0.01 0.02 1 2 3 4 5 HBMECs foetales Capillaires adultes CMSPs N iv e a u d 'e x p re s s io n e n A R N m ( 2 - ∆∆∆∆ C T )
2- Résultats complémentaires sur l’expression en ARNm des transporteurs ABC
Afin de pouvoir comparer l’expression en ARNm des transporteurs ABC présents dans nos différents modèles cellulaires, nous avons réalisé une expérience de RT-PCR semi-quantitative (normalisation par rapport au gène HPRT).
Les CMSPs expriment la Pgp, le MRP1, la MRP5 et la MRP6.
Les cellules endothéliales cérébrales humaines fœtales et les capillaires endothéliaux humains adultes ont des niveaux d’expression des transporteurs assez similaires, mis à part pour la Pgp où le niveau d’expression semble plus faible chez l’adulte.
En ce qui concerne la Pgp, les niveaux d’expression semblent du même ordre de grandeur pour les CMSPs et les cellules endothéliales cérébrales fœtales. Pour les MRP1, MRP5 et MRP6, les niveaux d’expression semblent plus élevés dans les CMSPs. Quant à la MRP2, la MRP4 et la BCRP, elles sont indétectables dans nos conditions expérimentales dans les CMSPs et présentes dans les cellules endothéliales fœtales ou adultes.
Figure 50 : Etude de l’expression des transporteurs d’efflux dans les CMSPs (en orange), les cellules
endothéliales cérébrales humaines fœtales (en rose), les capillaires endothéliaux humains adultes (en vert), par RT-PCR en temps réel
ABCB1 : gène codant pour la Pgp
3- Discussion
Le travail présenté dans ce chapitre rapporte la capacité de l’atazanavir, un inhibiteur de la protéase utilisé dans le traitement des patients infectés par le VIH, à réguler l’expression et la fonctionnalité de la Pgp et des MRPs, à la fois sur les lymphocytes et sur les cellules endothéliales cérébrales humaines. Il présente également la capacité de ce médicament à traverser la barrière hémato-encéphalique.
Cette étude a démontré qu’il n’y avait pas d’augmentation de l’expression de la Pgp et de la MRP1 dans les lymphocytes traités avec 5 µM d’ATV pendant 72 h (N=10). Bien qu’il n’ait aucun effet sur l’expression, l’ATV augmente la fonctionnalité de la Pgp, mais pas de la MRP1 dans les mêmes cellules.
De précédentes études ont montré que l’ATV pouvait interagir avec la Pgp et les MRPs, par inhibition directe de l’efflux d’un substrat spécifique (Rhodamine 123, carboxyfluorescéine) (Lucia et al., 2005 ; Storch et al., 2007). L’étude présentée ici, est complémentaire, elle renseigne sur la fonctionnalité des transporteurs après 72 ou 24 h de traitement. Perloff et ses collaborateurs ont démontré qu’un traitement prolongé des cellules LS180V avec de l’ATV (3-30 µM) peut augmenter la fonctionnalité de la Pgp.
Dans les cellules endothéliales cérébrales, nous avons montré à la fois une augmentation de l’expression de la Pgp et de la MRP1, et une augmentation de la fonctionnalité de la Pgp mais pas de des MRPs.
Les résultats sur l’expression des transporteurs au niveau de la BHE et au niveau de la circulation systémique sont donc différents. Différents modes de régulation des transporteurs pourraient intervenir à ces deux niveaux. La réponse cellulaire à l’ATV dépend peut-être du niveau d’expression des facteurs de transcription, tels que les récepteurs nucléaires « pregnane X receptor », qui peut être différent entre les barrières physiologiques et les cellules périphériques. La variabilité entre les types cellulaires peut être causée par des variations génétiques, à la fois sur le gène mdr1 (codant pour la Pgp), sur leur partenaires régulateurs, ou bien sur d’autres gènes impliqués dans la biodistribution de l’ATV (autres transporteurs ABC ou SLC, enzymes du métabolisme, protéine du milieu…).
Nous n’avons remarqué aucune différence dans l’expression du gène mdr1 au niveau des CMSPs et des cellules endothéliales cérébrales fœtales. Cependant la régulation de ce gène pourrait être différente en réponse au traitement dans les deux types cellulaires. Le récepteur nucléaire type PXR (PXR chez les rongeurs, SXR chez l’homme) est connu pour réguler l’expression de la Pgp (Rosenfeld et al., 2003). Il est exprimé dans les cellules endothéliales (Bauer et al., 2004) et dans les cellules mononucléées du sang périphérique (Siest et al., 2008 ; Albermann et al., 2005). Aucune donnée n’existe sur la différence d’expression du gène codant pour PXR entre les CMSPs et la BHE, mais par
exemple dans le foie, le gène pxr est deux fois plus exprimé que dans les CMSPs (Albermann et al., 2005).
L’induction de l’expression de la Pgp et de la MRP1, ainsi que de la fonctionnalité de la Pgp, au niveau des cellules endothéliales cérébrales pourrait participer à réduire l’efficacité de l’ATV dans le cerveau.
Afin de démontrer plus précisément que cette interaction peut influencer le passage de l’ATV de la circulation sanguine vers le SNC, nous avons utilisé un modèle in vitro de BHE humaine disponible au laboratoire. Ce modèle consiste en l’utilisation de co-cultures primaires de cellules endothéliales de capillaires cérébraux humains adultes, avec des cellules gliales provenant du même donneur. L’avantage de ce système est de s’affranchir des différences inter-espèces, inter-âges, et interindividuelles.
Un passage limité de l’ATV à travers le modèle de BHE (du compartiment apical, représentant le sang, vers le compartiment basal, représentant le SNC) est observé, en dépit de la nature hautement lipophile de la molécule. En effet, le flux d’ATV de B vers A est neuf fois plus élevé que celui de A vers B. Ce faible passage peut être dû au transport actif de l’ATV par la Pgp ou d’autres protéines d’efflux présents au niveau de la BHE.
En présence de PSC833 [valsopodar, un inhibiteur de la Pgp (Sadanand et al., 2003)], une diminution du transport de B vers A, de l’ATV, est observée. Ceci suggère que la Pgp est impliquée dans le transport de l’ATV. Cependant, beaucoup d’inhibiteurs de la Pgp inhibent également d’autres protéines d’efflux : le PSC833 à la concentration de 20 µM inhibe également les MRP1 et 2. Un prétraitement des cellules avec du probénécide [un inhibiteur des transporteurs d’anions organiques et des MRPs (Storch et al, 2007)] ou de KO-143 [un inhibiteur de la BCRP (Allen et al., 2002)] à la concentration de 20 µM, diminue la clairance de l’ATV. Bien que les inhibiteurs utilisés ne soient pas toujours spécifiques d’un seul transporteur, nos résultats suggèrent un recouvrement des propriétés de substrat de l’ATV vis-à-vis des transporteurs d’efflux (Pgp, MRPs, BCRP). Ces transporteurs pourraient jouer un rôle clé dans le passage de l’ATV dans le SNC, limitant son efficacité dans ce compartiment.
Les résultats de cette étude indiquent qu’un traitement avec de l’ATV induit l’expression de la Pgp et de la MRP1 dans les cellules endothéliales cérébrales, et augmente la fonctionnalité de la Pgp dans les
qu’en plus de son interaction avec la Pgp, l’ATV interagirait avec les MRPs et la BCRP au niveau de la BHE humaine, limitant ainsi son entrée dans le parenchyme cérébral.