Etude du rôle des lymphocytes T régulateurs dans la régulation des réponses immunes antitumorales induites par vaccination

UNIVERSITE LIBRE DE BRUXELLES Faculté de Médecine

IRIBHM-LCCE

Etude du rôle des lymphocytes T régulateurs dans la régulation des réponses immunes antitumorales induites par vaccination

Thèse présentée par

Lise NUTTIN

En vue de l’obtention du grade légal de

Docteur en Sciences Biomédicales et Pharmaceutiques

Promoteur : Pr. Thierry Velu

Co-promoteur: Dr. Catherine Bruyns

Année académique 2010-2011

Ce travail a pu être réalisé grâce au soutien financier de la fondation

Rose et Jean Hoguet ainsi qu’aux fonds de la fondation David et Alice

Van Buuren et de la fondation de Meurs François.

Remerciements

Un tout grand merci à tous ceux qui ont contribué de près ou de loin à la réalisation de cette thèse et surtout à ceux qui ont cru en moi.

Je tiens tout d’abord à remercier très sincèrement les professeurs Gilbert Vassart et Marc Parmentier de m’avoir accueillie au sein de l’IRIBHM.

Je remercie le professeur Thierry Velu pour l’accueil au sein de son laboratoire.

Un tout grand merci à ma directrice de recherche Catherine, sans qui rien de tout cela n’aurait été possible. Tu m’as guidée et enseigné durant ces quatre années de doctorat.

Merci pour tes conseils, ton suivi rigoureux et ta patience à mon égard.

Merci à la ‘Team Ophtalmo’ qui sont toujours là pour rire. Vous m’avez tous donné de très bons conseils et encouragée dans les moments difficiles. François, nos dos à dos me manquent déjà! Lia et Valoche vous avez toutes les deux été toujours là pour moi durant ces années, merci encore pour votre bonne humeur et votre soutien!

Merci à Maya et Cath, sans vous cette thèse aurait été beaucoup moins enjouée. Vous êtes toujours prêtes à bavarder et à rigoler. Vous étiez les premières à me conseiller aussi bien pour le labo que dans la vie. La culture cellulaire aurait été moins drôle sans vous.

Merci à la ‘Team Communi’ pour l’ambiance et les discussions manips et aussi pour l’accueil au sein du C5.111 lors de la rédaction. J’aimerais remercier tout particulièrement Nathalie qui m’a encouragée tout au long de ma thèse. Tu as toujours été là pour parler immuno et m’orienter dans mes recherches tout comme discuter fringues et bons plans. ☺

Merci à Greg qui a été là au début et à la fin. Tu m’as initiée à la recherche et tu as toujours su donner de bons conseils en manip.

Merci aussi a Liliane, Olivier, Abdel qui m’ont conseillée depuis le début de ma thèse.

Merci aux amis du midi : Lari, Gilles, Léa, Amé, Giu,… Grâce à vous, le labo, ce n’était pas juste le boulot, c’était aussi les rires et les ragots durant les pauses midi. Un petit plus à Larissa qui a toujours su m’inspirer (je pense que certains comprendront…).

Merci à Maman qui m’a soutenue et a toujours été une oreille attentive à mes travaux. Tu as su me guider scientifiquement comme humainement durant tout mon parcours universitaire.

Fabian tu as toujours été au bout de ton téléphone ou devant un petit dej’ au Belga pour m’écouter et t’intéresser. Un tout grand merci !

Merci à Kath qui a toujours été là pour parler immuno avec moi pendant des heures sans que personne autour de nous ne comprenne ce qu’on raconte, j’espère que ça continuera!

Merci à mes amis Mag et Aline d’avoir toujours été à l’écoute.

Merci à Ophélie, grâce à toi, je maîtrise l’orthographe et les tournures de phrases!

Merci à Alex d’avoir toujours été là. Tu as su garder ton calme, gérer mon stress et su me soutenir durant ces années de thèse.

Liste des abréviations

AAV Ac/b Ad Ag AP1 APC ARTC- BCG BM-DC CCL CCR CLR CXCR- COX- CTL CTLA-4 CY DC DC-SIGN EGFP ELISA

FACS FITC Foxp3 GITR GM-CSF

Gy HLA HSC HSP IDO IFN Ig IL IPEX

Adeno associated virus Anticorps/Antibody Adénovirus

Antigène/Antigen Activator protein 1 Antigen Presenting Cell Antigen Recognized by T Cells Bacille Calmette-Guérin Bone marrow Dendritic cell Chemokine (C-C motif) ligand CC-Chemokine Receptor C-type lectin receptors

chemokine (C-X-C motif) receptor- cyclo-oxygénase-

Cytotoxic T lymphocyte

Cytotoxic T-Lymphocyte Antigen- 4 Cyclophosphamide

Dendritic cell

Dendritic Cell-Specific ICAM- Grabbing Non-integrin Enhanced Green Fluorescent Protein

Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay

Fluorescence Activated Cell Sorting Fluooscein Iso-ThiCyanate

Forkhead Box P3

glucocorticoid-induced TNFR- related protein

Granulocyte-macrophage colony- Stimulating Factor

Gray

Human Leukocyte Antigen Hematopoietic Stem Cells Heat shock protein

Indoleamine 2,3 dioxygenase Interferon

Immunoglobulin(e) Interleukin(e)

Immunodysregulation

Polyendocrinopathy Enteropathy X- linked syndrome

iTreg

LB LFA

LPS LT MDR MDSC MHCI MHCII

MLR NFAT NFκκκκB NK NKT NO nTreg

Ontak PAMP

PD-1 pDC PDL1 PE PEO PGE2

PI- PLGA PPO PRR qRT-PCR

RE RORγγγγt

qRT-PCR s.c.

i.c.

SIRP

Induced Lymphocyte T régulateur Lymphocytes B

Lymphocyte Function-associated Antigen

Lipopolysaccharide Lymphocyte T Multi Drug resistant

Myeloid derived suppressor cell Major histocompatibility complex class I

Major histocompatibility complex class II

Mix Lymphocyte reaction

Nuclear factor of activated T-cells Nuclear factor κB

Natural killer Natural killer T Nitric oxid

Lymphocyte T régulateur naturel Denileukin diftitox

Pathogen-Associated Molecules Patterns

Programmed Death-1 plasmacytoïd Dendritic cell Programmed Death Ligand 1 Phycoérithrine

polyoxyéthylène Prostaglandine E2 Proteinase inhibitor poly(lactic-co-glycolic acid) polyoxypropylène

Pattern-Recognition Receptor Quantitative reverse transcription- polymerase chain reaction

Reticulum endoplasmique Retinoic acid receptor related Orphan Receptor γt

RT-PCR quantitative Sous-cutané

Intra-crânien

Signal Inhibitory Regulatory Protein

TAA TAM TAP

TCR Teff

Tfh TGF-ββββ TH

Th3 TIL TMZ TNF(R) Tr1 TRAIL

Treg

TUNEL VEGF(R-2)

Tumor Associated Antigen Tumor Associated Macrophage Transporter Associated with Antigen Processing

T cell receptor

Lymphocyte T effecteur LT folliculaires

Transforming Growth Factor-β Lymphocyte T helper

Lymphocyte T helper 3 Tumor Infiltrating Lymphocyte Témozolomide

Tumor necrosis factor(Receptor) Lymphocyte T regulateur de type 1 TNF-Related Apoptosis-Induced Ligand

Lymphocyte T régulateur Terminal deoxynucleotidyl

transferase dUTP nick end labeling Vascular Endothelial Growth Factor receptor-2

Table des matières

INTRODUCTION _________________________________________________________ 1

1. Le cancer : généralités _____________________________________________________________ 1 2. La réponse immunitaire ____________________________________________________________ 2

2.1 L’immunité innée _______________________________________________________________ 2 2.2 Immunité adaptative ____________________________________________________________ 3 2.2.1 Les lymphocytes B_________________________________________________________________ 3 2.2.2 Les lymphocytes T _________________________________________________________________ 4 2.2.2.1 Les lymphocytes T « helper » CD4⁺ (figure 3) ________________________________________________ 4 2.2.2.2 Les lymphocytes T régulateurs ___________________________________________________________ 5 2.2.2.2.1 Les lymphocytes T régulateurs naturels __________________________________________________ 7 2.2.2.2.2 Les lymphocytes T régulateurs induits ___________________________________________________ 7 2.2.2.2.3 La fonction suppressive des lymphocytes T régulateurs _____________________________________ 8 2.2.2.3 Les lymphocytes T cytotoxiques CD8⁺ ____________________________________________________ 10

2.2.3 Les cellules présentatrices d’antigène ________________________________________________ 10 2.2.3.1 Les cellules dendritiques _______________________________________________________________ 11

2.2.3.1.1 Maturation et migration _____________________________________________________________ 12 2.2.3.1.2 Présentation antigénique et activation des lymphocytes T _________________________________ 13 2.2.3.1.3 Les cellules dendritiques de rat _______________________________________________________ 14

3. La réponse immune antitumorale __________________________________________________ 14 3.1 L’immunosurveillance et l’immuno-édition __________________________________________ 15

3.2 Mécanismes d’échappements tumoraux ___________________________________________ 16 3.2.1 Mécanismes intrinsèques aux cellules tumorales _______________________________________ 16 3.2.2 Mécanismes extrinsèques aux cellules tumorales _______________________________________ 17 3.2.3 Les lymphocytes T régulateurs dans un contexte tumoral _________________________________ 19 3.2.3.1 La spécificité antigénique des Treg dans le cancer ___________________________________________ 20

3.2.4 Les cellules dendritiques associées aux tumeurs ________________________________________ 21 4. L’immunothérapie antitumorale____________________________________________________ 22

4.1 Historique ____________________________________________________________________ 22 4.2 Identification d’antigènes tumoraux _______________________________________________ 23 4.2.1 Vaccination antigènes spécifiques ___________________________________________________ 24 4.3 Les anticorps monoclonaux ______________________________________________________ 25 4.4 Vaccins utilisant ou induisant des cytokines _________________________________________ 26 4.4.1 Cytokines seules _________________________________________________________________ 26 4.4.2 Cellules sécrétrices de GM-CSF en vaccination _________________________________________ 27 4.5 Méthodes de transfert de gène ___________________________________________________ 28

4.5.1 Les vecteurs viraux _______________________________________________________________ 28 4.5.2 Les polymères, microsphères et nanosphères __________________________________________ 29 4.6 Transfert adoptif _______________________________________________________________ 31 4.7 Vaccins de cellules dendritiques __________________________________________________ 32 4.8 Ciblage des lymphocytes T régulateursen immunothérapie du cancer ____________________ 34 4.8.1 Inhibition des lymphocytes T régulateurs en ciblant le CD25 ______________________________ 35 4.8.2 Ciblage des fonctions des lymphocytes T régulateurs ____________________________________ 35

4.8.3 Empêcher la migration des lymphocytes T régulateurs au sein de l’environnement tumoral _____ 36 4.8.4 Inhibition de la prolifération des lymphocytes T régulateurs par administration métronomique de cyclophosphamide ou de témozolomide _____________________________________________________ 36 4.8.5 Modulation de la prolifération des lymphocytes T régulateurs _____________________________ 37 4.9 Thérapies combinées ___________________________________________________________ 38 5. Modèle expérimental : les vaccins DC / 9LmGM-CSF ___________________________________ 39

OBJECTIFS DU TRAVAIL __________________________________________________ 41

RÉSULTATS ___________________________________________________________ 42

1. Identification des lymphocytes T régulateurs de rat ____________________________________ 42 2. Rôle des lymphocytes T régulateurs dans l'efficacité thérapeutique des vaccins combinés ____ 45 3. Rôle des lymphocytes T régulateurs dans les vaccins de cellules dendritiques ______________ 48 4. Modèle de vaccination ‘tout in vivo’ ________________________________________________ 51

DISCUSSION ET PERSPECTIVES ____________________________________________ 53

BIBLIOGRAPHIE ________________________________________________________ 67

TABLE DES MATIÈRES ___________________________________________________ 82

1

1. Le cancer : généralités

Le cancer est une pathologie propre aux organismes complexes tels que les mammifères. En 2004, 7,4 millions de décès par le cancer ont été recensés, ce qui représente 13% de la mortalité mondiale annuelle selon les données de l’ O.M.S (figure 1 et 2). D’ici 2030, le nombre de décès causés par le cancer devrait poursuivre sa progression et toucher environ 12 millions de personnes. Cette augmentation serait due à des facteurs environnementaux ou liée aux modes de vie (ex : tabac), ainsi que, dans certains cas, au vieillissement de la population¹. Dans ce contexte, il semble donc indispensable de mettre au point de nouvelles thérapies et d’élucider les mécanismes sous-jacents.

Le cancer est un processus évolutif mettant en jeu des générations successives de cellules ayant acquis des anomalies génétiques de différenciation et du contrôle de la croissance, mais également une résistance à l’apoptose. Ces anomalies résultent d’altérations au niveau des gènes suppresseurs de tumeurs et de gènes stabilisant le génome ainsi que de l’activation de proto-oncogènes présents dans les cellules normales en oncogènes capables de conférer un phénotype malin à la cellule².

Certaines études ont postulé que les tumeurs sont composées d'une population hétérogène de cellules comprenant une faible proportion de cellules souches cancéreuses qui ont la capacité de s'auto-renouveler et de proliférer. Elles sont responsables du potentiel de croissance et de progression de la tumeur³. Toutefois, une hypothèse alternative, le modèle stochastique, postule lui que toutes les cellules tumorales ont la capacité de se renouveler mais que c'est la probabilité qu’une cellule tumorale particulière entre en cycle cellulaire et trouve un environnement permissif pour croître qui est variable⁴. Au cours de l'évolution de la maladie, certaines cellules tumorales peuvent migrer de la tumeur primaire, pénétrer dans les vaisseaux lymphatiques et sanguins pour former des métastases à distance. Les tumeurs primaires sont couramment traitées par une combinaison de thérapies dites « classiques » comprenant la

Figure 1

:

Figure 2 : Incidence du cancer. Représentation des cas de cancer chez l’homme et chez la femme dans le monde en 2004. D’après les données de l’O.M.S.

2 chirurgie, la radiothérapie locale et la chimiothérapie. Cependant, des micrométastases de cellules tumorales dormantes peuvent fréquemment mener à une rechute et un échec thérapeutique. C’est pourquoi, il importe de développer des stratégies visant à stimuler la réponse immune afin d’obtenir une rémission totale².

2. La réponse immunitaire

Les mécanismes de défense développés par le système immunitaire pour contrer les agents pathogènes sont multiples et variés et peuvent être séparés en deux types: l’immunité innée, basée sur une réponse immédiate non spécifique, responsable de la protection initiale, et l’immunité adaptative qui nécessite la reconnaissance spécifique de l’agent pathogène. Cette dernière réaction se développe plus lentement et met en œuvre une défense tardive plus efficace.

2.1 L’immunité innée

L’immunité innée ou naturelle constitue la première ligne de défense de notre organisme. Elle est constituée d’un ensemble de barrières physiques et chimiques ainsi que d’acteurs cellulaires qui évitent l’entrée et la diffusion de pathogènes dans l’organisme. Cette réaction non spécifique, préexiste à l’entrée du pathogène dans l’organisme et n’est pas modifiée par un contact répété avec ce même pathogène. Si des éléments étrangers réussissent à passer les épithélia et à pénétrer dans les tissus ou dans la circulation, ils sont reconnus par différentes cellules telles que les macrophages, les granulocytes, les cellules « Natural Killer » (NK) qui sécrètent divers facteurs solubles tels que les défensines, les interférons et les protéines du complément. Ces cellules captent les microorganismes et/ou les détruisent. Elles utilisent des systèmes de reconnaissance primitifs et non spécifiques. En effet, les cellules de l’immunité innée ne possèdent pas de récepteurs spécifiques d’un antigène (Ag) mais expriment des récepteurs PRR (Pattern-Recognition Receptors) qui reconnaissent des structures moléculaires appelées PAMP présentes à la surface du pathogène (Pathogen-Associated Molecules Patterns)⁵. Les cellules dendritiques (DC) qui expriment aussi des récepteurs aux PAMP sont

Introduction

3 mobilisées lors des réponses immunes innées et adaptatives et font donc le lien entre ces deux types de réponses.

2.2 Immunité adaptative

L’immunité adaptative est un mécanisme de défense acquis et spécifique qui se développe plus tardivement. Quatre propriétés fondamentales la caractérisent: la spécificité antigénique, la diversité des antigènes reconnus, la mémoire immunitaire et la discrimination du soi et du non- soi. Elle est médiée par les lymphocytes qui proviennent de cellules souches présentes dans la moelle osseuse et qui maturent durant l'ontogénèse dans les organes lymphoïdes centraux, le thymus pour les lymphocytes T (LT) et la moelle osseuse pour les lymphocytes B (LB) avant de gagner la circulation et les organes lymphoïdes périphériques où ils reconnaissent les antigènes via des récepteurs spécifiques.

2.2.1 Les lymphocytes B

Les LB assurent l’immunité humorale de par leur capacité à produire des anticorps (Ac) spécifiques d'antigènes. Les premières étapes du développement des lymphocytes B ont lieu dans la moelle osseuse et sont définies par le réarrangement séquentiel et l’expression des gènes des chaînes lourdes et légères d’immunoglobulines (Ig). Les LB immatures expriment une IgM complète membranaire. Ces LB immatures subissent dans la moelle une sélection négative qui élimine toutes les cellules potentiellement dangereuses capables de reconnaître et de réagir contre les antigènes du soi ubiquitaires. Les LB immatures continuent ensuite leur différenciation dans la moelle ou dans la rate pour devenir des LB matures exprimant les immunoglobulines membranaires IgM et IgD. Ils migrent alors vers les organes lymphoïdes périphériques où le contact avec l’Ag peut avoir lieu. La liaison de l'antigène va activer le LB naïf, déclencher sa prolifération et induire sa différenciation soit en plasmocyte qui sécrète des Ac spécifiques en quantité importante, soit en LB mémoire.

Figure 3 : Différentiation des T_H CD4⁺. Plusieurs sous-types de LT ont été découverts. Suite à la reconnaissance d’un Ag, les LT naïfs provenant du thymus s’activent et se différencient en plusieurs sous-types ayant des fonctions différentes et sécrétant des cytokines caractéristiques. Adapté de O'Shea J.J et al, 2010.

Introduction

4 2.2.2 Les lymphocytes T

Les LT sont impliqués dans l’immunité à médiation cellulaire et jouent un rôle essentiel dans la régulation des réponses immunitaires. Ces LT ne reconnaissent les antigènes que lorsque ceux- ci sont présentés par les molécules MHC présentes à la surface de cellules présentatrices d’antigène. Pour cela, les LT utilisent un récepteur spécifique appelé récepteur d’antigène des lymphocytes T (TCR, T Cell Receptor). Les LT se différencient dans le thymus et peuvent être subdivisés en plusieurs types, exerçant des fonctions diverses. Parmi eux, on retrouve les LT auxiliaires (TH ‘helper’) qui aident les LB à produire des Ac et les phagocytes à détruire les pathogènes ingérés. D'autres LT auxiliaires ont comme fonction d'inhiber les réponses immunes;

ce sont les lymphocytes T régulateurs (Treg). Enfin, certains LT présentent une activité cytotoxique et sont responsables de la destruction des cellules de l’hôte infectées par des virus ou des pathogènes intracellulaires. Ces LT sont appelés lymphocytes T cytotoxiques (CTL). Les CTL expriment le marqueur de surface CD8 alors que les T_H expriment le marqueur CD4.

2.2.2.1 Les lymphocytes T « helper » CD4⁺ (figure 3)

Classiquement, les T_H produisent un large répertoire de cytokines et reconnaissent le complexe Ag-MHCII. Les T_H1 sont caractérisés par la production d’IFN-γ et d’IL-2 et se différencient à partir de TH0 naïfs sous l’influence d’IL-12 et du facteur de transcription T-bet. D’un autre coté, les TH2 dont le développement est dirigé par l’IL-4 et le facteur de transcription GATA-3, produisent de l’IL-4, l’IL-5, l’IL-10 et l’IL-13. Les cytokines produites par les TH1 sont connues pour activer les cellules phagocytaires, les NK et les LT CD8⁺ qui ciblent les pathogènes intracellulaires (ex : les virus et les bactéries intracellulaires) tandis que les cytokines produites par les TH2 augmentent la production d’Ac par les LB, ainsi que l’hypersensibilité et les réponses immunes dirigées contre les pathogènes extracellulaires (ex : les parasites). Bien que ce modèle soit une construction utile pour comprendre l'immunorégulation et définir les mécanismes moléculaires façonnant la différenciation des LT CD4⁺, la vision dualiste de la lignée cellulaire T_H CD4⁺ a été revue par la découverte de nouveaux sous-ensembles de cellules T_H⁶.

Un autre sous-type de TH est celui des lymphocytes T régulateurs Treg, caractérisés entre autres par une expression constitutive du CD25, du CTLA-4 (cytotoxic T-lymphocytes-associated

5 antigen 4) et du GITR (glucocorticoid-induced TNFR-related protein). Leur marqueur le plus spécifique est le facteur de transcription Foxp3. Les Treg sont soit directement dérivés du thymus (Treg naturels; nTreg)⁷, soit induits en périphérie (Treg induits; iTreg)⁸.

La lignée des lymphocytes T « helper » 17 (T_H17) a été identifiée comme ayant des fonctions importantes dans l’inflammation, l’auto-immunité et les cancers. Ils se caractérisent par la sécrétion de cytokines telles que l’IL-17A, l’IL-17F, l’IL21 et l’IL-22. Ces cellules résident au niveau des muqueuses où elles ont pour fonction de protéger l’hôte des pathogènes pénétrant les épithélia. Les TH17 se différencient en présence de TGF-β (Transforming Growth Factor-β), d’IL-6, et sous l’influence des facteurs de transcription RORγt (retinoic acid receptor related orphan receptorγt) et STAT3 (Signal transducer and activator of transcription 3) nécessaires à leur développement. Par ailleurs, le rôle de l'IL-23 a été montré important pour leur expansion et leur survie. De plus, leur différenciation est très proche de celle des iT_reg. En effet, lors de l’activation de LT naïfs exposés au TGF-β, il a été montré que l'addition d’IL-6 qui induit l'expression conjointe des facteurs de transcription RORγt et STAT3 et inhibe le facteur de transcription Foxp3 (forkhead box P3) mènera à la différentiation en T_H17 alors que l'inhibition de RORγt par l’acide rétinoïque et l'ajout d'IL-2 conduit à la différentiation en iT_reg. De plus, Xu et al ont montré que les T_reg matures peuvent eux-mêmes se différentier en T_H17 en présence d’IL-6^{9, 10}.

Enfin, les LT folliculaires (Tfh) dont le développement est dépendant du facteur de transcription BCL6, que l’on retrouve dans les ganglions et la rate, sont des LT CD4⁺ mémoire exprimant le CXCR-5 (chemokine C-X-C motif receptor-5). Ces cellules régulent le recrutement des lymphocytes dans les follicules ganglionnaires et permettent l’activation des LB menant à la formation de centres germinatifs.

2.2.2.2 Les lymphocytes T régulateurs

Au début des années 1970, une série de publications ont montré une régulation négative exercée par certains LT et se traduisant par une inhibition des fonctions médiatrices des T_H effecteurs (Teff). Au cours des 10 années suivantes, ces LT appelés alors suppresseurs, ont fait l’objet de larges études sur leur capacité à interagir avec les Teff ainsi qu'à sécréter des facteurs

Figure 4 : Les différents sous-types de Treg. Les T_reg sont classés en fonction de leur origine et de leur mécanisme d’action. Les nT_reg dérivent directement du thymus tandis que les iT_reg sont induits en périphérie. Ils se caractérisent par une expression constitutive du CD25, du CTLA-4 et du GITR. De plus, leur marqueur le plus spécifique est le facteur de transcription Foxp3. Adapté de Curotto de Lafaille M.A et al, 2009_.

6 solubles, jouant le rôle de médiateurs dans ce processus de régulation du système immunitaire.

L’intégralité du concept de la suppression et des cellules suppressives a ré-émergé dans le milieu des années 1990 à travers de nombreuses études phénotypiques et fonctionnelles qui semblent suggérer que ces LT suppresseurs jouent un rôle essentiel dans la prévention de l'auto-immunité via l’inhibition des LT auto-réactifs réagissant aux Ag du soi. Ces LT, renommés

‘lymphocytes T régulateurs’, sont devenus l’une des composantes majeures de la tolérance immunitaire¹¹ et de l’homéostasie immunitaire.

Les Treg sont caractérisés par une expression du facteur de transcription Foxp3. Le gène Fopx3 encode un facteur de transcription de la famille forkhead-box/winged-helix. Des études chez la souris et chez l’homme ont démontré ce facteur de transcription comme étant un régulateur majeur du développement et de la fonction des T_reg. En effet, une mutation dans le gène Foxp3 induit chez l’homme une maladie auto-immune lymphoproliférative: l’IPEX (Immunodysregulation Polyendocrinopathy Enteropathy X-linked syndrome). De même, les souris portant la mutation scurfy ont aussi le gène Foxp3 défectueux et présentent un désordre lymphoprolifératif. De plus, des LT de souris transduits avec Foxp3 acquièrent les caractéristiques fonctionnelles et phénotypiques des T_reg. Chez la souris comme chez l’homme, le facteur de transcription Foxp3 n’agit pas seulement comme un répresseur mais peu aussi induire l’expression de certains gènes. En effet, Foxp3 interagit avec de nombreux facteurs de transcription impliqués entre autres dans l’activation, la différentiation ou encore la réponse à une stimulation par le TCR. Par exemple, pour être actif, Foxp3 forme un complexe avec le facteur de transcription NFAT (Nuclear factor of activated T-cells). Une mutation dans le gène Foxp3 empêche l’interaction avec NFAT, ce qui interfère avec les diverses fonctions de celui-ci.

Ce complexe permet la surexpression de marqueurs comme le CTLA-4 et le CD25 et réprime la sécrétion d’IL-2, d’IL-4 et d’IFN-γ¹². Par ailleurs, l’activation de STAT5 induite par l’IL-2, tout comme l’activation de SMAD par le TGF-β, est requise pour l’expression et le maintien de la stabilité de Foxp3¹³. En effet, Li et al ont montré chez la souris que des mutants de LT CD4⁺ incapables de répondre à une stimulation par le TGF-β voient leur nombre de Treg diminué¹⁴. Plusieurs types de Treg existent; parmi les Treg décrits, on retrouve les nTreg et les iTreg (figure 4).

Introduction

7 2.2.2.2.1 Les lymphocytes T régulateurs naturels

Parmi les différentes sous-populations de Treg, les nTreg ont largement été décrits. Ils dérivent directement du thymus et représentent 5 à 10% des LT CD4⁺ circulants. Les nT_reg sont caractérisés par une expression constitutive du CD25 (chaîne α du récepteur à l’IL-2), du CTLA-4, et du GITR. Comme mentionné précédemment, leur marqueur le plus spécifique est le facteur de transcription Foxp3 qui a été récemment établi comme marqueur unique des T_reg¹⁵. D’autre part, il a été décrit que le remodelage de la chromatine au niveau du locus Foxp3, et plus particulièrement la déméthylation complète d’une région d’ADN comprenant le locus Foxp3 est associé à la stabilité d’expression de Foxp3 chez les nTreg. Une déméthylation partielle a aussi été observée dans les thymocytes Foxp3⁺ en développement suggérant que la déméthylation est liée à l’expression stable de Foxp3¹⁶. Les Teff CD4⁺CD25^- ne possèdent pas cette région complètement déméthylée.

Il est maintenant clair aussi que la population de LT Foxp3⁺ est composée de plusieurs populations que l’on peut définir sur base de l’expression du CD25, du CD45RA et du Foxp3. En effet, Miyara et al ont défini les Treg naïfs comme CD25^high CD45RA⁺ Foxp3^high, les Treg effecteurs CD25^high CD45RA^- Foxp3^high ainsi qu’une population de cellules non régulatrices CD25^high CD45RA^- Foxp3^{low 17}.

Une caractéristique importante des nT_reg est leur incapacité à proliférer et à produire de l’IL-2 suite à une stimulation via le TCR¹⁸. Lors d’une stimulation, les nT_reg CD4⁺ CD25⁺ inhibent de manière dépendante d’un contact intercellulaire, la prolifération des cellules effectrices de l’immunité adaptative (ex: LT CD4⁺ et CD8⁺), comme celle de l’immunité innée (ex: phagocytes, NK, NKT (Natural Killer T)) ^{19, 20}.

2.2.2.2.2 Les lymphocytes T régulateurs induits

Contrairement aux nTreg qui sont sélectionnés via la présentation d'un peptide endogène du soi et sont donc responsables du contrôle des LT autoréactifs, les iTreg sont plus souvent retrouvés aux sites inflammatoires où ils sont convertis en cellules suppressives à partir de TH CD4⁺CD25^-. Les iTreg se différencient en périphérie sous l’influence d'une stimulation antigénique et de cytokines sécrétées par les cellules de l'environnement et en l'absence d’une costimulation via

8 l'interaction CD28-CD80/86. Ils contrôlent le développement de l’auto-immunité et aident à la tolérance de transplantation²¹. Trois types d’iTreg ont été identifiés:

Les iT_reg de type 1 (Tr1) n’ont pas de marqueurs spécifiques mais ils peuvent être identifiés par leur production d’IL-10. Ils ont été initialement découverts lors d'expériences in vitro suite à une stimulation antigénique chronique en présence de hautes doses d’IL-10. In vivo, ils sont générés sous stimulation des DC immatures en présence d’IL-10. Leur mécanisme d’inhibition de la prolifération des Teff se fait via cette même cytokine ainsi que sous l’influence du TGF-β qui est reconnu pour induire la prolifération et la survie des Treg.

Les LT helper-3 (T_H3) ont été décrits in vitro suite à une stimulation antigénique chronique en présence de TGF-β qu'ilssecrètent en grandes quantités et créent alors un milieu tolérogène.

Ce sous-type de T_reg est le premier à avoir été décrit in vivo et se retrouve majoritairement dans les tissus intestinaux. De plus, les souris déficientes en TH3 développent spontanément des maladies auto-immunes suite à leur conversion qui se fait à partir de LT naïfs, ce qui va permettre la suppression et la création d’un milieu tolérogène.

Des T_reg CD4⁺ CD25⁺ Foxp3⁺ peuvent aussi être induits en périphérie à partir de LT CD4⁺ Foxp3^- suite à une stimulation via leur TCR, en présence de TGF-β. Ces cellules expriment les mêmes marqueurs que les nT_reg et inhibent les réponses immunes via la sécrétion de cytokines ainsi que par un mécanisme dépendant d'un contact cellulaire. Ils se différencient des nT_reg par leur méthylation incomplète du gène Foxp3 et leur manque d’expression de la protéine Helios ²².

2.2.2.2.3 La fonction suppressive des lymphocytes T régulateurs

Les avancées dans la compréhension du mécanisme d’inhibition des Treg reposent sur plusieurs découvertes. La première est que les Treg naturels CD4⁺ CD25⁺ Foxp3⁺ empêchent le développement de l’auto-immunité. La seconde est que les Treg sont capables d’inhiber la prolifération de Teff in vitro. Enfin, la dernière est que l’induction d’expression du gène Foxp3 dans des LT naïfs induit des cellules ayant la capacité d’inhiber la prolifération de Teff. Cette troisième donnée démontre que Foxp3 contrôle probablement l’expression de molécules clés régulant la suppression²³.

Figure 5 : Mécanismes de suppression par les T_reg (a) Lyse des T_eff par la voie des granzymes et des perforines. (b) Inhibition des Teff par des cytokines inhibitrices telles que l’IL10, l’IL-35 et le TGF-β soluble ou membranaire. (c) Les Treg inhibent aussi les DC en modulant leur maturation, leur fonction via la liaison de LAG3 au CMHII ou encore la liaison du CTLA-4 au CD86 induisant la surexpression de l’enzyme immunosuppressive IDO. (d) Apoptose induite par la haute affinité du CD25 par l’IL-2 induisant une diminution de l’IL-2. L’AMP cyclique et l’expression du CD39/CD73 (récepteur à l’adénosine 2A) induisent une immunosuppression des Teff. Adapté de Vignali D.A. et al, 2008_.

9 Diverses études ont mis en évidence une multitude de mécanismes par lesquels les Treg

suppriment la réponse immunitaire (figure 5). Les Treg Foxp3⁺ peuvent lyser les Teff via la production de granzymes/perforines²⁴ ou encore inhiber la prolifération des Teff en exprimant des molécules de surface comme la galectine-1 qui interagit avec des récepteurs exprimés sur les Teff et induit l'arrêt du cycle cellulaire des Teff25

. Par ailleurs, il a été montré que les Treg

naturels produisent de manière spécifique la cytokine immunosuppressive IL-35 qui inhibe la prolifération des Teff de la même manière que le TGF-β et l’IL-10. Le mécanisme par lequel elle agit n’est cependant pas encore bien défini²⁶. Une autre cytokine importante est le TGF-β qui contrôle de façon générale la différenciation et la prolifération cellulaire lors du remodelage tissulaire. Le TGF-β produit par les T_reg est connu pour inhiber la prolifération des LT de type T_H1 et T_H2, et pour induire des iT_reg et maintenir la stabilité des nT_reg. Par ailleurs, les T_reg expriment aussi une forme de TGF-β membranaire (‘latent TGF-β’) qui agit comme immunosuppresseur lors du contact cellulaire entre Treg et Teff. Enfin, la cytokine immunosuppressive IL-10 est sécrétée par un sous-type de Treg, les Tr1, dont elle induit la différentiation. Elle est primordiale dans le contrôle de l’inflammation. Tout comme le TGF-β, l’IL-10 inhibe la différenciation et la maturation des DC, entraînant ainsi une diminution du nombre de DC capables de produire des cytokines pro-inflammatoires telles que l’IL-12. Il en résulte une diminution de la présentation antigénique et donc d’induction de réponse immune efficace.

D’autre part, le CTLA-4 a été montré dans diverses études comme essentiel à la fonction suppressive des Treg. Exprimé constitutivement à la membrane des Treg, le CTLA-4 se lie aux molécules de co-stimulation CD80/CD86 présentes sur les DC avec une plus grande affinité que le CD28, induisant la sécrétion d'IDO par les DC et consécutivement, une moindre prolifération des LT naïfs. L’importance du rôle de CTLA-4 a été mise en évidence dans les souris knock-out souffrant d’un syndrome lymphoprolifératif grave. En effet, ces souris sont incapables d’inactiver la prolifération des lymphocytes T^{27, 28}. D'autre part, Wing et al ont montré qu'un déficit en CTLA-4 sur les T_reg résulte en une lymphoprolifération systémique, des maladies auto- immunes, une hyperproduction d’IgE et l'induction d'une immunité antitumorale chez la souris²⁹. Cependant, Paterson et al ont suggéré que le CTLA-4 n’exerce pas son action uniquement via les T_reg mais aussi via les T_eff dont il inhibe la production d’IL-2³⁰. Cet IL-2 est non

Introduction

10 seulement nécessaire au maintien des Treg naturels et à l’induction des Treg induits à partir des Teff mais il joue aussi un rôle important dans l’inhibition des Teff par les Treg. En effet, des publications récentes ont suggéré que suite à une expression constitutive du CD25, les Treg

détournent à leur profit l’IL-2 (Interleukine-) présent dans le milieu extracellulaire, cette captation empêchant la prolifération des Teff31

.

2.2.2.3 Les lymphocytes T cytotoxiques CD8⁺

Les LT CD8⁺ cytotoxiques représentent une fraction importante des LT circulants qui se différencient en LT cytotoxiques (CTL) suite à leur l’activation. Cette dernière est dépendante de trois signaux : la stimulation antigénique entre le peptide couplé au MHCI et le TCR (T cell receptor) et son corécepteur le CD8, la costimulation effectuée par des molécules telles que le CD28 ou encore le CD40 et la stimulation se faisant via des récepteurs aux cytokines comme l’IL- 12 et l’interféron (IFN) -α ³². Suite à une présentation antigénique, les LT CD8⁺ naïfs recevant ces trois signaux, prolifèrent et acquièrent des fonctions effectrices en produisant des cytokines (ex :IFN-γ,TNF-α) et des molécules comme les perforines et les granzymes capables d’induire la mort cellulaire par apoptose³³.

2.2.3 Les cellules présentatrices d’antigène

La présentation antigénique joue un rôle essentiel dans le déclenchement et le maintien d’une réponse immunitaire appropriée. Afin d’être reconnu par le LT, l’Ag doit être apprêté sous forme de peptide antigénique associé à des molécules MHC I et II par des cellules dites cellules présentatrices d’antigènes (APC, Antigen Presenting Cells). Trois types d’APC à savoir les macrophages, les LB et les DC, ont en commun la capacité de présenter un peptide antigénique via le MHCII aux T_H et de les activer mais seules les DC expriment le MHCII de façon constitutive.

Les DC ont donc la capacité unique d’activer des LT naïfs d’où leur appellation d’APC professionnelles. Les DC capturent l’antigène dans les tissus périphériques au niveau du site de l’infection. Elles vont ensuite maturer tout en migrant vers les organes lymphoïdes secondaires où elles vont pouvoir stimuler activement les lymphocytes T naïfs et ainsi induire leur prolifération.

Figure 6 : Les précurseurs et les sous-populations de DC. Les cellules souches hématopoïétiques (HSC) se différencient en précurseurs myéloïdes et lymphoïdes. Les précurseurs myéloïdes sont à l’origine des DC interstitielles et des cellules de Langerhans.

Les précurseurs myéloïdes peuvent aussi donner naissance aux monocytes qui se différencient en macrophages ou en DC en fonction de l’environnement cytokinique. Les précurseurs lymphoïdes se différencient en DC plasmacytoïdes. Adapté de Shortman K. et al, 2002.

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11 2.2.3.1 Les cellules dendritiques

Les DC se différencient à partir de cellules souches hématopoïétiques en précurseurs lymphoïdes ou myéloïdes (figure 6). De la lignée myéloïde CD34⁺ dérivent les monocytes qui donneront naissance aux macrophages et aux cellules de Langerhans que l’on retrouve dans la peau et les DC interstitielles qui migrent dans les ganglions lymphatiques suite à leur activation.

On considère ces dernières comme les DC principales car elles induisent l’expression de cytokines TH1 en réagissant avec les LT³⁴. Les précurseurs myéloïdes peuvent également donner naissance aux monocytes précurseurs des DC qui se différencient en macrophages ou en DC en fonction de l’environnement cytokinique. En outre, les précurseurs lymphoïdes donnent naissance aux DC plasmacytoïdes (pDC) qui circulent dans le sang et pénètrent dans les organes lymphoïdes. Elles se caractérisent par la sécrétion d’IFN de type I (IFN-α, IFN-β) en réponse aux pathogènes, n’expriment pas d’IL-12 et peuvent induire les LT de phénotype TH2³⁵.

Les DC, définies comme des APC professionnelles sont considérées comme des régulateurs cruciaux des réponses immunes adaptatives. Par leur localisation stratégique dans les tissus périphériques tels que la peau ou les muqueuses, les DC sont considérées comme de véritables sentinelles de l’organisme capables de rapidement capturer les pathogènes qui ont pénétré dans l’organisme. La capture antigénique est la caractéristique des DC immatures. Elle se fait au moyen de multiples mécanismes impliquant ou non des récepteurs, et notamment par phagocytose, endocytose ou encore macropinocytose. Le pathogène rencontré peut être de nature diverse et notamment, une bactérie à développement intra ou extracellulaire mais aussi un virus ou un parasite. Après son internalisation, le pathogène est apprêté, c’est-à-dire lysé par des enzymes protéolytiques pour être ensuite associé sous forme de peptides antigéniques sur les MHC. Suite à la capture et l’apprêtement antigénique, les DC vont subir une maturation phénotypique et fonctionnelle tout en migrant vers les organes lymphoïdes secondaires où elles vont se spécialiser dans la présentation antigénique aux LT et leur activation.

2.2.3.1.1 Maturation et migration

La maturation des DC initiée par différents signaux de danger s’accompagne de changements phénotypiques et fonctionnels. Elle permet la transformation d’une cellule capturant l’Ag en

12 une cellule présentant un peptide antigénique à un LT induisant l’activation de ce dernier³⁶. La maturation des DC est intimement liée à leur migration vers les organes lymphoïdes secondaires (la rate et les ganglions). Différents facteurs peuvent induire la maturation des DC et notamment certaines molécules associées aux pathogènes (ex : LPS, ADN bactérien), des cytokines pro-inflammatoires libérées dans le microenvironnement (ex. TNF-α, IL-1β), des signaux délivrés par les LT³⁷ ou encore des cellules nécrotiques³⁸. La maturation s’accompagne d’une diminution importante de la capacité des DC à capturer l’antigène mais également d’une augmentation considérable de l’expression membranaire des complexes MHCII/peptide, des molécules de costimulation (ex. CD40, CD80, CD86), des molécules d’adhésion telles que LFA-3 et DC-SIGN (Dendritic Cell-Specific ICAM-Grabbing Non-integrin), et un ensemble de paramètres nécessaires à l’activation des LT³⁹. La maturation des DC s’accompagne également d’une modification dans l’expression de petites molécules chimio-attractantes appelées chimiokines et de leurs récepteurs.⁴⁰ Il y a une perte de l’expression des récepteurs aux chimiokines inflammatoires (ex. CCR1, CCR5) au profit des récepteurs CCR7 et CXCR4. L’expression du récepteur CCR7 à la surface des DC matures permet la migration de ces dernières vers les organes lymphoïdes secondaires⁴¹. De plus, les DC matures produisent des cytokines pro- inflammatoires telles que l’IL-12 (DC myéloïdes) ou des IFN de type I (DC plasmacytoïdes). Les changements fonctionnels observés au cours de la maturation s’accompagnent également de changements morphologiques incluant une réorganisation du cytosquelette permettant une plus grande mobilité et favorisant ainsi la migration, mais également la formation de synapses immunologiques.

La migration des DC vers les organes lymphoïdes secondaires est un processus concomitant du processus de maturation. Néanmoins, la migration n’est pas un processus restreint aux DC matures et est également observée pour des DC immatures présentant des antigènes du soi dans le cadre de la tolérance périphérique.

2.2.3.1.2 Présentation antigénique et activation des lymphocytes T

Les DC matures doivent interagir avec les LT pour induire le développement d’une réponse immunitaire spécifique. Cette interaction étroite entre ces deux types cellulaires a lieu au niveau d’une zone particulière très structurée appelée synapse immunologique. Cette

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13 interaction implique la participation de molécules d’adhérence et des constituants du cytosquelette⁴². Les interactions entre les molécules d’adhésion (ex. CD2, ICAM-3) présentes sur les lymphocytes T et celles présentes (ex. LFA-3, DC-SIGN) sur les DC participent ainsi à la stabilisation des contacts cellulaires⁴³. L’activation lymphocytaire est un processus complexe qui nécessite un double signal. L’activation du LT se fait par la reconnaissance par le TCR du complexe peptide antigénique/ MHC et d’un signal de costimulation entre le CD80/86 des DC et le CD28 des LT. Il a été démontré que les interactions entre le CD80/86 et le CD28 stimulent la prolifération des LT en favorisant notamment la sécrétion d’IL-2 et de TNF-α⁴⁴. Parmi les autres signaux de costimulation, on retrouve l’interaction du récepteur CD40 avec son ligand CD40L ainsi que l’interaction OX40–OX40L qui ont non seulement un rôle positif sur l’activation des LT mais aussi sur l’activation et la survie des DC^{45, 46}.

Comme mentionné précédemment, le MHCII que l’on retrouve exprimé constitutivement à la surface des DC ainsi qu’induit sur les autres APC présente aux LTH des peptides antigéniques provenant de protéines exogènes. Ces protéines sont internalisées puis dégradées par des protéases du compartiment endolysosomal en peptides antigéniques. D’autre part, les Ag endogènes sont présentés par le MHCI aux LT CD8⁺. En effet, suite à la dégradation de protéines cytoplasmiques par le protéasome, les peptides résultants vont rejoindre le réticulum endoplasmique via des transporteurs TAP (Transporter Associated with Antigen Processing) et être chargés sur le MHCI. De plus, les DC possèdent la capacité unique de présenter sur des MHCI des peptides antigéniques d’Ag exogènes venant de cellules tumorales ou de cellules infectées par des virus apoptotiques et donc d’initier des réponses cytotoxique. C’est le mécanisme de présentation croisée⁴⁷.

2.2.3.1.3 Les cellules dendritiques de rat

Chez le rat, les DC périphériques et tissulaires ont fait l’objet de très peu d’études. A l’heure actuelle, contrairement aux DC humaines et de souris, l’ontogenèse des DC de rat a peu été étudiée et de nombreuses questions subsistent. Une population précurseur des différents types de DC connues n’a pas été décrite. De plus, leur identification n’est pas simple en raison du peu de marqueurs spécifiques disponibles. Au début des études sur les DC, leur purification à partir de la rate se faisait sur base de la morphologie, de leur faible capacité de phagocytose et de

Figure 7 : La réponse immune antitumorale. Les DC jouent un rôle essentiel dans la réponse immune antitumorale puisqu’elles établissent le lien entre la réponse immune innée et adaptative. Elles sont donc capables d’activer les effecteurs cytotoxiques comme les NK et les CTL. Adapté de Nicchitta C.V. et al, 2003.

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14 l’expression du MHCII. Ensuite, l’OX62 (α E2 integrin) a été identifié comme le meilleur marqueur pour discriminer les DC de rats, qui n’est cependant pas exprimé de la même manière dans tous les sous-types de DC puisque seuls 70% des DC l’expriment⁴⁸. Classiquement, chez le rat, l’utilisation du CD11c, du MHCII et de l’OX-62 est la meilleure combinaison pour identifier les DC des autres populations cellulaires. De plus, les DC peuvent aussi être subdivisées sur base de l’expression différentielle du CD4 et du SIRP (Signal Inhibitory Regulatory Protein). La fonction de ces molécules n’a pas été déterminée mais il a été décrit que les DC montrent une expression variable de ces différents marqueurs, en fonction de leur état de maturation ou encore de l’environnement dans lequel elles se retrouvent. Par exemple, les DC CD4^- SIRP^- se retrouve au niveau de la lamina propria de l’intestin grêle tandis que les DC CD4⁺ SIRP⁺ sont absentes de cette zone. De manière intéressante, Chen-Woan et al. ont développé un protocole pour dériver des DC in vitro à partir de la moëlle osseuse de rat en présence du GM-CSF (Granulocyte Macrophage Colony Stimulating Factor) recombinant⁴⁹.

3. La réponse immune antitumorale

Outre la mise en place d’une réponse immune contre les pathogènes, le système immunitaire est capable d’interagir avec les cellules de la tumeur et d’induire une réponse immune contre des cellules tumorales. Les cellules de l’immunité innée telles que les macrophages, les NK et les NKT constituent la première ligne de défense contre les cellules cancéreuses. Ces dernières vont participer de manière non spécifique à la réponse immune antitumorale en lysant préférentiellement les cellules qui n’expriment pas ou peu de molécules de MHCI. Par ailleurs, suite à l’internalisation des TAA (Tumor associated Antigens) présents dans le milieu extracellulaire, les DC qui font le lien entre la réponse immune innée et la réponse immune adaptative, deviennent matures et capables d’activer les LT conduisant à la lyse tumorale par les CTL. Néanmoins, bien que la fonction première du système immunitaire soit d’induire une réponse antitumorale, il semblerait qu’il soit impliqué également dans la progression tumorale à différents niveaux, dont la stimulation de l’angiogenèse.

Figure 8

:

Ensuite, un équilibre s’installe entre le système immunitaire et les variants tumoraux ayant survécu. Finalement lors de la phase d’échappement, les variants tumoraux ayant acquis une résistance vont se développer de manière incontrôlée aboutissant au développement tumoral. Adapté de Dunn,G.P. et al,2006.

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3.1 L’immunosurveillance et l’immuno-édition

L'immunité antitumorale se base sur deux théories. D'une part, l'immunité empêche le développement des tumeurs naissantes, un concept connu sous le nom d'immunosurveillance du cancer. Cette théorie, introduite à la fin des années 1950, postule que le système immunitaire reconnaît comme élément étranger les Ag associés à la tumeur naissante et les élimine bien avant que les premiers symptômes apparaissent. De plus, il est bien connu que les patients immunodéprimés ont une prédisposition au développement de tumeurs. Par ailleurs, des études portant sur des modèles tumoraux chez la souris ainsi que des données cliniques sur des patients cancéreux ont clairement démontré l’implication des LT CD8⁺ dans la réponse immune antitumorale.En effet, les individus présentant une forte infiltration intratumorale de LT CD8⁺ ont une espérance de vie plus importante que les malades chez qui aucune infiltration n’est observée⁵⁰.

D'autre part, en 2002, Dunn et al ont proposé la théorie de l’immuno-édition ou « théorie des 3 E » qui postule que l'immunité influence la croissance tumorale à travers la pression immunologique induite par l’immunosurveillance du cancer (figure 8). L’immuno-édition du cancer fait référence à un processus dynamique comprenant 3 phases : élimination, équilibre et échappement. L’élimination rejoint le concept d’immunosurveillance où les cellules malignes ou pré-malignes sont directement ou indirectement éliminées par les cellules du système immunitaire principalement à travers la production d’IFN-γ et la génération de CTL reconnaissant la tumeur. A la suite du processus d’élimination de la majorité des cellules tumorales, une phase d’équilibre dynamique se met en place entre le système immunitaire et les différents variants tumoraux ayant survécu. Cette période est considérée comme la plus longue des trois, peut durer plusieurs années chez l’homme. Après le processus d’équilibre, il semble que les tumeurs deviennent capables d'échapper à la destruction par le système immunitaire et, dans certains cas, d’utiliser les réactions inflammatoires à leur propre avantage⁵¹.

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3.2 Mécanismes d’échappements tumoraux

Depuis plusieurs années, il est bien connu que les tumeurs expriment des Ag reconnus par les LT du système immunitaire (les TAA) mais la reconnaissance de ces derniers est rare en clinique. En effet, les études suggèrent que les tumeurs mettent en jeu de nombreux mécanismes d’échappement à la réponse immune antitumorale. Parmi ceux-ci, on retrouve l’ignorance du système immunitaire, la diminution de la présentation antigénique, l’expression de molécules immunosuppressives, l’absence ou la déviation du signal de co-stimulation, l’induction de tolérance ou encore la résistance à l’apoptose. Il est probable que ces différents mécanismes opèrent à différentes étapes de la croissance tumorale. Par exemple, l’accumulation de cellules inhibitrices telles que les T_reg et les MDSC (Myeloïd Derived Suppressor Cells)⁵² se fait à des stades précoces tandis que « l’up-régulation » de protéines immunosuppressives par les cellules tumorales se fait à des stades plus tardifs⁵³.

3.2.1 Mécanismes intrinsèques aux cellules tumorales

La présentation antigénique par les molécules MHCI est cruciale dans l’induction et le maintien des réponses immunes cytotoxiques. Des altérations de l’apprêtement de l’Ag et sa présentation par les MHCI ont été fréquemment rapportées, notamment dans le cancer colorectal ou encore le cancer du sein où ces altérations débouchent sur une absence totale ou partielle de l’expression du MHCI à la surface des cellules tumorales⁵⁴. Les mécanismes relatifs à ces altérations du MHCI sont nombreux et sont liés pour la plupart à des déficits concernant les étapes de leur synthèse. Un assemblage correct des molécules du MHCI et la présentation effective de peptides sont dépendants de la génération de ces peptides par le protéasome et de leur transport dans le réticulum endoplasmique (RE)⁵⁵. Et donc, dans certaines tumeurs, l’apprêtement de l’Ag peut être compromis par des altérations au niveau du protéasome responsable de la génération des peptides antigéniques, ou encore par des mutations au niveau des transporteurs peptidiques TAP qui assurent le transport des peptides antigéniques dans la lumière du RE afin de permettre la liaison entre les peptides antigéniques et les produits du MHCI⁵⁶.

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17 De même, l’induction des réponses immunitaires requiert une costimulation pour qu’elles fonctionnent de manière optimale. Comme précédemment mentionné, les molécules CD80 et CD40 présentes sur les APC, sont connues comme étant des facteurs clés de la costimulation en agissant par l’intermédiaire des ligands, CD28 et CD40L, présents sur les LT. Ces molécules ne sont pas exprimées par les cellules tumorales et donc, si les complexes antigéniques MHC- peptide sont présentés aux récepteurs des LT en l’absence de costimulation, cela conduit à une non-réponse des LT (anergie).

D’autre part, les cellules tumorales peuvent développer une résistance intrinsèque ou acquise à la lyse induite par les effecteurs cytotoxiques CTL ou les NK. En effet, les cellules tumorales peuvent perdre leur capacité à lier les perforines ce qui empêche les granzymes d’agir⁵⁷, ou encore exprimer un récepteur de TRAIL (Tumor necrosis factor (TNF)-Related Apoptosis- Inducing Ligand) non fonctionnel, une molécule impliquée dans la lyse induite par les CTL et les NK. De plus, la serpine PI-9 (Proteinase inhibitor 9)⁵⁸, un inhibiteur cellulaire du granzyme B a été mis en évidence dans de nombreux cancers tels que le cancer du sein⁵⁹ ou encore le carcinome pulmonaire à petites cellules⁵⁸. Enfin, il a été également montré que dans de nombreux cancers, il existe une résistance à l’apoptose induite par la voie des récepteurs à domaine de mort suite à l’engagement de Fas avec son ligand FasL. Cette résistance résulte soit d’une altération de l’expression membranaire de ce récepteur, soit d’une inhibition de la transmission du signal de mort via ce récepteur⁵⁰.

3.2.2 Mécanismes extrinsèques aux cellules tumorales

Une multitude de facteurs immunosuppresseurs sont retrouvés dans le microenvironnement tumoral comme par exemple le TGF-β, l’IL-10, le VEGF (Vascular endothelial growth factor) ou encore la PGE₂ (prostaglandine-E2). Ces facteurs immunosuppressifs proviennent en partie des cellules tumorales elles-mêmes et des cellules résidentes (ex : adipocytes, fibroblastes, cellules endothéliales) répondant à des lésions tissulaires. Ces cytokines dérivent aussi des cellules hématopoïétiques migratoires qui regroupent entres-autres les NK, les LT, les neutrophiles, les mastocytes, les DC et les cellules régulatrices (ex : Tumor Associated Macrophages (TAM), Treg,

MDSC). De plus, en conditions d’hypoxie, les cellules tumorales augmentent leur sécrétion de

18 cytokines et chimiokines pro-inflammatoires comme le TNF-α, l’IL-6, l’IL-1 et l’IL-17 ce qui facilite la communication entre cellules tumorales et tissus de l’hôte associés à la tumeur et participe au développement et à la progression tumorale⁶⁰. Les cellules immunitaires du microenvironnement tumoral sont bivalentes puisqu’elles favorisent non seulement la prolifération et la survie des cellules tumorales mais constituent également une défense efficace contre l’établissement de la tumeur. Par exemple, une infiltration importante de T_reg est associée à un mauvais pronostic alors que l’infiltration en NK et en LT CD8⁺ est souvent associée à un bon pronostic comme démontré dans le cancer du foie^{61, 62}.

Le TGF- β, une cytokine immunosuppressive clé, est secrétée abondamment par la tumeur, les cellules du stroma, les cellules épithéliales, les Treg, et les TAM⁶³. Ce facteur est connu pour son rôle de médiateur dans le remodelage tissulaire via l’activation de la néoangiogenèse par la prolifération et la différenciation des cellules souches mésenchymateuses. En fonction de la nature de la cible, le TGF-β favorise ou inhibe la prolifération, l’apoptose et la différenciation cellulaire. Des mutations survenant au niveau de la voie de signalisation du TGF-β conduisent à une prolifération incontrôlée des cellules tumorales dans plusieurs cancers notamment dans le cancer du colon. De plus, il peut moduler l’immunité en inhibant l’activité des cellules effectrices telles que les NK, les LT et les LB. En outre, il a été montré qu’il protège les tumeurs de la lyse par les CTL via entre autres les T_reg⁵¹.

Une autre cytokine importante associée à la croissance tumorale est l’IL-10. Cette dernière inhibe la présentation antigénique par les DC, ainsi que l’apoptose des cellules tumorales. De plus, elle favorise l’anergie des LT spécifiques d’un Ag promouvant ainsi la croissance tumorale.

De même, l’IL-10 a un effet inhibiteur sur la différenciation et la fonctionnalité des DC en les empêchant de produire de l’IL-12. Donc, un taux élevé d’IL-10 est souvent corrélé à un pronostic défavorable chez les patients cancéreux. Cependant, l’IL-10 est aussi connue pour inhiber l’angiogenèse et augmenter la production de radicaux libres, toxiques pour la tumeur (ex : nitric oxide ; NO), menant à une régression tumorale⁶⁴.

Plusieurs études ont mis en évidence des taux élevés de VEGF dans différents cancers dont le cancer du sein, le cancer du poumon et le carcinome rénal. Il peut être produit par les cellules