VIH : vers la guérison ?

E. Boffi El Amari

introduction

En 1996, les HIVologues étaient au comble de l’excitation : enfin un traitement efficace était à disposition. L’arrivée de la trithé­

rapie changeait radicalement la prise en charge de l’infection VIH, qui passait du statut de maladie inéluctablement mortelle à celle d’une infection chronique, que certains cliniciens n’ont pas hésité à compa­

rer au diabète. Finies les maladies opportunistes, bonjour à une espérance de vie tendant vers la normalité. Cependant, ceci a un prix : une prise quotidienne, à vie, de médicaments ; la mise en évidence d’un syndrome métabolique, associé à la prise de ceux­ci. De plus, on note que l’incidence de certains cancers reste élevée, par rapport à la population VIH négative et que le risque cardiovasculaire est éga­

lement plus élevé.¹ Parallèlement à l’élargissement du choix des trithérapies, beau­

coup d’efforts ont été investis dans le développement d’un vaccin, qu’il soit pré­

ventif ou thérapeutique. Mais, jusqu’ici, les résultats sont décevants. Enfin, le coût de l’emploi d’une trithérapie, à vie, s’est révélé non négligeable et pèse lourd dans les dépenses de santé de certains pays. Le Graal n’est donc pas encore atteint !

C’est alors, qu’en 2008, l’histoire d’un patient a relancé une grande vague d’ex­

citation dans le monde du VIH et fait fleurir sur les lèvres des cliniciens, en 2011, un mot que peu osaient prononcer : guérison !

rappel dephysiopathologie(figure 1)

Le virus VIH est un rétrovirus ARN, qui se réplique dans certaines cellules spé­

cifiques. Pour se faire, plusieurs étapes sont nécessaires, dont la première est l’entrée dans la cellule hôte. Cette étape cruciale résulte d’une interaction spéci­

fique entre une protéine virale transmembranaire gp120 et le récepteur CD4 à la surface membranaire du lymphocyte T homonyme. Cette première phase est complétée par une autre interaction spécifique avec un corécepteur, (récepteur à chémokine), également à la surface du CD4, qui se dénomme CCR5.² Cette inter­

action a fait l’objet du développement d’une nouvelle classe thérapeutique : les inhibiteurs du CCR5, représentés par le Maraviroc.³

HIV : vision of a cure

In 2008, Mr Brown, an HIV positive patient was healed of acute myeloid leukemia, after recei­

ving an hematopoietic stem cell transplanta­

tion from a donor homozygous for the CCR5 gene variant delta32. He was able to recover a normal CD4 T cell count and his HIV viral load has remained undetectable, despite discon­

tinuing antiviral therapy. This extraordinary case is a proof of concept that HIV can be cu­

red and has boosted the research, especially in the field of gene therapy. Several groups are working on blocking the expression of the CCR5 and CXCR4 co­receptors, by using either RNA interference or zinc­finger nuclease tools.

The aim of this article is to describe their actual stage of development.

Rev Med Suisse 2011 ; 7 : 1968-73

En 2008, M. Brown, patient VIH positif, a guéri d’une leucémie  myéloïde aiguë par transplantation de cellules souches héma­

topoïétiques provenant d’un donneur homozygote pour la muta­

tion delta32 du corécepteur CCR5. Grâce à cela, il a reconsti­

tué, depuis, un taux normal de lymphocytes TCD4 et présente  une charge virale indétectable, sans trithérapie. Ce cas extra­

ordinaire a fait la preuve du concept que la guérison du VIH  est possible et a relancé la course à la recherche d’un traite­

ment  curatif,  en  particulier  dans  la  direction  de  la  thérapie  gé  nique. Plusieurs équipes travaillent à éliminer l’expression  des  corécepteurs  CCR5  et  CXCR4,  à  la  surface  des  cellules  cibles du VIH, par des méthodes de nucléase zinc-finger ou  d’interférence RNA, appliquées aux cellules CD4 ou souches  hématopoïétiques des patients. Cet article décrit l’état actuel  de cette avancée thérapeutique.

VIH :  vers la guérison ?

nouveau concept

Dr Emmanuelle Boffi El Amari Rue de la Servette 55 1202 Genève et

Unité VIH

Service des maladies infectieuses Département de médecine interne HUG, 1211 Genève 14

emmanuelle.boffi@hcuge.ch

Une mutation notée delta32, au niveau du gène codant pour le CCR5, induit un corécepteur inactif, ce qui confère une résistance à l’infection par le virus chez les personnes homozygotes et une évolution plus favorable, chez les hé­

térozygotes.^4,5

Il faut souligner que certains virus n’empruntent pas la voie d’entrée CCR5, mais utilisent un deuxième corécepteur CXCR4. Ces virus semblent apparaître en cours d’évolu­

tion de l’infection. Cette aptitude virale à utiliser soit l’un, soit l’autre, voire même les deux corécepteurs est nommée tropisme et peut se tester en laboratoire.⁶

histoire dem

.

M. Brown est un patient américain, qui vivait à Berlin.⁷ En 1995, il se découvre VIH positif et débute une monothé­

rapie d’AZT, seul traitement disponible alors, suivi par une série de trithérapies.⁸ La virémie (charge virale sanguine) du VIH devient indétectable et le taux plasmatique de ses lymphocytes CD4 arrête de baisser, classant le patient en porteur d’infection chronique contrôlée, au prix d’une prise quo­

tidienne de plusieurs comprimés et de passablement d’ef­

fets secondaires. Non malade, il n’est cependant pas guéri, puisqu’à l’arrêt de son traitement, la réplication virale repren­

drait, ainsi que l’évolution vers le stade de maladie sida.

En 2006, il apprend qu’il est également atteint d’une leucémie myéloïde aiguë, sans rapport avec son infection VIH. Il subit deux cures de chimiothérapie d’induction, suivies d’une cure de consolidation, qui se soldent par une rémis­

sion transitoire. Sept mois plus tard, son médecin lui annon­

ce que seule une transplantation médullaire pourrait le sauver. Le Dr Hütter a entendu parler de certaines person­

nes, qui, exposées au virus VIH, ne sont pas infectées. Ces personnes sont porteuses d’une mutation delta32 sur les deux allèles du gène codant pour le corécepteur CCR5. Fort de cette information, il décide de trouver un donneur HLA­

compatible, homozygote pour cette mutation.

Alors que le patient est indétectable, sous trithérapie, il bénéficie d’une première transplantation, en février 2007,

suivie,une année plus tard, à l’occasion d’une deuxième récidive, d’une seconde transplantation, avec le même don­

neur. La trithérapie de M. Brown est stoppée le jour de la première transplantation et, depuis, sa virémie reste indé­

tectable.

A plus de 3,5 ans de la transplantation, les éléments sui­

vants ont été rapportés par publication :^9,10

• Le taux de CD4 circulant a progressivement augmenté et a atteint une valeur considérée dans la norme pour une personne de son âge, non infectée (600­1900/mm3).

• Les cellules CD4 du donneur sont non seulement en cir­

culation sanguine, mais ont également recolonisé la mu­

queuse intestinale, siège de la majorité des CD4, en temps normal.

• Ces cellules sont effectivement CCR5 négatives, mais con­

servent l’expression du CXCR4. Ceci permet de conclure que, bien que résistantes à une infection par un virus R5, elles restent permissives à une infection par un virus X4.

Ceci a été confirmé par des tests in vitro.

• La recherche de CD4 et macrophages tissulaires de l’hôte (ces dernières étant notoirement résistantes à la chimio­

radiothérapie), qui représentent de potentiels réservoirs viraux, s’est révélée négative, au niveau du foie, du côlon et du cerveau.

• La recherche d’ARN ou d’ADN viral, dans ces mêmes tissus, s’est également révélée négative.

Ces éléments permettent de conclure à une bonne re­

constitution immune après transplantation, une absence de rebond viral provenant soit d’un réservoir non éradiqué, soit de l’émergence de virus X4. M. Brown se porte bien et la communauté scientifique le considère comme le premier patient ayant guéri de l’infection VIH.

recherchefondamentaleetétudes cliniques

Fort de l’expérience du patient Brown et devant la morbi­

dité et la mortalité associées à une transplantation de cel­

lules souches hématopoïétiques, sans mentionner la diffi­

culté de trouver des donneurs CCR5 delta32, des straté­

gies de thérapie génique, visant à éliminer l’expression du CCR5, sont en développement. Le but de ces techniques est d’obtenir des cellules autologues, propres au patient infecté, n’exprimant plus le corécepteur CCR5 et, de ce fait, résistant au virus à tropisme R5.

La boîte à outils génique contient plusieurs techniques qui sont susceptibles d’être employées pour obtenir ce ré­

sultat, par exemple :¹¹

• au niveau de l’ARN : l’interférence ARN ;

• au niveau de l’ADN : la nucléase zinc finger.

Dans le premier cas, il s’agit d’utiliser un mécanisme in­

tracellulaire hautement conservé de siRNA (small interfering RNA), qui reconnaissent de manière spécifique des mRNA (dans ce cas, codant pour CCR5), induisent leur dégrada­

tion et ainsi bloquent l’expression du CCR5 (figure 2).

Dans le deuxième cas, il s’agit de couper le double brin d’ADN et de produire un arrêt de la transcription du gène, grâce à l’utilisation d’une protéine ayant la capacité de re­

connaître une séquence d’ADN spécifique, de s’y fixer et de la cliver (figure 3).

Figure 1. Interaction entre les glypoprotéines trans- membranaires de surface du VIH (gp 120 ; gp41), le récepteur CD4 et le corécepteur CCR5 des lymphocytes TCD4

Pris sur site : www.HIVandhepatitis.com (coverage of the CROI 2010).

HIV

CD4

CCR5

gp41 gp120

Ces techniques peuvent être utilisées sur des lympho­

cytes CD4. Ceci a été fait par Perez et coll.¹² Dans leur ex­

périence, in vitro, le zinc finger a été transfecté aux cellules CD4, en cultures, via un vecteur viral (adénovirus). Ceci a bloqué la transcription du CCR5 dans 50% des CD4. Placées en cultures, en présence de virus VIH, ces cellules ont pro­

liféré, sans s’infecter. Le taux de CD4 a donc augmenté et la charge virale progressivement diminué. Kumar et coll.¹³ ont utilisé une technique de siRNA pour développer des lymphocytes CD4 CCR5 négatifs. Ils ont injecté, à des souris humanisées,(c’est­à­dire sévèrement immunosupprimées et transplantées avec des tissus humains), des perfusions de CCR5 siRNA conjugués à un anticorps antiCD7 (antigène présent à la surface de la majorité des cellules T). L’interac­

tion spécifique entre anticorps et antigène induit l’interna­

lisation du complexe dans la cellule T et donc l’entrée des siRNA. Ils ont démontré que l’infection VIH pouvait être contrôlée de manière prophylactique : les souris exposées au VIH, après les perfusions, maintenaient un taux de CD4 normal et la virémie demeurait indétectable. Ils ont égale­

ment démontré que cette technique pouvait être thérapeu­

tique : des souris déjà infectées ne voyaient pas leur taux de CD4 décliner, par rapport à des souris témoins et leur virémie devenait indétectable. Kim et coll.¹⁴ ont utilisé une autre méthode de transfection des siRNA, en choisissant d’intégrer ceux­ci dans des nanoparticules liposomales por­

tant à leur surface des anticorps dirigés contre la molécule LFA-1 integrin présente sur tous les leucocytes. Ceci, contrai­

rement à la technique de Kumar, a permis de cibler toutes les cellules immunitaires jouant un rôle dans l’infection VIH : lymphocytes CD4, macrophages et cellules dendritiques.

Ils ont ainsi prouvé qu’après perfusion des nanoparticules, à des souris humanisées, l’infection par le VIH était évitée et le taux des CD4 restait dans la norme. Comme Kumar, ils ne notent pas d’effet cytotoxique de leur méthode, qui né­

cessite, dans les deux cas, des injections sériées.

De manière plus intéressante, ces techniques ont été mises en œuvre sur des cellules souches hématopoïéti ques.

Ceci a l’avantage d’engendrer des cellules résistant non seulement dans la lignée lymphoïde (par exemple : CD4), mais également dans la lignée myéloïde (par exemple : macrophages), sans compter les cellules CD34 elles­mêmes, dont on vient de découvrir qu’elles peuvent être infectées également et représentent de potentiels réservoirs viraux.¹⁵ Ceci a été expérimenté par Holt et coll.¹⁶ qui, en utilisant la méthode des nucléases zinc finger ont réussi à obtenir des cellules souches hématopoïétiques CD34 CCR5 négatives (5­7% des cellules CD34 infectées par des plasmides conte­

nant la nucléase sont devenues CCR5 négatives). Ces cel­

lules ont ensuite été transplantées dans des souris huma­

nisées. Huit à douze semaines après, des cellules humaines des différentes lignées hématopoïétiques ont pu être mises en évidence en circulation et dans différents tissus murins.

L’analyse de ces cellules a démontré que 11% étaient CCR5 négatives. Après infection des souris par du virus VIH­1, le taux des cellules CD4 est resté stable et l’analyse de celles­

ci a mis en évidence qu’elles étaient toutes CCR5 négatives.

Ceci permet de conclure que la protection des CD4, dans ces souris transplantées par des cellules CD34, traitées par Figure 2. Mécanismes d’action de l’interférence RNA

Wikipedia/Dan Coyocari, Department of Medical Biophysica, University of Toronto 2010.

Lentiviral delivery of shRNAs and the mechanism of RNAI interference in mammalian cells.

Protein coat : GAG

VSVg

5’

ADP 5’

ATP

AAAA AAAA

AAAA CDS

3’UTR mRNA

mRNA

Bypass mechanism Cleavage mechanism m⁷G

m⁷G m⁷G

2ADP 2ATP Lentivirus

(shRNA)

Reverse transcription complex

Pre-integration complex

Antisense (blue)

Integration

m⁷G TTTT

Pre-shRNA

Ran-GTP dependent export

RISC-complex turnover shRNA sIRNA

Viral integrated shDNA insert Pol IIII

Exportin 5

Dicer

RISC

RISC

RISC AGO2

AGO2 AGO2

????????

Nuc leus Cyto

plasm

Figure 3. Mécanisme d’action des nucléases zinc finger

(Adaptée de réf.¹¹).

Interaction spécifique entre la nucléase zinc finger et le gène codant pour le corécepteur CCR5, résultant dans le clivage du brin d’ADN. Répara- tion par insertion d’un codon stop entraînant l’arrêt de la transcription.

Insertions/deletions disrupt the ORF – a common 5bp duplication (boxed) introduces premature stop codons ZFNs bind CCR5 (underlined),

create 5bp staggered cut

AACATGCTGGTCATCCTCATCCTGATAAACTGCAAAAGGCTGAAGAGCATGACTGAC TTGTACGACCAGTAGGAGTAGGACTATTTGACGTTTTCCGACTTCCTCGTACTGACTG

AACATGCTGGTCATCCTCATCCTGATCTGATAAACTGCAAAAGGCTGAAGAGCATGACTGAC TTGTACGACCAGTAGGAGTAGGACTAGACTATTTGACGTTTTCCGACTTCTCGTACTGACTG

Error-prone NHEJ repair

✂ ✂

AAACTGCAAAAGGCTGAAGAGCATGACTGAC GACTATTTGACGTTTTCCGACTTCCTCGTACTGACTG AACATGCTGGTCATCCTCATCCTGAT

TTGTACGACCAGTAGGAGTAG

Asn Met Leu Val Ile Leu IIe Leu Ile * *

nucléase zinc finger, est le fait d’une sélection des cellules CCR5 négatives et, de ce fait, résistant à l’infection VIH R5.

De plus, le niveau de virémie est resté significativement plus bas que dans des souris témoins. Il faut cependant ajouter que ces mêmes souris, infectées par des virus X4, ne con­

trôlaient pas la virémie et leur taux de CD4 baissait.

En parallèle, des méthodes de siRNA ont également été testées sur des cellules souches hématopoïétiques. Shimizu et coll.,¹⁷ en utilisant un modèle de souris humanisé, ont démontré que la transplantation de cellules souches CD34 transduites par des vecteurs lentiviraux, porteur de shRNA (short hairpin RNA) contre le CCR5, permettait de diminuer significativement l’expression de CCR5 dans les cellules filles, tels les CD4 et les macrophages, analysée dans diffé­

rents tissus lymphoïdes, incluant la muqueuse intestinale.

Ces cellules CCR5 négatives, prises au niveau spléni que, ne s’infectaient pas avec VIH­1 R5, ex vivo, par rapport à des cellules non transduites. Par contre, elles restaient per­

missives à une infection par les virus X4. Ces résultats sont confirmés par Liang et coll.,¹⁸ dans une expérience sem­

blable, qui soulignent l’absence de cytotoxicité de la mé­

thode et l’intérêt d’une transduction cellulaire unique de shRNA, à la place de perfusions sériées de siRNA.

Au Centre médical universitaire de Genève, R. Myburgh, doctorant dans l’équipe du Pr K.­H. Krause, développe une technique d’interférence RNA, primary miRNA, différente de celles décrites ci­dessus (siRNA, shRNA). Cette méthode, plus proche de l’interférence endogène intracellulaire de­

vrait permettre d’éviter les potentiels effets cytotoxiques des shRNA, tout en obtenant un blocage plus stable, dans le temps, de l’expression du CCR5.^19,20 R. Myburgh a déjà testé sa méthode, avec succès, in vitro, sur une lignée de cellules humaines exprimant CCR5. Il s’apprête, ces pro­

chains mois, en collaboration avec l’Université de Zürich, à la mettre au point sur des cellules souches CD34, dans un modèle de souris humanisées et ensuite de tester leur ré­

sistance à l’infection par le VIH.

De ces expériences émerge l’espoir que la transplanta­

tion de cellules souches autologues modifiées par une nu­

cléase zinc finger ou par interférence RNA CCR5­spécifique puisse permettre la reconstitution immune par des cel­

lules CD4 CCR5 négatives et le contrôle, voire l’abolition de la réplication virale, sans trithérapie. Il reste cependant beaucoup d’inconnues, par exemple les risques d’erreur de clivage de l’ADN, par les nucléases zinc finger ou celui de mutations induites par l’intégration de lentivirus porteurs des shRNA et la possible émergence de virus X4, non blo­

qués par ces thérapies R5 spécifiques.

L’étape des essais cliniques (figure 4) a déjà été franchie par trois équipes, aux Etats­Unis, et les premiers résultats ont été présentés à la CROI (Conference on retroviruses and opportunistic infections), à Boston, en février 2011. Lalezari et coll. (étude QUEST, SF et UCLA) ont recruté neuf partici­

pants VIH positifs, sous trithérapie efficace. Leurs cellu les CD4 ont été récoltées par leuco­aphérèse. Ces cellules ont été modifiées par transduction d’un vecteur viral (adénovi­

rus) porteur de la nucléase ZF CCR5. 26% en moyenne des cellules sont devenues CCR5 négatives. Ces cellules ont été réinjectées aux patients. Les résultats montrent une bonne prise de greffe, l’expansion in vivo des cellules CD4

modifiées, de manière transitoire (environ trois mois), dans le sang périphérique, mais également au niveau de la mu­

queuse rectale. Aucun effet secondaire important n’a été rapporté.²¹ L’équipe développe actuellement une techni­

que équivalente, afin de bloquer également l’expression du corécepteur CXCR4. Une autre équipe, à l’Université de Pennsylvanie, Tebas et coll., fait de même, mais essaie également sur une cohorte de patients en échec thérapeu­

tique.²² Enfin Krishhnan et coll. ont transplanté des pa­

tients VIH positifs présentant un lymphome non hodgkinien avec des CD34 autologues en partie transduits par des vec­

teurs lentiviraux, porteur de shRNA contre plusieurs pro­

téines virales, et le corécepteur CCR5. Après 24 mois, les patients étaient en rémission et plusieurs lignées de cel­

lules exprimaient toujours des siRNA.²³

conclusion

La pandémie de VIH, qui a débuté en 1981, a déjà fait plus de 60 millions de victimes, dont plus de la moitié sont décédées. De toutes, M. Brown est le seul patient qui peut se prévaloir d’être guéri. Il a donc fait la preuve du concept que la guérison du VIH est possible, ce qui relance tous les espoirs.

Il serait cependant téméraire de trop simplifier l’en­

semble du processus qui nécessite, actuellement, une trans­

plantation de cellules souches hématopoïétiques d’un don­

neur CCR5 négatif, dont la complexité, les risques et le coût empêchent l’application à grande échelle. Certains éléments restent, par ailleurs, non expliqués : l’absence de réémergence du virus X4 ; l’importance de l’effet synergique du traitement ablatif pré et post­transplantation (chimio­

radiothérapie, ATG et immunosuppression reçues), sur la vidange des réservoirs viraux, voire même la réaction greffe contre hôte. Mais ce cas a relancé la course à la recherche d’un traitement curatif, en particulier dans la direction de la thérapie génique, où des millions de dollars sont réin­

Figure 4. Etudes cliniques utilisant la technique des nucléases zinc finger

(Adaptée de réf.¹¹).

Shéma de deux études :

• à gauche : modification de lymphocytes T CD4 autologues par nucléase zinc finger, expansion ex vivo et retransfert au patient ;

• à droite : modification de cellules souches hématopoïétique CD34 auto- logues et retransfert au patient, après chimiothérapie.

SB-728 Ad5/35,

CCR5 ZFNs Apheresis

enrich CD4+ G-CSF mobilize, apheresis, CD34+ purify

ENDPOINTS safety CD4/HIV levels CCRG selection

SB-728 Ad5/35, CCR5 ZFNs

HSC, preclinical development CD4+ T cells,

phase I trial

Cryopreserve test

Infuse Infuse

Expand cryopreserve

test

Chemotherapy

vestis. Des équipes travaillent à éliminer l’expression des molécules CCR5 et CXCR4 à la surface des cellules cibles du VIH, par des méthodes de nucléase zinc finger ou d’in­

terférence RNA, appliquées aux cellules CD4 ou souches hématopoïétiques des patients. Dans l’émerveillement gé­

néral, des études cliniques sont déjà en cours, afin que le mot guérison, si longtemps un mirage, puisse faire partie du vocabulaire des patients et de leurs soignants.

Implications pratiques

Grâce à la trithérapie, l’infection VIH est passée du statut de maladie inéluctablement mortelle à celle d’une infection chronique. Cependant, ceci a un prix : une prise quotidienne, à vie, de médicaments ; la mise en évidence d’un syndrome métabolique, associé à la prise de ceux-ci. De plus, on note que l’incidence de certains cancers reste élevée, par rapport à la population VIH négative et que le risque cardiovascu- laire est également plus élevé. Enfin, le coût de l’emploi d’une trithérapie, à vie, s’est révélé non négligeable et pèse lourd dans les dépenses de santé de certains pays

A plus de 3,5 ans du traitement d’une leucémie myéloïde aiguë, par transplantation de cellules souches hématopoïéti- ques, provenant d’un donneur homozygote pour la muta- tion delta32 du gène codant pour le corécepteur CCR5, M.

Brown, patient VIH positif, avant sa transplantation, se porte bien et la communauté scientifique le considère comme le premier patient ayant guéri de l’infection VIH

Devant la morbidité et la mortalité associées à une trans- plantation de cellules souches hématopoïétiques, sans men- tionner la difficulté de trouver des donneurs CCR5 delta32, des stratégies de thérapie génique, visant à éliminer l’ex- pression du CCR5, sont en développement. Le but de ces techniques est d’obtenir des cellules autologues, propres au patient infecté, n’exprimant plus le corécepteur CCR5 et, de ce fait, résistant au virus à tropisme R5

Deux outils de thérapies géniques, l’interférence RNA et la nucléase zinc finger, sont actuellement utilisés dans des ex- périences sur des modèles de souris humanisées et en essai clinique de phase 1, avec des résultats encourageants, re- lançant l’espoir que le mot guérison puisse faire partie du vocabulaire des patients et de leurs soignants

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Remerciements

Je tiens à exprimer mes remerciements au Dr R. Myburgh pour le temps qu’il a consacré à fournir un résumé concis de son travail de recherche sur les miRNA. Tous mes remerciements et ma gratitude vont également au Pr B. Hirschel qui a relu, d’un œil critique, ce ma­

nuscrit.

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* à lire

** à lire absolument

Bibliographie