A.1 Contexte scientifique et modèle expérimental

PM PM P/M

Méthylation normale locus H19/IGF2 ASMM RT-qPCR Méthylation normale locus H19/IGF2 ASMM RT-qPCR

A.1 Contexte scientifique et modèle expérimental

D’après le modèle murin, un effacement des marques épigénétiques, notamment au

niveau de la méthylation de l’ADN, a lieu lors de deux périodes du développement, la

première lors de la gamétogenèse et la seconde lors du développement

embryonnaire précoce, juste après la fécondation. Cette reprogrammation

épigénétique limiterait la transmission d’une épimutation, sous couvert que cette

dernière ne soit pas génétiquement déterminée.

Chez l’Homme les possibilités d’étudier cette reprogrammation épigénétique sont

très limitées, du fait de l’accessibilité des gamètes durant la période fœtale et des

possibilités restreintes de réaliser des analyses au cours du développement

embryonnaire. Néanmoins quelques données sont disponibles, obtenues à partir de

gonades fœtales et d’embryons humains donnés à la recherche et convergent vers

l’idée qu’une reprogrammation serait effective chez l’homme : diminution du niveau

de méthylation de l’ADN dans l’embryon préimplantatoire ainsi qu’au niveau des

cellules germinales fœtales (Kerjean et al., 2000 ; Wermann et al., 2010).

Cependant la publication, de 2 cas de transmission familiale de cancer colorectal

sans polypose liés à une hyperméthylation du promoteur MLH1 et MSH2 a

questionné la communauté scientifique et a largement contribué à alimenter le débat

sur le risque de transmission d’une épimutation chez l’homme (Chan et al., 2006;

Hitchins et al., 2007; Suter et al., 2004). Or depuis et grâce à l’avènement du

pan-génomique, des mutations génétiques ont pu être identifiées et rattachées à ces

défauts de méthylation : polymorphisme : c-27C>A et délétion du gène EPCAM

impliqués respectivement dans l’hyperméthylation du promoteur du gène MLH1 et

MSH2 (Hitchins et al., 2011; Ligtenberg et al., 2009).

Le cas tout à fait exceptionnel d’un patient présentant un syndrome de Silver-Russell

(SRS) en désir de paternité nous a permis d’aborder la question de la

reprogrammation épigénétique chez l’homme. En effet 60% des cas de SRS sont liés

à une hypométhylation de la région contrôlant l’empreinte ICR1 du locus H19/IGF2,

sans que des facteurs cis ou trans n’aient pu être rattachés à ce jour (Gicquel et al.,

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extraordinaire d’étudier le risque de transmission d’une épimutation primaire chez

l’homme, du fait de la rareté des pathologies liées à l’empreinte paternelle (fréquence

du SRS estimée à 1/100 000) et de la possibilité d’analyser les gamètes du patient.

Dans un premier temps, nous nous sommes concentrés à caractériser cette

épimutation : localisation, intensité, à déterminer son caractère primaire ou

secondaire en recherchant des facteurs trans et cis associés (séquençage, exome).

Il était important de réaliser ces analyses sur plusieurs types cellulaires, issus de

dérivés embryologiques différents (sang, salive, peau, urine), afin d’évaluer la

présence d’un mosaïcisme somatique.

Ainsi le statut hypométhylé de l’ICR1 du locus H19/IGF2 et du promoteur H19

localisé sur la région 11p15 mis en évidence par ASMM-RTqPCR (allele-specific

methylated multiplex real-time quantitative PCR) (index de méthylation de 21 et 19

respectivement pour des valeurs normales : 47-54 moy+/- SD) a pu être confirmé par

clonage séquençage après traitement de l’ADN au bisulfite (cellules sanguines):

perte du niveau de méthylation de 50% en comparaison à un témoin apparié sur

l’âge. Après analyse par pyroséquençage de l’ADN bisulfité, l’hypométhylation a été

retrouvée sur les différents types cellulaires analysés suggérant une origine

somatique de ce défaut de méthylation. De plus, cette hypométhylation s’est avérée

être étendue à la région 5’ de l’ICR1 touchant les DMR0 et DMR2 du gène IGF2,

néanmoins moins prononcée sur ces sites distaux (notamment au niveau des

cellules sanguines). De plus, nous avons pu éliminer une altération multiloci en

testant par pyroséquençage le niveau de méthylation de 9 DMRs: 8 soumises à

empreinte maternelle (KCNQ1OT1- MEST -PEG3- SNRPN- IGF2R- ZAC1- GRB10)

et une à empreinte paternelle (GTL2). Toutes présentaient un niveau de méthylation

normal.

Nous avons ensuite évalué le caractère primaire ou secondaire de cette épimutation.

Tout d’abord nous avons exclu l’implication d’une isodisomie uniparentale maternelle

des chromosomes 7 et 11 par analyse de marqueurs de microsatellites (D7S2201,

D7S1824, D7S505, D7S513, D7S1870, D7S640, D7S820, D7S636, D7S1818) et

éliminé une délétion ou duplication de la région 11p15 par CGH-array et par analyse

de CNV (copies number variation) grâce à la Multiplex Ligation-dependent Probe

Amplication (MLPA).

Nous avons ensuite recherché des variations nucléotiques en cis: au niveau de

l’ICR1, du promoteur, des exons 1 à 5 et des enhancers du gène H19, par

séquençage sanger, en portant une attention particulière sur des motifs connus pour

influencer le statut de méthylation de l’ADN : CTCF, OCT4 et OCT4/SOX2 et ZFP57.

Aucune variation génétique en cis de la région 11p15 n’a été observée. Puis, nous

avons étendu notre analyse à la recherche de potentiels facteurs en trans grâce à

l’analyse de l’exome, en regardant particulièrement les facteurs impliqués dans

l’établissement, le maintien et la lecture des marques épigénétiques ou encore ceux

impliqués dans les pathologies liées à l’empreinte. Certaines variations ont été

identifiées mais sans qu’elles soient reconnues comme pathologiques d’après les

données publiques disponibles (SNP database).

Ces résultats nous ont conduit à conclure à la présence d’une probable épimutation

primaire, partielle (perte de 50% du niveau de méthylation), localisée spécifiquement

au niveau du locus H19/IGF2 et probablement d’apparition précoce au cours du

développement car présente sur l’ensemble des types cellulaires analysés.

Pour évaluer le risque de transmission à sa descendance, nous avons analysé le

niveau de méthylation du locus H19/IGF2 des spermatozoïdes du patient, et les

spermatozoïdes d’un homme fertile apparié sur l’âge ont été utilisés comme

Père du patient ^{Témoin fertile}