post-transcriptionnels

L’infection par le HBV est caractérisée par des interactions hôte-pathogènes très étroites. L'établissement de la chronicité est un système dynamique dans lequel le virus s’adapte en permanence pour assurer son maintien. De nombreuses stratégies virales sont utilisées pour échapper au système immunitaire comme la sécrétion massive des particules non infectieuses et des antigènes viraux (AgHBe et AgHBs) lors des infections chroniques. Ou au contraire une capacité pour le virus à rester silencieux comme c'est le cas lors d'infection occulte (faible virémie et absence des antigènes viraux).

L'objectif de mon travail de recherche était initialement basé sur l'étude moléculaire et biologique de souches de HBV occulte en coinfection avec le HIV. Nos connaissances actuelles sur les résistances reposent sur l'étude de patients avec une charge virale HBV initialement élevée. Les patients à faible charge virale ou infections occultes ne sont habituellement pas traités contre le HBV. On ne connaît donc pas le comportement de ces souches face aux traitements antiviraux. Certaines molécules utilisées dans le traitement HAART contre le HIV sont aussi actives contre le HBV. Les patients HIV (+)/AgHBs (-) représente une cohorte unique pour l'étude des résistances virales chez les souches à faibles charges virales impliquées dans des cas d'infections occultes. Les difficultés liées au recrutement de patients dans la cohorte, à la qualité des échantillons et la faible virémie des infections occultes ont été des obstacles à la finalisation de ce travail. Seuls des résultats préliminaires sur ce sujet qui reste très intéressant et important seront présentés dans la partie annexe en tant qu'étude 4.

La détection du virus de l'hépatite B ainsi que l'étude des propriétés moléculaires et fonctionnelles du HBV sont dépendantes des méthodes d'amplification existantes. L'amélioration des outils de détection a permis une avancée dans les connaissances sur les infections à faible charge virale. Une des particularités du virus de l'hépatite B est que son information génétique peut être sous forme relâchée circulaire (ADN-RC) dans les virions circulants ou sous forme parfaitement circulaire (ADNccc) dans le noyau des cellules hépatocytaires infectées. La particularité de la structure de l'ADN-RC est à l'origine des difficultés rencontrées pour l'amplification de génomes entiers. Dans la majorité des cas le matériel biologique disponible pour l'étude des infections au HBV est le sérum, l'ADN viral est alors sous forme RC. Pour amplifier des génomes entiers à partir de sérum, la méthode la plus couramment utilisée est une PCR génomique (P1P2 Günther). Une seconde méthode pour l'amplification des génomes entiers en une étape PCR existe. Cette technique récente, dite amplification par cercle roulant (Rolling Circle Amplification ou RCA) est très fidèle et sensible mais elle nécessite une matrice parfaitement circulaire. Dans la technique originale il a été montré que l’ADN-RC pouvait être complété et ligaturé in vitro pour être ensuite amplifié par RCA. Dans ce cas, alors l'étape de complémentation du brin d'ADN (+) repose sur l'activité et les propriétés de la polymérase virale endogène. C'est dans un second temps que l'ADN viral est extrait du sérum puis le brin d'ADN (+) est ligaturé pour former une matrice d'ADN circulaire. Cette méthode dépend largement de la bonne conservation des échantillons et implique que l’activité de la polymérase virale soit encore fonctionnelle. Nous avons développé une méthode, qui permet de compléter et circulariser le brin d'ADN (+) de

l’ADN-La détection de l'infection par le HBV repose sur la présence de l'AgHBs, cependant dans certains cas, des modifications moléculaires de l'AgHBs peuvent mettre en défaut les tests de détection enzymatique. La mutation Y100C dans le gène S est retrouvée sporadiquement et est impliquée dans des cas où l'AgHBs échappe à la détection des tests enzymatiques (donneurs de sang, infection occulte). Nous avons étudié in vitro l'impact de la mutation Y100C sur la protéine S du HBV et principalement sur la reconnaissance de l'AgHBs par un test de détection enzymatique. Nous voulions savoir si cette mutation à elle seule modifiait l'épitope immunodominant et était capable de mettre en défaut au moins un test de détection enzymatique.

Lors de l'infection par le HBV la présence des anticorps anti-HBs signe le plus souvent la résolution de l'infection par le HBV et l'élimination du virus. Dans certains cas, une réponse immunitaire inadaptée peut mener à la sélection de quasi-espèces virales échappant à la pression immunitaire. Ces variants peuvent persister dans l'organisme tout en répliquant à bas bruit et sans être détecté par le système immunitaire. Dans ce contexte, nous nous sommes intéressés aux modifications de l'AgHBs et de leurs impacts sur l'échappement aux anticorps anti-HBs du patient. Le patient qui fait l'objet de cette étude était considéré comme guéri pour l'infection au HBV mais une infection latente a réactivée et ce probablement suite à une interaction médicamenteuse. Afin de comprendre les mécanismes d'échappement viraux mis en jeu, nous nous sommes focalisés sur l'étude de l'AgHBs et tout particulièrement de sa reconnaissance par les anticorps anti-HBs du patient. Des expériences d'immunoprécipitation nous ont permi de proposer un scénario expliquant l'apparition des phénomènes mutationnels qui ont mené à cet échappement viral. Ce travail, présenté comme étude 3, illustre la complexité des interactions hôte-pathogène impliquées dans les phénomènes d'échappement.

Etude 1: Développement d'une nouvelle méthode