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Dépôt Institutionnel de l’Université libre de Bruxelles / Université libre de Bruxelles Institutional Repository
Thèse de doctorat/ PhD Thesis Citation APA:
Van Goietsenoven, G. (2012). Caractérisation des propriétés anticancéreuses in vitro et in vivo de la narciclasine au sein de modèles expérimentaux de mélanomes murins et humains (Unpublished doctoral dissertation). Université libre de Bruxelles, Faculté de Pharmacie, Bruxelles.
Disponible à / Available at permalink : https://dipot.ulb.ac.be/dspace/bitstream/2013/209665/4/f3c8ad78-8554-4c54-ae58-2515b777ce88.txt
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ULB
UNIVERSITÉ LIBRE DE BRUXELLES.UNIVERSITÉ D'EUROPE
Faculté de Pharmacie
École Doctorale en Sciences Pharmaceutiques
Caractérisation des propriétés anticancéreuses in vitro et in vivo de la narciclasine au sein de modèles expérimentaux de
mélanomes murins et humains
Gwendoline Van Goietsenoven
Thèse présentée en vue de l’obtention du grade de Docteur en Sciences Biomédicales et Pharmaceutiques
Promoteur : Robert Kiss
Co-Promoteur : Véronique Mathieu
Département de Bioanalyse et Toxicologie Pharmaceutique Laboratoire de Toxicologie
Composition du jury :
Prof. Akeila Bellahcene (Université de Liège) Prof. Ghanem Ghanem (Institut Bordet, ULB)
Prof. Caroline Stevigny - Président (Université Libre de Bruxelles) Prof. Jacques Dubois - Secrétaire (Université Libre de Bruxelles) Prof. Eric Sariban (Hôpital des Enfants Reine Fabiola, ULB) Prof. Stéphanie Pochet (Université Libre de Bruxelles)
démique 2011 - 2012
2 R, * OH, Rj « H
3 R, * R2 * R4* OH, R, * OM«
4 R, = OH, Rj = Rj = fC, = OMe 5 R, - Rj =OH, Rj * H, R, » OM«
O
OMe
8 R » 3-Hy>droxybutanoy(
OMe 1 : Lycorine
la : Lycorine-2-One
Ib : l,2-0,0’-diacetyIIycorine le : 7-0-acetyllycorine
2 : Caranine 3 : Pseudolycorine 4 : Galanthine 5 : Norpluvine 6 : Amarbellisine 7 : Ungeremine 8 : Nobilisine B
9 : Clivonine chlorohydrate 10 : Tazettine
11 : Ambelline 12 : Buphanamine 13 : Buphanisine 14 : Haemanthamine 15 : Haemanthidine 16 : Narciclasine 17 : Pancratistatine
18 : Cis-dihydronarciclasine
ULB
Je,
Autorisation de diffusion d'une thèse universitaire Licence de droits d'auteur
... ...
réalise une thèse de doctorat en (faculté/départem^t/unité)....ïû.û!i^fj!.—...
...^...
intitulée....luaXC.jCV«i.vi^0ÎX\Dna....Çl^...4-i^^ ....
...
sous la direction de ..XO^Q£A\...^.v.&.J....C\^r\.O.Cr»>.v3iyÊL-u^3....ÊN^....y^£LûJX^.sjQ\ï^..^ClN\^.V.GXi,.^...
Date de la première inscription au doctorat :....<S&^kCi(tt.W.^lj!...^.Qî3.à!...
Sources de financement durapt toute la durée du doctorat :
O .2a,\.(\^.0Y^Qiin.e....4.€..cA/U_.ci^....U.L&... .<X.a?lAJi...
O TMkiiJ/L.CÂ.O'XiûJ...
Annexe(s) jointe(s) (indiquez le type, exemple cassette stéréo ou vidéo, disquette, CD-ROM...) :...
A/ Autorisation de diffusion de b thèse au format papier Consultation par les utilisateurs des Bibliothèques de l'ULB
fiCmSLC-/ AUTORISEE*
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2) accès limité à l'Intranet de l'ULB pour la totalité de l'oeuvre
*
Biffer la mention inutile
3) accès mixte {des accès variés aux différentes parties de l'oeuvre, sachant que la mise en liane de la table des matières, au minimum en accès limité à l'Intranet de l'ULB. est obligatoire. Il vous est possible de sélectionner plusieurs choix, dans les cas où par exemple vous souhaitez mettre en accès public l'entièreté de votre thèse à l'exception d'un chapitre, qui se trouve en accès bloqué pour des raisons de confidentialité):
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l'utiliser dans de futurs travaux. Je m'engage toutefois à n'accorder à des tiers aucun droit qui viendrait d'une
Cachet de l'entité gestionnaire Le Coordinateur du Département Recherche
Pour accord.
Visa du Promoteur nécessaire si la diffusion électronique de toute la thèse est souhaitée par l'auteur : Lu et approuvé (principalement pour le § 5)
Remerciements
Je tiens tout d’abord à remercier le Professeur Marc Van Damme de m’avoir accueillie au sein de son service. Je remercie également très sincèrement le Professeur Robert Kiss avant tout pour m ’avoir convaincue de réaliser une thèse mais aussi pour ses conseils, ses encouragements, la confiance qu ’il m ’a accordée et pour l ’encadrement dont il m ’a fait bénéficier. Merci encore pour tout ce que j ’ai appris au cours de ces quatre années.
Je souhaite également remercier Véronique Mathieu pour m ’avoir si bien encadrée et soutenue pendant ce travail. Merci également à tous les membres de notre équipe : Florence Lefranc, Benjamin Lallemand, Marina Bury, Laetitia Moreno Y Banuls, Thierry Gras, Céline Bruyère, Hélène Leclercqz, Véronique Mégalizzi, Aminata Nacoulma, Manuela De Lorenzi, Delphine Lamoral-Theys, Touria Lamkami, Liliane Richil ; mais aussi à Guy Vandenbussche, Jean-Paul Becker, Martine Prévost, Sébastien Sauvage, Jean-François Gaussin, Nancy De Nève, Christine Decaestecker, Benjamin Le Calvé, Aline Marcowycz, Marie Lemercier et David Leclercq pour l ’aide et le soutien qu ’ils m ’ont apportés tant sur le plan scientifique et
technique que sur le plan personnel.
Enfin, je tiens à remercier mes parents, ma sœur, le reste de ma famille et mes amis pour leur soutien, leur réconfort ainsi que pour leur patience à mon égard.
ABRÉVIATIONS 5
BUT DU TRAVAIL... 7
RÉSUMÉ...8
INTRODUCTION... 10
I. Le cancer... 10
1. Généralités... 10
2. Les caractéristiques du cancer... 11
II. Le mélanome... 12
1. Généralités... 12
2. Épidémiologie...12
3. La biologie du mélanome... 14
a. Genèse d’un mélanome...14
b. Classification du mélanome...16
c. Le microenvironnement du mélanome... 18
i. Microenvironnement cellulaire et tissulaire... 18
ii. Les stimuli pro-inflammatoires... 20
iii. L’angiogenèse et le processus de « vasculogenic mimicry »... 21
d. Le processus métastatique du mélanome... 23
e. Le cerveau est le principal site métastatique du mélanome... 25
4. Traitements...27
a. Chirurgie...27
b. Radiothérapie...27
c. Chimiothérapie... 28
i. Bénéfices réels... 28
ii. La résistance intrinsèque des mélanomes aux stimuli pro-apoptotiques... 30
iii. Le phénotype de « multidrogue résistance »... 33
d. L’immunothérapie et l’échappement des cellules de mélanomes aux attaques du système immunitaire... 34
III. La narciclasine et ses analogues...35
1. Historique lié à la découverte des alcaloïdes et des isocarbostyriles dans les plantes de la famille des Amaryllidaceae... 35
2. Quelles sont les propriétés anticancéreuses déjà connues pour la narciclasine?...36
a. Activités anticancéreuses in vitro...36
i. Activité anticancéreuse et biosélectivité... 36
ii. Mécanismes d’action... 37
(a) Effets au niveau de la synthèse protéique...37
(b) Effets pro-apoptotiques à doses pharmacologiques... 39
(c) Effets au niveau de la RhoA GTPase... 40
b. Activité anticancéreuse in vivo et toxicité...41
3. Les analogues de la narciclasine et leurs propriétés anticancéreuses...42
a. La pancratistatine... 42
b. La lycorine...43
c. Autres analogues... 43
MATÉRIELS ET MÉTHODES...44
I. Les modèles utilisés... 44
1. In vitro...44
a. Les lignées établies... 44
b. Les primocultures... 45
2. In vivo...46
IL Origine des molécules utilisées... 47
1. Les alcaloïdes...47
2. Les isocarbostyriles...47
III. Les techniques utilisées... 48
1. Évaluation du taux de croissance cellulaire... 48
a. Le test colorimétrique MTT... 48
b. La vidéomicroscopie assistée par ordinateur... 48
2. Étude de la liaison au facteur d’élongation eEF 1A... 49
a. In silico : le docking moléculaire... 49
b. In vitro... 50
i. Liaison à la protéine recombinante...50
ii. Liaison dans les cellules de mélanome...50
3. Évaluation de la liaison de la narciclasine dans la poche nucléotidique du facteur d’élongation eEFl A par compétition...51
4. Évaluation du cytosquelette d’actine... 52
a. Fluorescence... 52
b. Étude de l’empaquetage des fibres d’actine... 52
i. Diffusion de la lumière à angle droit... 52
ii. Co-sédimentation de l’actine...53
5. Étude de la synthèse protéique... 54
a. Étude de la phase d’initiation... 54
b. Étude de la phase d’élongation...54
6. Étude de l’apoptose... 55
a. La cytométrie de flux... 55
i. Marquage à l’annexine V... 55
ii. Marquage avec la sonde JC-1...56
b. Étude du clivage de PARP... 57
7. Array Genomic Comparative Hybridization (aCGH)...57
8. Micropuces d’expression génomique...58
9. Étude de l’activation des GTPases... 59
10. Analyse de l’expression protéique par western blot... 60
IV. Analyses statistiques...61
RÉSULTATS...62
I. Caractérisation de l’activité anticancéreuse in vitro de divers analogues de la narciclasine...62
II. Le facteur d’élongation eEFlA semble une cible privilégiée de l’activité anticancéreuse de la narciclasine... 63
1. Mise en évidence de la liaison de la narciclasine à eEFl A... 63
a. Mise en évidence des sites de liaisons potentiels des isocarbostyriles et alcaloïdes des plantes de la famille des Amaryllidaceae sur le faeteur d’élongation eEFlA... 63
b. Étude de la liaison de la narciclasine in vitro et dans les primocultures de mélanomes... 64
c. Étude de la compétition entre la narciclasine et le facteur GTP pour le site de liaison au GTP de la protéine eEFlA... 65
2. Mise en évidence des effets de la narciclasine sur le cytosquelette d’actine et la synthèse protéique.... 66
a. Étude des effets de la narciclasine sur l’organisation du cytosquelette d’aetine... 66
b. Analyse des effets de la narciclasine sur la phase d’initiation de la synthèse protéique...68
c. Analyse des effets de la narciclasine sur la phase d’élongation de la synthèse protéique... 69
3. Mise en évidenee de l’activité cytostatique plutôt que cytotoxique de la narciclasine au sein des eellules cancéreuses...69
a. Analyse des effets de la narciclasine sur la morphologie et l’indice mitotique au sein de lignées de mélanomes...69
b. Analyse du taux d’apoptose induit par la narciclasine dans les lignées de mélanomes... 70
3
c. Analyse de l’implication de la voie mitochondriale dans l’induction de l’apoptose par la narciclasine
dans les primocultures de mélanomes... 72
III. Les différences de sensibilité des cellules de mélanome à la narciclasine pourraient provenir d’un ensemble de gènes en relation avec les petites GTPases de la famille des Ras-like GTPases...73
1. Analyse d’un différentiel de sensibilité de primocultures de mélanomes à la narciclasine et à la lycorine. ... 73
a. Mise en évidence de différentes sensibilités à la narciclasine et à la lycorine pour une série de dix primocultures de mélanomes... 73
b. Étude des effets de la narciclasine et de la lycorine dans divers système de « multidrogue résistance »... 74
2. Comparaison des différentes primocultures de mélanomes par aCGH et micropuces à ARN... 74
3. Analyse des effets de la narciclasine sur d’autres petites GTPases de la famille des Ras-like GTPases. 76 IV. La narciclasine cible de manière privilégiée les tumeurs cérébrales primaires et secondaires, en ce y compris les métastases cérébrales de mélanomes... 77
DISCUSSION...80
I. Les alcaloïdes extraits de plantes de la famille des Amaryllidaceae inhibent de manière très variable la croissance in vitro des cellules cancéreuses... 80
IL L’activité anticancéreuse cytostatique de la narciclasine semble dépendre, au moins en partie, du facteur d’élongation eEFlA...82
III. Les différences de sensibilité des cellules cancéreuses de mélanome à la narciclasine pourraient dépendre de la régulation de l’activité des petites GTPases de la famille des Ras-like GTPases...88
IV. La narciclasine cible principalement les tumeurs cérébrales primaires et secondaires...90
CONCLUSIONS... 95
RÉFÉRENCES...97
ANNEXES 111
Abréviations
aa acide aminé FADD ias-associated death domain
ABC ATP-binding cassette FAK focal adhesion kinase
aCGH array comparative genomic FAS apoptosis stimulating fragment
hybridization Fas-L fas Ligand
ADN acide déoxyribonucléique FDA food and drug administration
ADNg ADN génomique FGF fibroblast growth factor
AHA L-azidohomoalanine FKHRL-1: îorkhead in rhabdomyosarcoma-
AJCC american joint committee on like 1
cancer FLIP FLICE inhibitory proteins
AKT protein kinase B GDP guanos ine di-phosphate
Ang angiopoietine GDPNP analogue non hydrolysable du
Apaf-1 apoptosis protease activating GTP
factor -1 GM-CSF: granulocyte macrophage colony-
APC antigen presenting cell stimulating factor
ARF alternate readingframe GTP guanosine tri-phosphate
ARN acide ribonucléique GSK3P glycogen synthase kinase 3p
ARNc ARN complémentaire HMB-45 human melanoma black -45
ARNm ARN messager HGF hépatocyte growth factor
ARNt ARN de transfert HIFa hypoxia-inducible factor a
ATP adénosine triphosphate HRE hypoxia-responsive éléments
BAD Bcl-2-associated death promoter lAP inhibitors of apoptosis proteins
BCL-2 B-cell CLL/lymphoma-2 ICso concentration inhibitrice de 50%
BCL-xl B cell lymphoma extra long de la croissance in vitro d’une
BCNU carmustine population cellulaire
BDNF brain-derived neurotrophic IDO indoleamine 2-3-deoxygenase
growth factor IFN interferon
Bid BH3 interacting domain death IGF insulin growth factor
BSA bovine sérum albumin IkB NF-kB inhibitor
BRAF serine/threonine protein kinase IKK IkB kinase
B-raf IL interleukine
CCL CC chemokine ligand ILK integrin linked kinase
CCNDl cycline DI INK4A inhibitor of CDK4
CCNU lomustine iNOS inducible nitric oxide synthase
CCR CC chemokine receptor ITAG5 integrin alpha 5
CDK4 cyclin-dependent kinase 4 LIMK LIM domain kinase I
CDKN2A: cyclin-dependent kinase inhibitor LXR-L liver X receptor ligand
2A MO macrophage
CSA cellules souches adultes MAA melanoma-associated antigen
CSC cellules souches cancéreuses MAPK mitogen-activatedprotein kinase
CSM cellules souches de mélanome Md-1 myeloid cell leukemia sequence I
CTLA-4 cytotoxic T lymphocyte MDM2 double minute 2 protein
associated protein-4 MDR multidrogue résistance
CXCL CXC chemokine ligand MDSC myeloid-derived suppressor cells
CXCR CXC chemokine receptor MEDIO mediator of RNA polymerase II
DC cellule dendritique transcription subunit 10
DISC death inducing signaling Meti méthionine initiatrice
complex MHC major histocompatibility complex
DMSO diméthylsulfoxide MICA MHC class I polypeptide-related
DTIC dacarbazine sequenceA
DTT dithiothreitol ML-IAP; melanoma inhibitor of apoptosis
EDTA acide éthylène diamine protein
tétracétique MMP : matrix metalloproteinase
eEF eukaryotic élongation factor MTIC : 5-(3-methyl-l-triazeno)imidazole-
EGF epidermal growth factor 4- carboxamide
EGFR EGF receptor MTT ; bromure de 3-(4,5-
elF eukaryotic initiation factor dimethy!thiazol-2-yl)-2,5-
EMC endogenous melanogenic diphenyl tétrazolium
cytotoxicity NCI : national cancer institute
ERK extracellular-related kinase NF-kB : nuclear factor kB
5
NGF nerve growth factor sAP secreted alkaline phosphatase
NGFR NGF receptor SCLC small-cell lung carcinoma
NK natural killer SDS sodium dodécyl sulfate
NKG2D NK goup 2, member D SNC système nerveux central
NO oxyde nitrique SRS stereotactic radiosurgery
NSCLC non small cells lung cancer TAP-1 antigen peptide transporter 1
NT neurotrophines t-Bid truncated Bid
NTR NT receptor TCR T-cell receptor
NUP133 nuclear pore complex protein 133 TEM transition épithélio-
ORF open reading frame mésenchymateuse
ORL oto-rhino-laryngées TGFP tumor growth factor P
PAF platelet-activating factor TLR-2 toll-like receptor-2
PARP poly-ADP-ribose polymerase TMZ temozolomide
PDGF platelet-derived growth factor TNFa tumor necrosis factor a
PD-Ll programmed cell death I ligand I TRAIL TNF-related apoptosis-inducing
PGE2 prostaglandine E2 ligand
P-gP P-glycoprotein ABCB5 Treg regulatory T cell
PHD prolyl hydroxylase Trk neurotrophic tyrosine kinase
pHi pH intracellulaire receptor
PI3K phosphoinositide 3-kinase TRPM transient receptor potential
PiPî phosphatidylinositol - melastatin
biphosphate TSA tumor-specifîc antigen
PiP3 phosphatidylinositol - UV ultraviolet
triphosphate UVA ultraviolet A
PLCKC protocadherin 24 UVB ultraviolet B
PIGF placental growth factor UVC ultraviolet C
POLS polymerase sigma VDAC voltage-dependent anion channel
PTEN phosphatase and tensin VEGF vascular endothélial growth
homologue factor
Ras rat sarcoma virus oncogene VEGFR VEGF receptor
RF release factor VGP vertical growth phase
RGP radial growth phase vSMC vascular smooth muscle cells
Rho Ras homology protein WBRT whole-brain radiation therapy
ROCKl Rho-associated, coiled-coil XP05 expotin 5
containing protein kinase I ROS reactive oxygen species
But du Travail
Le mélanome est un problème de santé publique de plus en plus important au niveau mondial et principalement dans les pays industrialisés. Alors que le mélanome ne représente que 4% de tous les cancers de la peau, il est responsable de 80% de la mortalité due à ce type de cancers. Le mauvais pronostic associé aux mélanomes est dû aux taux de réponses très faibles de ces cancers à la radiothérapie et à la chimiothérapie, cette résistance provenant essentiellement de la résistance des mélanomes aux stimuli pro-apoptotiques qui représentent la majorité de l’arsenal anti-cancéreux actuel. Dès lors, de nombreuses voies de traitement autres que la chimiothérapie et la radiothérapie ont été développées dans le cadre du traitement des mélanomes, mais ces traitements, qu’il s’agisse d’immunothérapie, de vaccinothérapie ou de thérapies ciblées, ont à nouveau montré un taux de réussite assez faible.
Nous nous sommes intéressés pour notre part à des molécules d’origine naturelle, dont la narciclasine et ses analogues, afin d’élaborer ce qui sera peut-être un jour une nouvelle stratégie thérapeutique pour combattre les mélanomes, tout au moins les métastases cérébrales qu’ils génèrent, sachant que 40% des mélanomes donnent des métastases cérébrales.
La narciclasine et certains de ses analogues chimiques de type alcaloïdes ou plus particulièrement du sous-groupe des isocarbostyriles sont issus de plantes appartenant à la famille des Amaryllidaceae. Ces plantes sont utilisées dans le traitement anticancéreux depuis de nombreux siècles dans la médecine traditionnelle du monde entier. Déjà 400 ans avant Jésus-Christ, Hippocrate de Cos utilisait des extraits de narcisse dans le traitement des tumeurs utérines. Depuis, il a été démontré que l’activité anticancéreuse de ces plantes provenait de ses alcaloïdes, comme la lycorine, et du sous-groupe des isocarbostyriles, comme la narciclasine. Nous avons porté un intérêt tout particulier à la narciclasine qui présente des propriétés anticancéreuses remarquables comme nous le décrirons tout au long du présent travail, notamment dans le cas particulier du mélanome, et de manière encore plus précise, dans le cas des métastases cérébrales de mélanomes.
7
Résumé
Le mauvais pronostic associé aux mélanomes est dû aux taux de réponses très faibles de ces cancers à la radiothérapie et à la chimiothérapie, cette résistance provenant essentiellement de la résistance des mélanomes aux stimuli pro-apoptotiques qui représentent la majorité de l’arsenal anticancéreux actuel.
Les plantes de la famille des Amaryllidaceae ont été utilisées dans la médecine traditionnelle à travers le monde notamment pour le traitement des tumeurs. Il s’est avéré que les composés responsables de l’activité anticancéreuse de ces traitements traditionnels étaient des alcaloïdes, dont les isocarbostyriles. Nous avons voulu caractériser les propriétés anticancéreuses de la narciclasine, un isocarbostyrile, in vitro et in vivo, et étudier son mécanisme d’action antitumoral dans des cellules de mélanome.
Nous avons tout d’abord analysé l’activité inhibitrice de croissance in vitro de ces composés et nous avons observé que l’activité de ces produits était indépendante du caractère résistant ou non des lignées cancéreuses aux stimuli pro-apoptotiques. De plus, à l’exception de la pseudolycorine, ces composés ont une activité cytostatique au niveau de la croissance des cellules cancéreuses.
Nous avons ensuite identifié le facteur d’élongation eEFlA, une GTPase, comme étant une cible potentielle de la narciclasine. De nombreux effets biologiques exercés par la narciclasine (inhibition de la synthèse protéique, désorganisation du cytosquelette d’actine, etc...) peuvent s’expliquer grâce à cette cible. Des travaux antérieurs à ma thèse mais auxquels j’ai participé, suggéraient déjà l’implication d’autres GTPases appartenant à la famille des Rho GTPases comme pouvant être également des cibles de la narciclasine. Nous avons également identifié au cours de notre travail de thèse d’autres GTPases, telle que Racl, comme étant des cibles de la narciclasine. Nous avons toutefois observé que certaines GTPases telles que Ran ne semblaient pas être des cibles de la narciclasine lorsque celle-ci exerce ses effets antitumoraux. Ainsi, si de nombreuses GTPases semblent être des cibles privilégiées de l’action antitumorale de la narciclasine, toutes les GTPases ne le sont pas.
Nous avons observé en fait que la narciclasine n’entre pas en compétition avec le GDP / GTP au sein de la poche GTP du facteur d’élongation eEFlA.
Des études d’activité in vivo réalisées par notre groupe, soit antérieures à mon travail de thèse (gliomes, cancer du poumon NSCLC), soit au cours de ma thèse (mélanomes), ont montré que la narciclasine à des doses non toxiques (administrations chroniques de 1 mg/kg par voie orale ou par voie intraveineuse) apporte un bénéfice thérapeutique dans différents types de modèles
de cancers (gliomes, mélanomes, cancers NSCLC) à conditions que les cellules tumorales soient greffées de manière orthotopique au sein du cerveau de souris immunodéficientes. Ces mêmes cancers s’avèrent insensibles à ces doses non toxiques de narciclasine lorsque les cellules sont greffées en dehors du cerveau chez la souris immunodéficiente.
L’ensemble de nos résultats suggèrent que la narciclasine pourrait devenir un nouvel outil dans le combat contre les cancers cérébraux primaires et secondaires, les métastases cérébrales constituants un problème d’importance pour des cancers tels que les mélanomes, les cancers du poumon, les cancers du sein, les cancers rénaux et les cancers colorectaux. Les cancers primaires du cerveau représentent environ 5% de l’ensemble des cancers solides de l’adulte et jusqu’à 20-30% chez l’enfant. Les métastases cérébrales, dont principalement les métastases cérébrales de mélanomes, représentent également environ 5% de l’ensemble des cancers solides de l’adulte.
9
Introduction
EdvWiî;:Sntittki^yTUS Prauière meiitiSSSfêift^Iîâies tumoralcii
Cbrae csin)$Qi;;^u ^eiu
Égyptleiu :
Traitomeut des tmueuiB pat oautérisation.
avec des æk et avec de la pommade à l'araeuic Sumériens, Chinois, Indiens, Ferses, Hébreux :
Utilkatioude remèdes à base de piaules
IDppocrate de Cos (■l60 - 37^àv. J-C)
• À l'origme du mot cancer
• Concept de cames uaturelles
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■3000 -2600
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-2200
Pai^l?us(^93f 1541) Naissfflice ^ 1§/cliiiijbtbéit^ie
Henri de Mondeville (1260 —1320)
• Premièie classification des cancers
• Coucqjt de carcinogènes externes
^ ;
Aetiüs(527-S6S) Premier traitement d'un cancer
du seiiipar amputation iMà^sUce de la cbinu^gie dans lêüaitement des cancers
-1800 -1400 -1000 -600 -200 0 200 600 1000 1400 1800
Figure 1 : Historique lié à la découverte des cancers et de leurs premiers traitements. Cette figure a été réalisée d’après les informations recueillies dans les articles de Hadju, 2011 a et b.
Introduction
I. Le cancer.
1. Généralités.
Un adage prétend que le cancer est aussi vieux que l’humanité mais des découvertes paléo-pathologiques indiquent déjà la présence de tumeurs chez des animaux aux temps préhistoriques, longtemps avant l’apparition de l’Homme sur Terre (Hajdu, 2011a).
La Figure 1 illustre de manière schématique l’historique des découvertes liées au cancer. Les premiers écrits décrivant des maladies cancéreuses et se rapportant notamment au cancer du sein ont été trouvés sur VEdwin Smith Papyrus qui a été écrit approximativement en 3 000 av.
J-C. L’auteur de ce papyrus conclu que cette tumeur du sein est une maladie grave et qu’il n’y a aucun traitement (Hajdu, 2011a). En 1 500 av. J-C, les égyptiens essayaient de traiter les cancers par cautérisation, avec des couteaux, et avec des sels. Ils introduisirent également la pommade à l’arsenic qui a été utilisée jusqu’au siècle. À la même époque, les sumériens, les chinois, les indiens, les perses et les hébreux utilisaient plutôt des remèdes à base de plantes tels que le thé, les jus de fruits, les figues et le chou bouilli (Hajdu, 201 la). On sait aujourd’hui que ces diverses plantes contiennent de nombreux polyphénols susceptibles de combattre le cancer plus ou moins efficacement (Kandaswami et colL, 2005 ; Lamoral- Theys et coll., 2010). Dans la Grèce antique, Hippocrate (460 - 375 av. J-C), qui est à l’origine du mot cancer, est le premier à penser que le cancer est initié par des causes naturelles et non spirituelles (Hajdu, 201 la).
Le traitement du cancer du sein par amputation totale du sein a été introduit par Aetius (527 - 565), un médecin de Constantinople. À partir de ce moment, la chirurgie va devenir un élément essentiel dans le traitement des cancers (Hajdu, 2011a). La première classification des cancers a été réalisée par Henri de Mondeville (1260 - 1320), un médecin français. Les cancers y sont classés en fonction de leur taille, de leur situation anatomique et de leur localisation superficielle ou profonde. Henri de Mondeville est également le premier à avancer le concept de carcinogènes externes (Hajdu, 201 la).
Bien que l’application sporadique d’agents chimiques pour le traitement des cancers ait été introduite par les égyptiens et les grecs, les premières utilisations systématiques d’agents chimiques dans le traitement des cancers ont été initiées au siècle par Paracelsus (1493 — 1541), un médecin et chimiste suisse. 11 fut un pionnier en chimie et en chimiothérapie (Hajdu, 201 Ib). 11 a introduit de nombreux agents chimiques tels que le mercure, le zinc et le potassium pour le traitement du cancer. Il a également été le premier à préciser que tous ces
Sustaining proliférative signaling
Resisting cell death
Evading growth suppressors
Inducing angiogenesis
Activating invasion and metastasis
Enabling réplicative immortality
Emerging Hallmarks ^
Deregulating cellular energetics
Genome instability and mutation
Avoiding immune destruction
Tumor-promoting Inflammation
-(^Enabling Characteristics^
Figure 2 : Les caractéristiques du cancer. La partie supérieure illustre les six premières caractéristiques du cancer connues depuis une décennie. Tandis que la partie inférieure illustre 4 nouvelles caractéristiques des cellules cancéreuses (d’après Hanahan et Weinberg, 2011).
agents chimiques étaient des poisons potentiels en fonction de la concentration utilisée (Hajdu, 2011b).
Il y a eu ensuite beaucoup de théories à propos de l’origine des cancers. À l’époque, c’est le français Deshaies Gendron (1663 - 1750) qui offre la vue la plus réaliste. Il affirme que les cancers dérivent de la transformation et de la croissance constante des structures glandulaires, lymphatiques, vasculaires et solides dans le corps (Hajdu, 2011b).
2. Les caractéristiques du cancer.
Les principales caractéristiques d’un tissu cancéreux par rapport à un tissu normal sont au nombre de 10 comme décrit dans la revue de Hanahan et Weinberg (2011). Ces dix caractéristiques sont décrites comme suit :
1. Le maintien de la prolifération cellulaire 2. L’échappement aux suppresseurs de croissance 3. La résistance à la mort cellulaire
4. L’immortalisation réplicative 5. L’induction d’angiogenèse
6. L’activation de l’invasion et de la formation de métastases 7. La reprogrammation du métabolisme énergétique cellulaire 8. L’échappement au système immunitaire
9. L’instabilité génique
10. L’environnement inflammatoire promu par le cancer
La Figure 2 illustre les six premières caractéristiques identifiées dès 2000 (Hanahan et Weinberg, 2000) ainsi que quatre caractéristiques identifiées plus récemment (Hanahan et Weinberg, 2011). L’acquisition de ces caractéristiques propres aux cellules cancéreuses par rapport aux cellules normales est rendue possible par deux propriétés essentielles liées aux cellules cancéreuses, d’une part leur instabilité génique qui génère des mutations et des réarrangements chromosomiques qui mèneront à l’acquisition d’une partie de ces caractéristiques, et d’autre part, à l’état inflammatoire des lésions précancéreuses et cancéreuses dû aux cellules du système immunitaire qui promeut également la progression tumorale (Hanahan et Weinberg, 2011). Ces caractéristiques seront plus précisément détaillées ci-après dans le cadre particulier des mélanomes.
SurvivalFunction
Figure 3 : Illustration de la croissance radiale et de la croissance verticale d’un mélanome. A. La peau normale est caractérisée par une distribution des mélanocytes normaux au sein de la couche basale de l’épiderme. B. Lors de la phase de croissance radiale (RGP), les cellules de mélanome migrent au sein de l’épiderme supérieur et se diffusent parmi les cellules épithéliales. Dans la coupe histologique, les cellules de mélanome se différencient des mélanocytes normaux par une cytologie atypique avec un cytoplasme large et abondant ainsi qu’une taille générale plus élevée, les noyaux sont plus larges et hyperchromatiques. C. Lors de la phase de croissance verticale (VGP), les cellules de mélanome montrent toujours une diffusion au sein de l’épiderme supérieur mais elles montrent aussi une pénétration de la jonction derme - épiderme.
Grossissement : x 20, bare d’échelle : 20 pm (d’après Chudnovsky et coll., 2005).
Figure 4 : Courbes de survie à 5 ans et à 10 ans pour les quatre stades de mélanomes. Nous comparons les mélanomes localisés, de stade I (n = 18370) et de stade II (n = 9269), avec les métastases nodulaires (stade III ; n = 3307) et les métastases distantes (stade IV ; n = 7972). Le n correspond au nombre de patient de la base de données de r American Joint Committee on Cancer (AJCC) utilisés pour calculer les taux de survie. Les différences entre les courbes sont hautement significatives (p
< 0.0001 ; d’après Balch et coll., 2011).
II. Le mélanome.
1. Généralités.
Le mélanome se développe à partir des mélanocytes qui sont retrouvés au sein de l’épiderme, des muqueuses des sphères othorinolaryngées (ORL) et périnéales ainsi que de l’œil (Kim et coll., 2010). Le pourcentage de mélanomes cutanés est d’environ 91% tandis que les mélanomes oculaires représentent environ 5%, les mélanomes ayant pour origine les muqueuses environ 1% et les autres mélanomes (environ 2%) ont un site primaire inconnu (Chang et coll., 1998). Au niveau cutané, les mélanomes peuvent se développer n’importe où sur la peau mais se développent plus régulièrement au niveau des membres chez les femmes et au niveau du tronc chez les hommes (Balch et coll., 2009). Les modèles expérimentaux de mélanome que nous avons utilisés dans ce travail sont d’origine cutanée. C’est pourquoi nous parlerons essentiellement de ce type de mélanome dans la suite de cette introduction.
La Figure 3 illustre les deux principales phases de croissance des mélanomes par rapport à une peau normale. Dans un premier temps, la transformation des mélanocytes mène à une phase de croissance radiale {Radial Growth Phase ; RGP) durant laquelle les cellules restent principalement confinées dans l’épiderme. Dans un second temps, il y a la phase de croissance verticale {Vertical Growth Phase ; VGP) où les cellules de mélanome traversent la membrane basale et pénètrent en profondeur dans le derme (Chudnovsky et coll., 2005).
2. Épidémiologie.
Le mélanome cutané est un problème de santé publique de plus en plus important au niveau mondial et principalement dans les pays industrialisés puisqu’en 2002, 82% des mélanomes cutanés ont été diagnostiqués dans ces pays (Armstrong et Goldstein, 2009). Aux États-Unis, l’incidence des mélanomes a augmenté plus rapidement que celle de n’importe quel autre cancer passant d’un risque de 1 sur 1.500 en 1930 à un risque de 1 sur 59 aujourd’hui (Rigel, 2010). En Belgique, le mélanome est le 8®™^ cancer le plus diagnostiqué en 2008, le 11^"’® pour les hommes et le 5^™® pour les femmes (GLOBOCAN 2008).
Alors que le mélanome ne représente que 4% de tous les cancers de la peau, il est responsable de 80% de la mortalité due à ces types de cancers (Miller et Mihm, 2006). La survie des patients atteints de mélanome est fonction du stade de développement du mélanome au moment du diagnostic (Balch et coll., 2011). La Figure 4 représente les courbes de survie pour les 4 stades du mélanome, le stade I correspondant à un mélanome cutané de
Table 1 : Résumé des éléments démontrant la corrélation entre l’exposition au soleil et la formation de mélanome (d’après Armstrong et Goldstein, 2009).
Area of evidence Nature of evidence
Melanoma is related to ambiant solar radiation
Population location In reasonably homogeneous populations of European origin (e.g. Australia, United States), incidence of melanoma inereases with increasing ambient solar radiation.
Personal résidence history Individual risk of melanoma inereases in proportion to duration of résidence in areas of high ambient solar radiation.
Migration People of European ethnie origin bom in a place of low ambient solar radiation who migrate to an area of high ambient solar radiation hâve a lower risk of melanoma than people of similar ethnie origin boni in the area of high solar radiation.
Melanoma is related to cutaneous sun sensitivity
Ethnie origin Melanoma is most eommon in fair-skinned people of European origin and least common in darker skinned people of African and Asian origin.
Color of unexposed skin and In people of European origin, risk of melanoma decreases with increasing skin response to sunlight pigmentation of unexposed skin and/or increasing ability to tan and not to bum
on exposure to the sun.
Melanoma favors body sites exposed to the sun
When skin surface area is taken into account, the density of occurrence of melanoma in people of European origin is greatest on skin usually exposed to the sun, and least on skin rarely exposed to the sun.
Melanoma is related to personal sun exposure
Ail sun exposure Studies hâve not shown a eonsistent relationship between recalled sun exposure of ail types and risk of melanoma.
More continuons pattern Most relevant studies hâve not shown a positive relationship between more (generally occupational) of continuons pattern sun exposure and risk of melanoma.
exposure
More intermittent pattern Most studies hâve shown one or more statistically significant positive associations (generally recreational) of between sun exposure during outdoor récréation and risk of melanoma.
exposure
Sunbum Studies hâve consistently shown positive associations between reealled ffequency or severity of sunbum and risk of melanoma.
Melanoma is associated with other sun-related conditions
Almost ail relevant studies hâve shown positive associations between risk of melanoma and measures of other sun-related conditions, such as
nonmelanocytic skin cancers, solar elastosis, solar lentigines, and solar kératoses.
Melanoma incidence may fall when sun exposure is reduced
Two controlled trials in children suggest that sunscreen use reduces development of new melanocytie nevi and emerging evidence from a trial of sunsereen use in adults suggests that risk of melanoma may be reduced. Stable of falling risks of melanoma in younger people in some populations may indieate that population- _________________________________ based sun protection programs are having an effect._________________________
diamètre inférieur à 2 mm et le stade IV correspondant à la présence de métastases dans des organes distants de la tumeur primaire. Nous pouvons observer que si la survie à 5 et à 10 ans est respectivement de 95% et 90% pour un mélanome de stade I, elle n’est plus que de 15% et
10% respectivement pour un mélanome de stade IV (Figure 4 ; Balch et coll., 2011).
Les risques de développer un mélanome sont de 3 types : démographiques, constitutionnels et environnementaux (Armstrong et Goldstein, 2009).
Au niveau démographique, nous observons que même si le risque de développer des mélanomes augmente avec l’âge, ceux-ci sont de plus en plus fréquemment diagnostiqués chez les patients jeunes et d’âges moyens (Armstrong et Goldstein, 2009). Il y a également une influence de la pigmentation de la peau. En effet, le mélanome est plus présent dans les populations d’origines européennes, qui ont une peau non pigmentée en comparaison avec des populations originaires d’Amérique du Sud, d’Afrique, d’Asie, du Moyen-Orient et des îles du Pacifique (Armstrong et Goldstein, 2009).
Au niveau constitutionnel, il apparaît qu’un certain nombre de caractéristiques physiques sont corrélées avec le risque de développer un mélanome telles que les naevi bénins mélanocytiques, les cheveux blonds et roux, les yeux clairs, les tâches de rousseurs en grands nombres et l’incapacité à bronzer (Armstrong et Goldstein, 2009). Le risque de développer un mélanome fait également intervenir des composants géniques correspondant au développement d’un premier mélanome qui augmente de 8 à 10 fois le risque de développer un second mélanome primaire et au fait que près de 10% des mélanomes se développent chez des patients présentant une histoire familiale de mélanome (Armstrong et Goldstein, 2009 ; Rigel, 2010). Le gène de la cyclin-dependent kinase inhibitor 2A (CDKN2A) est considéré comme le gène de prédisposition aux mélanomes le plus significatif (Rigel, 2010). Les mutations de CDKN2A sont présentes dans 20 à 40% des mélanomes héréditaires mais dans seulement 0,2 à 1% de tous les mélanomes.
Au niveau environnemental, il est largement accepté que le risque majeur pour le développement d’un mélanome primaire est l’exposition aux radiations ultraviolettes (UV) de type A (UVA) et de type B (UVB ; Table 1 ; Armstrong et Goldstein, 2009 ; Riker et coll., 2010). Une augmentation de 10% de l’irradiation annuelle moyenne aux UVB est directement corrélée avec une augmentation de 19% du risque de développer un mélanome (Riker et coll., 2010
).
stage
Epidermis
Basement membrane
Dermis
Benign Nevus
Dysplastic Nevus
Radial-Grovvth Phase
•'■î.
{ Benign Premalignant Decreased différentiation ^ Bioloeic LJniited growth Lésions may regress UnÜmited hyperplAsia
Random atypla Cannotgrowfn wftagar Clonal proiiferacion
Vertical-G rcvwth Phase
Metastatic Melanoma
Metastasïs to tung, liver, or brain
Crosses basement membrar>e Crows in soft agar
Forms tumor
Dissociâtes from primary tumor
Grows at distant sites
8RAF mutation •
CDKN2A toss • PTEN loss--- Molecular
Lésions
increased CDl *
E-cadherin loss
N cadherin expression—
ir^tegrin expression - MMP*2 expression ——
Survivln •
Reduced TRPMl AbscrttTRPMl
Figure 5 : Évènements biologiques et changements moléculaires dans la progression des mélanomes. Au stade de naevus bénin, la mutation de BRAF et l’activation de la voie de signalisation MAPK apparaissent, tandis que les naevi dysplasiques présentent des mutations au niveau des gènes CDKN2A et PTEN. Les mélanomes à croissance verticale (VGP) et métastatiques montrent des changements notables au niveau du contrôle de l’adhésion cellulaire. Les changements dans l’expression de TRPMl (la mélastatine 1) sont corrélés avec la présence de métastases. Les autres changements incluent la perte de la E-cadhérines et l’augmentation d’expression de la N-cadhérlne, de l’intégrine aVp3 et de la protéase MMP-2 (d’après Miller et Mihm, 2006).
3. La biologie du mélanome.
a. Genèse d’un mélanome.
Le modèle de Clarck détermine les changements cliniques et histopathologiques lors de la progression d’un mélanome. Ce modèle inclus les étapes suivantes (Miller et Mihm, 2006 ; Merlino et Hearing, 2009) :
1. Le naevus bénin, congénital ou acquis, consiste en une prolifération de mélanocytes structurellement normaux.
2. Le naevus dysplasique est caractérisé par des atypies structurelles et architecturelles et présente un risque de se développer en mélanome.
3. La phase de croissance radiale (RGP) ou mélanome microinvasif est caractérisée par une prolifération et une diffusion intra - épidermique entre les cellules épithéliales.
4. La phase de croissance verticale (VGP) ou mélanome invasif est associée à la capacité des cellules de mélanome de pénétrer dans le derme sous-jacent à travers la membrane basale et de métastaser.
5. Le mélanome métastatique est localisé à un autre endroit de la peau ou dans un autre site plus éloigné.
Cependant cette séquence de progression n’est valable que dans un tiers des mélanomes car un mélanome peut apparaître de novo d’emblée aux stades 1 à 4 directement à partir de mélanocytes normaux (Merlino et Hearing, 2009).
Il y a de nombreux changements associés aux différents stades mais certains gènes et certaines voies de signalisation se sont avérés critiques dans le développement du mélanome (Merlino et Hearing, 2009). La Figure 5 illustre les étapes biologiques et les changements moléculaires lors de la progression d’un mélanome (Miller et Mihm, 2006).
Parmi ces changements, il y a l’activation anormale de la voie de signalisation BRAF/ERK qui stimule la croissance des cellules. Cette activation constitutive découle de mutations de N- RAS, présentes dans 15% des mélanomes, ou de BRAF, présentes dans plus de 50% des mélanomes, ces mutations étant rarement retrouvées ensemble au sein d’un même mélanome (Miller et Mihm, 2006).
L’inactivation du gène PTEN, un gène suppresseur de tumeur, est présente dans 25 à 50% des mélanomes. Ce gène code pour une phosphatase qui inhibe les voies de signalisation d’une variété de facteurs de croissance utilisant le phosphatidylinositol phosphate (PIP3) comme signal intracellulaire (Miller et Mihm, 2006). En absence de PTEN, les taux de PIP3 et d’AKT
Mutation
Figure 6 : Origines des cellules souches de mélanome (CSM). Les cellules CSM peuvent apparaître suite à des mutations dans des cellules souches mélanocytaires ou dans des cellules progénitrices.
Elles peuvent aussi être le résultat de la transformation de cellules différenciées. Ces cellules CSM sont responsables de la croissance tumorale et de la formation des métastases (d’après Sabatino et coll., 2009).
active augmentent, ce qui prolonge la survie des cellules et augmente la prolifération cellulaire (Miller et Mihm, 2006).
Dans des modèles murins, aucunes des mutations que nous décrivons ci-avant ne suffisent, seules, à induire des mélanomes ; en revanche lorsqu’elles sont associées entre elles ou avec d’autres mutations, les mélanomes surviennent (Miller et Mihm, 2006).
Enfin, les perturbations de l’adhésion cellulaire contribuent à l’invasion tumorale. En effet, la progression des mélanomes RGP en mélanomes VGP est associée à la perte d’expression des E-cadhérines en faveur des N-cadhérines (Miller et Mihm, 2006). Les cadhérines, des protéines transmembranaires multifonctionnelles qui permettent les interactions entre cellules sont divisées en 3 sous-groupes : E (épithéliale), P (placentaire) et N (neurale). L’expression des N-cadhérines est caractéristique des carcinomes invasifs et favorise la diffusion métastatique en permettant l’interaction des cellules de mélanome avec les autres cellules exprimant les N-cadhérines, tels que les fibroblastes du derme et l’endothélium vasculaire (Miller et Mihm, 2006).
Cette progression RGP/VGP est également associée avec l’expression de l’intégrine aVpS, les intégrines permettant les interactions entre les cellules et les composants de la matrice extracellulaire (Miller et Mihm, 2006).
À l’heure actuelle, il y a de nombreuses études concernant l’hypothèse de l’implication des cellules souches cancéreuses (cellules CSC) dans la genèse des cancers en général et des mélanomes en particulier. Cette hypothèse suggère que la tumeur est initiée et maintenue par un sous-groupe de cellules capables d’auto-renouvellement et ayant le potentiel de se différencier en cellules cancéreuses hétérogènes qui vont former la masse de la tumeur (Sabatino et coll., 2009). De plus, du fait de leur caractère non différencié, ces cellules CSC n’expriment pas les protéines fonctionnelles caractéristiques du tissu différencié et sont donc susceptibles d’échapper à une thérapie immunitaire ciblant l’un de ces antigènes (Sabatino et coll, 2009).
La Figure 6 représente l’origine supposée des cellules souches de mélanome (eellules CSM) qui conduisent aux différentes populations cellulaires constituant la tumeur.
Wang et ses collaborateurs (2006) ont montré que les différentes lignées cellulaires générées à partir d’une même métastase de mélanome affichent un patron de méthylation de leur ADN identique alors qu’elles présentent des différences au niveau de la morphologie cellulaire, au niveau de la pigmentation et au niveau génétique. De plus, une analyse génétique et transcriptionelle des lignées de mélanome dérivées des nombreuses métastases qu’un patient a développé sur une décennie a démontré que chacune de ces lignées cellulaires était dérivée d’une unique cellule progénitrice, de type cellule souche, qui maintient un profil génétique constant tout au long de la vie du patient (Wang et coll., 2006 ; Sabatino et colL, 2008).
Dans des conditions physiologiques, les cellules souches adultes (CSA) requièrent une niche environnementale particulière pour maintenir leur capacité de cellules souches et pour rester indifférenciées (Sabatino et coll., 2009). Jusqu’à présent, aucune niche cancéreuse n’a été décrite. Il est possible que les cellules CSM ne soient pas co-localisées au sein du mélanome mais se situeraient plutôt dans une niche environnementale spéciale, ce qui pourrait expliquer que lors d’une récurrence d’un mélanome, celui-ci soit rarement localisé au même endroit que le premier cancer (Sabatino et coll., 2009).
b. Classification du mélanome.
La classification des mélanomes s’effectue actuellement selon le système TNM pour tumeur primaire (T), nodules lymphatiques régionaux (N) et métastases distantes (M ; Balch et coll., 2004 ; 2009).
La catégorie T sépare les tumeurs primaires en fonction de l’indice de Breslow qui est la mesure en millimètre de la plus grande épaisseur de la tumeur :
• Tl : mélanome dont l’épaisseur est < 1,00 mm,
• T2 : mélanome dont l’épaisseur est comprise entre 1,01 et 2,00 mm,
• T3 ; mélanome dont l’épaisseur est comprise entre 2,01 et 4,00 mm,
• T4 : mélanome dont l’épaisseur est > 4,01 mm.
16
B
IIIA
A
T category
c
M1a M1b MIC
M category
Nia N2a N1a N2a Nlb N2b N1b N2b N3
N Category
Figure 7 : Taux de survie des patients atteints de mélanomes en fonction de la classification TNM. Les données proviennent de la base de données de l’AJCC. A. Taux de survie à 10 ans des patients dans la catégorie T : ces résultats tiennent compte de l’ulcération ou non des tumeurs primaires. B. Taux de survie à 5 ans des patients dans la catégorie N. La survie des patients est significativement différentes lorsque la tumeur primaire est ulcérée (lllB(a) et llIC) ou non (lllA et lllB(b)) C. Taux de survie à 1 an des patients dans la catégorie M. 11 y a une différence significative entre les patients présentant des métastases de la peau, subcutanée, des nodules lymphatiques (Mla) et des poumons (Mlb) par rapport aux autres sites viscéraux (Mlc ; d’après Balch et coll., 2004).
Table 2 : Correspondances entre la classification TNM et la classification pathologique des mélanomes. NO et MO signifie l’absence de nodules métastatiques (N) et de métastases distantes (M ; d’après Balch et coll., 2004).
Pathologie Stagingt
0 Tis NO MO
IA Tia NO MO
IB Tl b NO MO
T2a NO MO
IIA T2b NO MO
T3a NO MO
IIB T3b NO MO
T4a NO MO
lie T4b NO MO
IIIA T1-4a Nia MO
T1-4a N2a MO
IIIB TMb Nia MO
T1-4b N2a MO
T1-4a N1b MO
T1-4a N2b MO
T1-4a N2c MO
T1-4b N2c MO
IIIC T1-4b Nlb MO
T1-4b N2b MO
