Étude histologique et cytochimique des BCs

a. Film du détachement des BCs de pois et de soja

Afin d’apprécier ce détachement des BCs et d’observer la structure formée par le RET, un stéréomicroscope (Leica M125) a été utilisé. Toutes les étapes suivantes sont réalisées en champ sombre à l’aide de ce dernier, afin de minimiser la déshydratation du prélèvement. Ainsi, les racines sont prélevées à l’aide de pinces ultrafines, déposées sur des lames cotées à la Poly-L-Lysine (Thermo Scientific), puis scotchées sur la lame afin d’éviter tout mouvement lors de l’expérimentation. Le film est ensuite démarré et 100 µL sont déposés sur l’apex racinaire afin d’observer le détachement des BCs. Le film ainsi obtenu sur le logiciel Leica LAS Core peut être alors fractionné et accéléré par ce même logiciel. Pour cette expérimentation, 3 à 4 répliquats techniques et 4 à 6 réplicats biologiques ont été réalisés.

b. Morphotype et localisation des BCs

Les différents morphotypes de BCs et leurs localisations peuvent être observés grâce à la méthodologie précédente (d’après Matériel et Méthodes.III.2.a). Néanmoins, pour les aspects qualitatifs et quantitatifs, un microscope inversé en champ clair (Leica DMI6000B) a été utilisé. Pour cette technique, les racines sont prélevées à l’aide de pinces ultrafines (Fig. 51B), puis

Figure 51 :Technique de dissection de l’extrémité racinaire de P. sativum pour une conservation optimale

des BCs.

(A) Dispositif de culture de pois après 7 jours d’incubation. (B) La pointe racinaire est sectionnée et recueillie à l’aide de deux pinces ultrafines. (C) Observations microscopiques d’un apex racinaire de pois et du RET associé. A : Apex racinaire; BCs : Border cells.

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placées sur des lames cotées à la Poly-L-Lysine. Deux dépôts de 30 µL d’eau distillée sont déposés à chaque extrémité de la lame, puis 30 µL sont ajoutés sur l’apex racinaire (Fig. 52). Une lamelle (50x60mm, Thermo Scientific) est déposée sur l’échantillon puis scotchée sur la lame à l’aide de scotch anapore. La quantité de liquide est ajustée par capillarité, des extrémités vers le centre de l'échantillon. Les échantillons sont ensuite observés sous microscope inversé en champ clair (DMI6000B). Pour cette expérimentation, 3 à 4 répliquats techniques et 4 à 6 réplicats biologiques ont été réalisés.

Afin de s’affranchir de l’épaisseur de la racine limitant les mesures de la taille des BCs, un nouveau dispositif a été mis en place utilisant des lames 10 puits épaissies au téflon (Thermo Scientific, Réf : ER-208B-CE24). Les racines prélevées sont placées dans chacun des puits, puis complétées par 10 µL d’eau distillée. Les racines sont incubées pendant 5 min dans la gouttelette afin d’initier le détachement des BCs. Les racines sont légèrement agitées pour en détacher l’ensemble du RET qui se retrouve dans le puit correspondant. L’ensemble de la lame est observé au microscope inversé en champ clair (DMI6000B) et les cellules observées sont ensuite mesurées à l’aide du logiciel Leica LASCore. Pour cette expérimentation, 3 à 4 répliquats techniques et 4 à 6 réplicats biologiques ont été réalisés.

Figure 52 :Représentation schématique des dépôts de liquide sur la lame avant

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c. Viabilité des BCs

La viabilité des BCs de soja a été observée à l’aide de la sonde fluorescéine diacétate (FDA) (SIGMA, Réf : F7378) qui, sous l’action d’une lipase cytoplasmique, est dégradée entrainant alors la fluorescence de la cellule vivante. Une solution stock de FDA est préparé à 5 mg/mL dans de l’acétone (96%) et peut être conservée pendant 6 mois à 4 °C. La solution de travail, quant à elle, est utilisée à 0,1 mg/mL diluée dans du tampon phosphate salin (PBS = Phosphate

Buffer Salin) (0.01 M : NaCl 137 mM, KCl 47 mM, KH2PO4 1.5 mM et Na2HPO4(H2O)12 7 mM ; pH 7.2).

Dans cette étude, les racines prélevées ont été placées dans chaque puits des lames 10 puits épaissies au téflon (Thermo Scientific, Réf : ER-208B-CE24) (Fig. 51B). Chaque puits est complété de 20 µL de PBS pendant 5 min afin d’initier le détachement de BCs. Le liquide est ensuite retiré à l’aide d’une micropipette Eppendorf de P200 en prélevant à l’extrémité sectionnée de la racine (Fig. 53).

Les 10 µL de la solution de travail sont ajoutés sur chaque racine pour être incuber à l’obscurité et à température ambiante (RT) pendant 3 min en chambre humide (Fig. 54). Les racines sont légèrement agitées et retirées du dispositif afin d’éviter que leur fluorescence ne masque celles des BCs. Une lamelle (50x60 mm, Thermo Scientific) est déposée sur la lame puis scellée à l’aide de scotch anapore. Les échantillons sont ensuite observés au microscope à épifluoresence inversé (DMI6000B) équipé du filtre Leica L5 (excitation : 480-520 nm ; émission : 530-560 nm). Les acquisitions sont prises en fluorescence, mais également en lumière transmise, et les cellules observées sont ensuite comptées et mesurées à l’aide du logiciel Leica LASCore.

Figure 53 :Technique de préparation de

l’extrémité racinaire de P. sativum pour une conservation optimale des BCs. Le liquide est doucement et lentement retiré du puits à l’aide d’une pipette pour éviter la perturbation du RET.

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d. Lugol

La coloration au Lugol (SIGMA, Réf : 62650) permet de marquer spécifiquement l’amidon présent dans un échantillon en les colorant en bleu. Les racines prélevées ont été placées dans chaque puits des lames 10 puits épaissies au téflon (Thermo Scientific, Réf : ER-208B-CE24) (Fig. 51B), avant d’être complétées par 20 µL de PBS pendant 5 min pour initier le détachement des BCs. Le liquide est ensuite retiré à l’aide d’une micropipette Eppendorf (P200) en prélevant à l’extrémité sectionnée de la racine (Fig. 53). La solution de Lugol, utilisée pure, est ajoutée sur chaque racine et incubée à température ambiante (RT) pendant 5 min. Les racines sont légèrement agitées et retirées du dispositif pour n’obtenir que les BCs. La lamelle (50x60 mm, Thermo Scientific) est déposée, puis scellée à la lame à l’aide de scotch anapore. Les échantillons sont ensuite observés au microscope inversé en champ clair (DMI6000B). Pour cette expérimentation, 3 à 4 répliquats techniques et 4 à 6 réplicats biologiques ont été réalisés.

Figure 54 : Photographie d’une

chambre humide.

Dispositif composé d’une boîte de pétri carrée contenant du papier filtre humide pour conserver l'humidité de l’échantillon.

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