A l’échelle de la feuille en conditions contrôlées

L’expérience est réalisée au centre de recherche en écologie expérimentale et prédictive, le CEREEP-Ecotron IleDeFrance, sur le site de Foljuif de l’Ecole Normale Supérieure (Seine et Marne). Le système Ecotron permet d’étudier la dynamique des écosystèmes sous des régimes climatiques divers et de différentes intensités. Le confinement du mésocosme couplé à l’application de conditions climatiques contrôlées permet d’induire des contraintes abiotiques et d’étudier les interactions entre les processus écologiques et physiologiques. Un Ecolab (Fig. 16) est composé de 3 cellules environnementales couplées à un bureau de

contrôle permettant d’agir sur les différentes variables étudiées. Les 3 cellules (13 m3

par cellule) fonctionnent de manière indépendante ce qui permet des études distinctes ou l’usage de réplicas.

53

Fig. 16 : Plateforme de l’écotron composée de plusieurs écolab, chaque écolab est composé de 3 cellules.

La température, l’humidité, la lumière, l’eau et le contenu en gaz sont des variables indépendantes et sont contrôlées par ordinateur. Pour l’expérience, un pattern diurne de 24 heures est appliqué, comprenant 10 heures de lumière (POWERSTAR HQI-BT 400W/D PRO, OSRAM, Molsheim, France) et 14 heures d’obscurité. La température des trois cellules est maintenue à 25°C pendant la phase de jour et à 17°C pendant la phase de nuit. L’humidité relative reste constante à 60% dans les cellules qui ne subissent pas de variation de VPD. Concernant les gaz atmosphérique, le dioxyde de carbone est à une concentration de 350 ppm avec un contenu en dioxygène de 21%.

La première cellule est le contrôle de l’expérience, les paramètres y restent constants au cours de l’expérience. La seconde cellule constitue le traitement humidité, qu’on appellera « RH » et est paramétrée afin d’établir un gradient de déficit en vapeur d’eau (VPD) dans l’air allant de 80 à 30%, par pallier de 10%, au cours de la durée de l’expérience afin d’induire un déficit en eau par l’atmosphère. La troisième cellule « OZ » a été aménagée afin de permettre une injection d’ozone et de maintenir une concentration de 100 ppb pendant 4 heures par jour.

Un système d’injection d’ozone a été implémenté à une cellule Ecolab afin de réaliser cette expérience (Fig. 17). Ce système est composé d’un générateur d’ozone (Ozone

54

Generator C-Lasky series C-L010-DT, AirTree Ozone Technology Co, Baunatal, Allemagne) relié à une bonbonne de dioxygène. Un débitmètre massique permet de réguler la quantité de dioxygène amenée au générateur à l’aide d’une liaison RS 232 de contrôle commande en série avec l’ordinateur. Le générateur est relié à l’ordinateur par une liaison « Analog » permettant d’imposer une consigne pour la génération d’ozone. La concentration d’ozone de la cellule est suivi à l’aide d’un analyseur (Ozone Monitor Models 106-L, 2B Technology, Boulder, Colorado, USA) d’une résolution de 0.1 ppb. L’acquisition de la concentration en ozone s’effectue toutes les 10 secondes pendant toute la durée de l’expérimentation.

Fig. 17 : Schéma du système expérimental réalisé afin d’injecter de l’ozone dans une cellule de l’Ecolab.

De jeunes plants en pot de 2 ans de chêne (Quercus robur L.) et de chêne vert (Quercus

ilex) sont séparés dans 3 cellules, à raison de 7 pots de chaque espèce dans chaque cellule de

l’Ecolab, afin d’introduire différentes conditions environnementales, et acclimatés aux cellules 2 semaines avant le début de l’expérience. L’expérience dure 5 semaines afin de tester l’impact de stress chroniques sur les plantes et afin d’introduire un gradient de stress. Au cours de l’expérience et pour chaque cellule, des mesures de propriétés biochimiques,

55

physiologiques et optiques ont été réalisées. Concernant les mesures biochimiques, le suivi de la concentration en chlorophylle, en xanthophylles et en flavonols a été effectué. La quantité de chlorophylle dans les feuilles est mesurée à l’aide d’un SPAD-502 (Konica-Minolta, Carrière-sur-Seine, France), d’un DUALEX® SCIENTIFIC (FORCE-A Dualex meter, Orsay, France), qui mesure également le contenu en flavonoides, et par des mesures spectrométriques au laboratoire. Les xanthophylles sont quantifiées par UPLC (Annexe 1). Les propriétés physiologiques sont mesurées grâce à la fluorescence chlorophyllienne à l’aide du PAM-2500

(pour pulse-amplitude-modulated, PAM2500, Walz, Effertlich, Germany) et par un poromètre

pour mesurer la conductance stomatique des feuilles (Decagon devices, Inc, Pullman,

Washington, USA). Une fibre optique, permettant de mesurer la réflectance des feuilles sur la

même zone que la mesure de fluorescence chlorophylienne, a été ajoutée à la pince PAM-2500. La fibre optique est connectée à un spectromètre (ASEQ, LR1-T spectrometer, 300-1000 nm, 50 nm resolution, TEC module, - 1m 600µm core VIS-IR fiber, Vancouver, Canada) permettant de réaliser en moyenne 7 spectres par seconde. Les mesures de propriétés optiques ont concernés les spectres de réflectance dans les bandes du PRI (Eq. 4) et du

mNDI705 (Eq. 1).

Les feuilles échantillonnées sont au nombre de 10 par espèce et par jour. Les mesures biochimiques (chlorophylle, favonols) et physiologiques (conductance stomatique) réalisées à l’aide des appareils portatifs sont effectuées puis les feuilles sont enveloppées dans de l’aluminium et laissées 8 heures à l’obscurité. Le lendemain, les mesures sont réalisées sur ces mêmes feuilles afin d’étudier leurs caractéristiques en absence de lumière. A l’obscurité, après avoir enlevé la feuille d’aluminium, la fluorescence minimum (Fo) est mesurée. Puis

une faible lumière (100 µmol m-² s-1 de PAR sur la feuille) est appliquée à l’aide d’un

panneau LED (LED PLC230V303-BN, CONRAD, 20W, 4000K) permettant de mesurer les spectres foliaires à très faible lumière. Enfin une mesure de référence est réalisée sur un spectralon 98% avec la même configuration que pour les mesures foliaires (Fig. 18).

56

Deux protocoles distincts sont réalisés. La moitié des feuilles échantillonnées sont instantanément plongées dans l’azote liquide et seront préservées à -80°C, lyophilisées et broyées pour des mesures biochimiques ultérieures.

L’autre moitié des feuilles est utilisée pour étudier les réponses des feuilles aux variations de PAR concernant le PRI et la fluorescence chlorophyllienne. Une cinétique de 6 minutes avec des niveaux de PAR croissants puis décroissants est réalisée en lumière actinique rouge avec le PAM-2500 afin d’éviter les variations de réflectance issues de la lampe dans les longueurs d’onde utilisées pour le calcul du PRI. Les spectres sont acquis toutes les secondes et les mesures de fluorescence sont acquises toutes les minutes, sur la même zone de la feuille.

Après 2 semaines d’expérimentation, 3 pots de chaque espèce sont changés de cellule et mis dans les cellules comportant un autre traitement afin d’étudier l’impact de la succession de stress sur les propriétés des feuilles. Ainsi, 6 pots (de chaque espèce) de la cellule du traitement « HR » sont placés dans la cellule du traitement « OZ » et 6 pots de la cellule du traitement « OZ » sont placés dans la cellule « HR » (Fig. 19).

Fig. 18: Design expérimentale : Un clip de feuille pour mesurer la fluorescence chlorophyllienne couplé à un système de mesure optique avec la même zone de mesure : Pour une mesure de référence

57 DOY 203 204 205 210 211 212 217 218 219 224 225 226 231 232 233 Control RH OZ RH_OZ OZ_RH

Fig. 19 : Design temporel des traitements échantillonnés pour chaque cellule. RH concerne le traitement lié au stress hydrique atmosphérique, OZ concerne le traitement lié à l’ozone, RH_OZ concerne le traitement avec les pots qui subissent un stress OZ après un stress RH et OZ_RH concerne

le traitement avec les pots qui subissent un stress RH après un stress OZ.