Résultats
&
Discussion
Résultats et discussion
33
Afin de caractériser les rôles joués par l’élongation de la transcription ainsi que par la maturation des transcrits dans la régulation de l’expression du VSG, plusieurs voies de recherches ont été explorées :
h La comparaison de la maturation de transcrits d’un ES actif avec celle d’un ES inactif.
h L’analyse de la chromatine suivant l’activité de l’ES.
h L’étude d’un facteur d’élongation et la caractérisation du complexe Pol I chez le trypanosome.
6. Exploration du couplage entre l’(in)activité d’un site d’expression et la maturation
(in)correcte de l’ARN.
Des résultats obtenus au laboratoire par Vanhamme et al. montrent que lorsqu’un transcrit correspondant au début de l’ES est polyadénylé, il provient de l’ES actif (Vanhamme et al., 2000). Les transcrits issus d’ESs inactifs ne sont quant à eux pas polyadénylés. Comparer la maturation de transcrits provenant d’ESs actifs et inactifs constituait logiquement l’étape suivante de l’étude (en association avec Hubert Renauld (Sanger Institute, Cambridge, Royaume-Uni) qui fut post-doctorant au laboratoire). Cette comparaison devait dans un premier temps être envisagée par Northern blot pour ensuite être confirmée par PCR.
6.1. Northern blot.
Dans l’espoir de mettre en évidence des états de maturation différentiels entre un ES actif et un ES inactif, nous avons tout d’abord réalisé des Northern blots.
Cependant, ils n’étaient pas assez sensibles pour détecter les messagers provenant de l’ES inactif. Nous nous sommes alors orientés vers la technique plus sensible qu’est la PCR.
6.2. RT-PCR.
La technique utilisée a été décrite par Vanhamme et al. (Vanhamme et al.,
2000). Brièvement, après extraction de l’ARN, les fractions d’ARN polyadénylé ou non
polyadénylé sont isolées par chromatographie sur une colonne oligo(dT). Ces fractions
ESAG7 ESAG6
A A
SL SL
4 4
3 3
1 2 VSG
5
3
3
3 3 3 2 1 1
1 1
11 1 1
30 17
2
9 2
18 2
1 1
10 1
1
ESAG7 ESAG6
p1/2
ESAG7 ESAG6
p1/2 Poly(A)
+Poly(A)
-Fig. 22: Analyse de la maturation des transcrits issus des sites d’expression de VSG (ES). Un ES est représenté schématiquement au dessus de la figure et les amorces (1, 2, 3, 4)
permettant d’amplifier des transcrits provenant de segments de l’ES sont indiquées. L’amorce 4 s’hybride aussi bien à ESAG7 qu’à ESAG6 (Expression Site Associated Gene). L’amorce 3 s’hybride à la séquence du « spliced-leader » (SL) ajoutée en trans à tous les pré-ARNms chez le trypanosome. Les sites de polyadénylation sont indiqués (A). Les RT-PCR ont été réalisées à partir d’ARN polyadénylé (Poly(A)
+) ou pas (Poly(A)
-). Les produits PCR ont été séquencés et leur provenance en terme d’ES a été analysée. Chaque ES est représenté par un quartier de couleur et le nombre de produits provenant de cet ES est signalé. Le quartier blanc correspond à l’ES actif. Les résultats obtenus avec le couple d’amorces 1/2 l’ont été à partir d’ARN du clone AnTat 1.3A de la lignée EATRO 1125 de T. brucei (Vanhamme
et al., 2000) tandis que lesautres résultats ont été obtenus à partir d’ARN du clone Etat 1.2CS de la lignée Etat 1 de T. b.
rhodesiense.
Poly(A)
+/SL
-25 2
2 2 1
Fig. 23: Analyse de la maturation des transcrits issus des sites d’expression de VSG (ES). La présentation des résultats est identique à ce qui a été décrit pour la figure précédente. L’amorce 5 s’hybride à la région intergénique qui disparaît suite à la maturation des transcrits.
ESAG7 ESAG6
A A
SL SL
4 4
VSG
5 5
ESAG6
Résultats et discussion
34
traitées à la DNaseI servent de substrat à une RT-PCR. Les produits sont ensuite clonés en bactéries, puis séquencés, l’interprétation des résultats se faisant sur minimum 30 clones. Les amorces sont choisies de manière à pouvoir différencier les ARNs matures des ARNs non matures. Je rappelle que la maturation procède par ajout en trans du SL RNA en 5’ et de la queue Poly(A) en 3’. Une suite de pyrimidines appartenant à la région intergénique dirige la polyadénylation en amont et l’épissage en aval (Ullu et al., 1996) (Fig. 19). En fonction de cela, une batterie d’amorces a donc été constituée (SL RNA, Poly(A) et région intergénique). L’obtention d’un produit PCR en mettant en réaction de l’ADNc obtenu à partir d’ARN polyadénylé et un couple d’amorces dont l’une s’hybride à la séquence du SL RNA et l’autre à la séquence du gène d’intérêt, signifiait que ce transcrit avait subi une maturation complète. Le fait de ne pas obtenir de produit correspondait par contre à un transcrit n’ayant pas subi de maturation complète. La provenance du produit en terme d’ES (actif ou pas) a été déterminé par séquençage.
Dans une première expérience, des amorces spécifiques du SL RNA et de l’ORF (Open Reading Frame) d’ESAG6 ou d’ESAG7, ont été utilisées (Fig. 22). En effet, ESAG6 et ESAG7 présentant un niveau élevé d’identité de séquence, l’amorce choisie permettait d’amplifier soit l’un soit l’autre. On a observé une hétérogénéité de transcrits provenant d’ARN non polyadénylé plus importante que celle provenant d’ARN polyadénylé. C’est donc la polyadénylation plutôt que l’ajout du SL RNA qui nous a semblé être spécifique de l’ES actif.
Pour confirmer cela, nous avons utilisé dans l’expérience suivante des amorces spécifiques de la région intergénique (région qui disparaît suite à la maturation du pré- ARNm) et de l’ORF d’ESAG6 ou d’ESAG7 (Fig. 23). Il s’est avéré que, pour de l’ARN polyadénylé, les transcrits présentaient aussi une hétérogénéité assez importante. Ce dernier résultat n’est pas explicable par le modèle de maturation proposé. A cela s’ajoute une autre particularité à savoir que nous n’avons obtenu que des transcrits correspondant au gène ESAG6. Malheureusement donc, ce type d’expérience ne nous a pas permis d’établir un modèle tenant compte de tous les résultats obtenus.
Une autre approche du problème a été envisagée à savoir le clonage de facteurs
de maturation de l’ARN. Nous avons notamment cloné l’homologue du gène de la
Poly(A) polymérase (PAP) chez T. brucei. Cette enzyme intervient dans l’ajout de la
queue Poly(A) à l’extrémité 3’ des transcrits. Une invalidation par RNAi (« RNA
interference ») (en association avec les mémorants Cissé Bakary et Yannick Mwape) a
été réalisée sans aboutir à un phénotype de croissance particulier mais elle devait
encore être vérifiée par Northern et Western blots. Un gène homologue à une protéine
SR a également été cloné. Ces protéines sont impliquées dans l’épissage des transcrits
naissants. Son invalidation par RNAi n’a pas non plus mené à l’observation d’un
Résultats et discussion
35
phénotype de croissance particulier. Cependant, l’efficacité de l’invalidation doit aussi être vérifiée. D’autres données concernant les facteurs de maturation de l’ARN chez le trypanosome existent dans la littérature. Le gène d’une sous-unité d’un autre facteur intervenant dans la polyadénylation des transcrits à savoir CPSF, a été cloné par Hendriks et al. (Hendriks et al., 2003). Il s’est avéré que cette protéine était essentielle aussi bien en PF qu’en BF. D’autres homologues de facteurs de polyadénylation existent dans le génome du trypanosome illustrant la conservation du système au cours de l’évolution (Hendriks et al., 2003).
Nos résultats appuyent l’idée que les transcrits d’ESs ayant subi une maturation correcte proviennent préférentiellement de l’ES actif, l’étape cruciale semblant se situer au niveau de l’ajout du SL RNA. Il reste maintenant à identifier le ou les facteurs en quantité limitante ne permettant cette maturation qu’au niveau de l’ES actif.
7. Analyse de la chromatine.
Dans le cadre de cette voie de recherche, nous nous sommes focalisés sur deux processus de régulation de l’expression de gènes observés dans d’autres systèmes biologiques : l’état d’acétylation de l’histone H4 et l’attachement à la matrice nucléaire.
h Comme déjà énoncé, l’état d’acétylation de l’histone H4 est corrélé avec l’activité de la chromatine dans d’autres systèmes biologiques (Wolffe, 1995).
Nous nous sommes concentrés sur la comparaison des niveaux d’acétylation de l’histone H4 pour une séquence génomique particulière, le site d’expression du gène de VSG, à l’état actif et à l’état inactif.
h L’attachement différentiel à la matrice nucléaire est également corrélé à l’activité de gènes dans d’autres systèmes (Ciejek et al., 1983; Robinson et al., 1983;
Gerdes et al., 1994). Nous avons projeté de déceler un éventuel attachement différentiel à la matrice nucléaire de l’ES suivant son état d’activité.
7.1. Anticorps dirigés contre l’histone H4.
Des anticorps dirigés contre l’histone H4 du trypanosome sous ses formes
acétylée et non acétylée ont été produits en lapin. Les immunisations ont été réalisées
M-A-K-G-K-K-S-G-E-A-K-G-S-Q-K-R-Q-K-K-V-L-R-GC amide M-A-X-G-X-X-S-G-E-A-X-G-S-Q-X-R-Q-X-X-V-L-R-GC amide TbH4
TbH4-Ac
Fig. 24: Séquence des peptides ayant servi à immuniser des lapins contre l’histone H4 du trypanosome. Chacun des peptides est constitué des 22 premiers acides aminés de H4 chez T.
brucei
et est couplé à un motif GC-amide. Le premier peptide correspond à l’histone H4 non
acétylée (TbH4) tandis que le second correspond à l’histone H4 acétylée (TbH4-Ac). Les acides
aminés lysines (K) acétylés sont indiqués par des « X ».
α-TbH4-Ac
Fig. 25: Analyse en Western blot des sérums dirigés contre l’histone H4 acétylée (α-TbH4-Ac) et non acétylée (α-TbH4) de T. brucei. Les sérums ont été testés sur des extraits nucléaires de trypanosomes déposés sur un gel TAU (Triton-Acide acétique-Urée). Les différents degrés d’acétylation de l’histone H4 révélés par l’α-TbH4-Ac sont indiqués.
α-TbH4
1 23 4
0
FITC DAPI
α-TbH4-Ac α-TbH4
Fig. 26: Immunofluorescences réalisées sur des trypanosomes entiers à l’aide des sérums dirigés contre l’histone H4 acétylée (α-TbH4-Ac) et non acétylée (α-TbH4) de T. brucei. Les anticorps dirigés contre l’histone H4 sont détectés par des anticorps secondaires couplés à la fluorescéine (FITC). Une coloration DAPI (4,6-DiAmino-2-PhénylIndole) met en évidence le noyau (N) et le kinétoplaste (K).
N
K
Ac Ac Ac Ac
Ac Ac Ac
Ac
Ac Ac
Ac Ac Ac EXTRACTION
NUCLEAIRE
DIGESTION A LA
NUCLEASE DE MICROCOQUE
+ α-TbH4-Ac GEL + α-TbH4
D’AGAROSE
nucléosome
Fig. 27: Description schématisée de la méthode employée pour immunoprécipiter la chromatine à partir des sérums dirigés contre l’histone H4 acétylée (α-TbH4-Ac) et non acétylée (α-TbH4) de T.
brucei.
Résultats et discussion
36
à partir de peptides synthétisés par Alain Michel (Université Mons Hainaut). Ces peptides correspondent aux 22 premiers acides aminés en position N-terminale de l’histone H4 de T. brucei (TbH4) couplés au motif GC-amide. Quatre lysines en N- terminale de l’histone H4 sont sujettes à l’acétylation chez les animaux. Ne sachant pas quelles lysines sont acétylées chez T. brucei, les 7 lysines du peptide synthétique ont été acétylées (Fig. 24).
Les sérums ont par la suite été testés en Western blot à partir d’extraits nucléaires de trypanosomes déposés sur gel TAU (Triton-acide acétique-urée) permettant de séparer les formes acétylées des histones. Comme observé sur la figure 25, le sérum anti-TbH4 révèle la forme non acétylée de TbH4. Le sérum anti-TbH4 acétylée (TbH4-Ac) quant à lui révèle quatre formes acétylées de TbH4 (Fig. 25). Ce résultat est équivalent à ce qui a été observé chez d’autres organismes (Wolffe, 1995;
Vettese-Dadey et al., 1996). Il révèle également la forme non acétylée de TbH4 mais vu la faiblesse du signal par rapport aux formes acétylées et par rapport au signal obtenu par le sérum anti-TbH4, cela ne nous a pas empêché de procéder à la comparaison.
En immunofluorescence (IF), chacun des sérums a permis d’observer un signal localisé comme attendu au niveau du noyau (Fig. 26).
7.2. Immunoprécipitations de chromatine.
Nous avons dans un premier temps comparé le taux d’histone H4 acétylée des ESs selon leur activité par immunoprécipitation (IP) de chromatine à l’aide des anticorps dirigés contre TbH4 (en association avec Laurence Lecordier et Sara Devaux, respectivement post-doctorante et doctorante au laboratoire). Après avoir digéré la chromatine avec la nucléase de microcoque (qui coupe entre les nucléosomes), il est en effet possible de coimmunoprécipiter des filaments de nucléosomes de tailles variées auxquels se sont fixés les anticorps dirigés contre les histones (Collas et al., 1999) (Fig. 27). L’ADN précipité de cette manière est déposé sur gel d’agarose et permet d’observer une image d’échelle typique. Le taux d’histones acétylées associées à une région d’ADN connue peut alors être comparé par l’intermédiaire d’une sonde utilisée en Southern blot.
Dans un premier temps, des quantités de nucléase de microcoque et des durées
variées de son action ont été testées. Une fois cette mise au point terminée, la
comparaison du taux d’acétylation de l’histone H4 d’un site d’expression actif avec le
même site à l’état inactif a été entreprise. Pour ce faire, nous avions besoin d’une
paire de clones dotés du même ES à l’état actif dans un cas et à l’état inactif dans
7 Ble
SpeI BamHI BamHI
Clone 20S71 : VSG121 exprimé
Clone SW1 : VSG221 exprimé
7 7 Ble
SpeI BamHI BamHI
VSG121
Répétitions de 50 bp
ESAG7 (Expression Site Associated Gene)
Gène de résistance à la phléomycine
Ble
Luc
Luc
StuI
StuI
Luc Gène de la luciférase
7
Fig. 28: Schéma décrivant un couple de clones dont le même site d’expression de VSG (VSG121) à l’état actif (20S71) et à l’état inactif (SW1) est marqué par les gènes de luciférase et de résistance à la phléomycine. Des sites utiles spécifiques d’endonucléases de restriction sont indiqués.
VSG121
VSG221
VSG221 I U B U B α -T bH 4 α -T bH 4-Ac I U B U B
TbRib α -Tb H 4 α -T bH 4-Ac VSG221 I U B U B α -T bH 4 α -T bH 4-Ac
20S 71 SW1 I U B U B α -T bH 4 α -T bH 4-Ac TbXpd
Fig. 29: Immunoprécipitationsde chromatine réalisées à l’aide des sérums dirigés contre l’histone H4 acétylée (α-TbH4-Ac) et non acétylée (α- TbH4) deT. brucei. Les fragments d’ADN coimmunoprécipités(échelle de nucléosomes) ont été détectés en Southernblot en utilisant une sonde VSG221lorsque son site d’expression est actif (SW1) ou lorsqu’il est inactif (20S71) (Fig. 28), une sondeTbXpd(sous-unitédu facteur de transcription TFIIH)et une sondeTbRib(sous-unité18S du ribosome). Cette figure illustre la comparaison du taux d’acétylation de l’histone H4 d’un ES (VSG221) selon son activité. La comparaison comprend également le taux d’acétylation d’une unité de transcription Pol II (TbXpd) et d’une unité de transcription ribosomique(TbRib). Les astérisques signalent les puits à comparer. I: fraction «Input»=matériel placé en réaction. B: fraction «Bound»=matériel immunoprécipité. U: fraction «Unbound»=matériel non immunoprécipité.AB C ÂÂ Â
Résultats et discussion
37
l’autre, marqué par un gène de résistance à un antibiotique. En effet, étant donné que les ESs présentent environ 95 % d’identité de séquence, ils ne sont pas discernables par les techniques faisant intervenir l’hybridation entre acides nucléiques. Pour atteindre ce but, un gène de résistance à l’hygromycine a été inséré par recombinaison homologue au début de l’ES actif du variant antigénique AnTat1.3A de la lignée EATRO 1125. Cependant, un clone où cet ES marqué est inactif n’a pu être obtenu par variation antigénique. Cet ES est apparu comme dominant, la variation antigénique semblant se faire majoritairement par remplacement du gène de VSG dans l’ES actif. Néanmoins, nous avons bénéficié d’une paire de clones de Miguel Navarro (Instituto de Parasitologia y Biomedicina ‘López-Neyra’, Grenade, Espagne) où le site d’expression occupé par le VSG121 est marqué par les gènes de luciférase (Luc) et de résistance à la phléomycine (Ble) (Navarro et Cross, 1998). Le clone correspondant à l’ES du VSG121 marqué à l’état actif est appelé 20S71 ; le clone SW1 où le VSG221 est exprimé correspond quant à lui au même ES à l’état inactif (Fig. 28).
A l’aide de ces clones et d’une sonde VSG221, l’état d’acétylation de TbH4 en fonction de l’activité de l’ES a été analysée. Cette comparaison n’a malheureusement rien donné vu l’extrême sensibilité à la nucléase de l’ES actif (Fig. 29A). Ces observations confirment des résultats plus anciens exposés dans l’introduction (Pays et al., 1981; Greaves et Borst, 1987) et indiquent que la chromatine de l’ES actif est beaucoup plus relaxée que celle de l’ES inactif.
Des résultats supplémentaires obtenus lors d’expériences contrôles sont présentés sur la même figure (Fig. 29). Une différence d’acétylation entre des unités de transcription Pol I (ES) et Pol II (TbXpd, sous-unité du facteur de transcription TFIIH) y est perçue. Un appauvrissement d’ADN immunoprécipité par les anticorps dirigés contre TbH4-Ac est observé pour l’unité de transcription Pol II (Fig. 29, comparer les autoradiographies A et B et plus particulièrement les puits marqués par des astérisques).
Une unité de transcription ribosomique a été examinée en tant qu’unité de transcription Pol I (TbRib). Un enrichissement d’ADN immunoprécipité par les anticorps anti-TbH4-Ac par rapport aux unités de transcription Pol II est également observé (Fig. 29, comparer les autoradiographies B et C et plus particulièrement les puits marqués par des astérisques).
Un enrichissement élevé en ADN immunoprécipité par les anticorps
dirigés contre TbH4-Ac a donc été uniquement observé au niveau d’unités de
transcription Pol I. Ces résultats bien que tout à fait inattendus sont très
intéressants si on se réfère au cas particulier du trypanosome. En effet, chez le
trypanosome seules les unités de transcription Pol I semblent être régulées au niveau
transcriptionnel. Les unités de transcription Pol II sont, quant à elles, transcrites de
α− TbH4 / sonde tubuline
[
Fi bre Faisceau de fibres Fi g. 30 : Co lo ca lis at io n sur fib re d e chroma ti n e é tir ée . L a s o nd e s’ h ybr id an t a u x g èn es rép ét és de la t u bu line es t déte ctée par de s anti co rp s c o u p lé s à la fl uore sc éi n e. Les anti co rp s di ri gé s co ntre l ’hi sto n e H4 du trypa n o som e (
α-TbH4) dé tecté s par de s anti co rp s s eco n d ai re s co upl és au CY
TM3 m et te n t d iff ic ile men t e n évi d en ce u n e fibre de ch romat ine u n iqu e. Un faisceau de fi bres de ch ro mati ne est détecté d e mani ère pl u s nette.
α-TbH4-Ac α-TbH4
Tot. Purif. 1 Tot. Purif. 1
TbH4 Glycéraldéhyde
3 phosphate déshydrogénase
Tubuline α et β
TbH2A et TbH3
A B
α-TbH4 α-TbH4-AcPurif. 212 34 0
12 3 0
Fig. 31: Analyse en Western blot des sérums dirigés contre l’histone H4 acétylée (α-TbH4-Ac) et non acétylée (α-TbH4) de T. brucei après purification sur colonne d’affinité. Les sérums ont été testés sur des suspensions de noyaux de trypanosomes déposés sur un gel TAU (Triton-Acide acétique-Urée). A. Révélation réalisée avec les sérums non purifiés (Tot.) et avec les sérums purifiés sur une colonne d’affinité dotée du peptide qui a servi à produire ces sérums (Purif. 1).
B. Révélation réalisée avec le sérum α-TbH4-Ac épuisé sur une colonne d’affinité dotée du peptide TbH4 avant d’être purifiée sur une colonne d’affinité dotée du peptide TbH4-Ac (Purif. 2). Les différents degrés d’acétylation de l’histone H4 révélés par l’α-TbH4-Ac sont indiqués ainsi que les résultats de microséquençage.
Purif. 1
Résultats et discussion
38
manière constitutive (la régulation étant post-transcriptionnelle). L’acétylation de l’histone H4 pourrait donc être impliquée dans la régulation de la transcription des unités Pol I chez le trypanosome. L’étape suivante a été de confirmer ces résultats en IF.
7.3. Colocalisation sur fibre de chromatine étirée.
Dans le cadre de cette étude, nous nous sommes rendus dans le laboratoire du Professeur K. Gull à l'Université de Manchester (Royaume-Uni) possédant une grande expertise concernant l’analyse microscopique du trypanosome. Le but poursuivi était d'apprendre une technique permettant de combiner l'hybridation in situ (FISH ou
« Fluorescence In Situ Hybridisation ») et l’IF sur fibre de chromatine étirée (Collas et al., 1999). Cette technique permet de mettre en évidence la colocalisation de protéines d’intérêt sur une séquence génomique particulière, l’étirement de la fibre rendant la chromatine plus accessible.
Par cette technique, nous avions l’intention de valider au niveau cellulaire les résultats obtenus en IP avec les anticorps dirigés contre TbH4.
Après les diverses mises au point concernant l’étirement de la chromatine, l’IF et le FISH, des premières tentatives de colocalisation ont été réalisées. L'IF a été réalisée avec les anticorps anti-TbH4 sous leur forme non acétylée ou acétylée ; le FISH, avec une sonde spécifique des gènes de tubuline α et β transcrits par une Pol II (les séquences de ces gènes sont répétées en tandem chez le trypanosome). Les résultats d’expériences préliminaires ont été encourageants car nous avons détecté en FISH les séquences répétées des gènes de tubuline α et β. Malheureusement, nous avons fait face à un manque de sensibilité de l’IF. En effet, les signaux les plus nets sont détectés au niveau de faisceaux de fibres de chromatine et non de fibres uniques (Fig.
30). Pour tenter d’augmenter la sensibilité et diminuer le bruit de fond de l’IF, nous avons décidé de purifier les anticorps.
Les deux sérums ont été purifiés par chromatographie d’affinité. Pour ce faire, le peptide d’intérêt (non acétylé ou acétylé) a été fixé sur un gel (BioRad Affi-Gel 10 agarose gel) par liaison covalente de type amide. Les sérums ont ensuite été purifiés par plusieurs passages sur le gel. L’utilisation des anticorps purifiés en Western blot a alors révélé moins de protéines que précédemment (Fig. 31A).
Un nouveau protocole de purification par affinité a néanmoins été mis en œuvre
dans le seul cas des anticorps dirigés contre TbH4-Ac étant donné que quelques
protéines étaient toujours reconnues de manière non spécifique (Fig. 31A). Le sérum
total anti-TbH4-Ac a dans un premier temps été mis au contact d’une résine couplée
Résultats et discussion
39
au peptide H4 non acétylé de manière à épuiser le sérum. Tous les anticorps spécifiques d’épitopes de l’histone H4 ne comprenant pas le groupement acétyle ont de cette manière été éliminés. Tout ce qui ne se liait pas à cette résine a ensuite été déposé sur colonne de résine couplée au peptide H4 acétylé. Les fractions éluées ont été testées en western blot (Fig. 31B). Des protéines reconnues de manière non spécifique ont de nouveau été décelées. Nous avons donc décidé de microséquencer (en collaboration avec Marc Dieu, Université de Namur) les protéines reconnues de manière différentielle par les deux sérums (Fig. 31B). Les protéines qui ont été révélées de manière non spécifique par le sérum anti-TbH4 n’interagissent pas avec la chromatine. Le signal plus faible en dessous de celui correspondant à Tb-H4 est probablement dû à une dégradation vu qu’il correspond également à Tb-H4. Le sérum anti-TbH4-Ac quant à lui révèle les histones TbH3 et TbH2A, probablement par leur groupement acétyle. Ces réactions croisées ne devraient donc pas perturber notre analyse du taux d’acétylation des histones au niveau des ESs en fonction de leur activité. Il s’agira de reproduire les expériences de colocalisation sur fibre de chromatine étirée en utilisant les sérums purifiés.
7.4. Attachement à la matrice nucléaire.
Dans le but de mettre en évidence un attachement différentiel des ESs en fonction de leur activité, nous nous sommes dans un premier temps attachés à mettre au point une technique dite d’électroélution de chromatine (Weipoltshammer et al., 1999). Des extraits cellulaires entiers sont lysés dans un tampon contenant entre autres du Triton X-100 de manière à perméabiliser le noyau sans perturber la matrice nucléaire. Une fois perméabilisés, les noyaux sont soumis à l’action d’enzymes de restriction spécifiques. Les noyaux sont ensuite déposés sur gel et soumis à un champ électrique. Ne migrent que les séquences qui seront détachées de la matrice par ce champ, séquences mises en évidence par Southern blot à l’aide de sondes spécifiques.
L’électroélution de chromatine digérée a été effectuée en parallèle sur les clones 20S71 et SW1 (Fig. 28). L’hybridation a été réalisée avec une sonde spécifique du gène de la luciférase. Les quatre tentatives effectuées débouchent sur trois résultats différents ; deux d’entre-elles ne montrent aucune différence, une tentative présente une bande supplémentaire détectée chez SW1 et une tentative présente une bande supplémentaire détectée chez 20S71. Vu le manque de reproductibilité de cette méthode, nous nous sommes lancés dans la mise au point d’une autre technique
« plus douce » (en association avec Hubert Renauld (Sanger Institute, Cambridge,
Royaume-Uni) qui fut post-doctorant au laboratoire).
Non traité CuSO
4+ LIS 37°C + LIS Halo
Fig. 32: Perméabilisation de noyaux au diiodosalicylate de lithium (LIS). Une forme
« nucléoïde » entourée d’un halo correspondant aux boucles de chromatine est observée par
coloration DAPI (4,6-DiAmino-2-PhénylIndole) lorsque l’on fixe les complexes ADN-matrice
nucléaire par une incubation à 37°C avant de réaliser le traitement au LIS.
Fig. 33: Représentation schématique de l’intensité des images de produits PCR obtenus par
l’intermédiaire d’amorces amplifiant le gène de résistance à la phléomycine (Ble), le gène VSG221, le gène ribosomique de la sous-unité 18S (TbRib) et le gène codant pour une sous-unité du facteur de transcription TFIIH (TbXpd). Ces réactions PCR ont été réalisées sur les fractions culot et surnageant (Sn) récoltées après isolement des matrices nucléaires des clones 20S71 (Ble actif et VSG221 inactif) et SW1 (Ble inactif et VSG221 actif) (Fig. 28).
Ces résultats montrent la fraction dans laquelle est préférentiellement localisé le site d’expression de VSG (VSG221 ou Ble) selon son activité ainsi qu’une unité de transcription Pol II (TbXpd) et une unité de transcription ribosomique (TbRib).
++++ bande très intense
+++ bande intense
++ bande de moyenne intensité + bande de faible intensité
- bande inexistante
++
++
TbXpd ++
++
TbXpd
++
++
TbRib ++
++
TbRib
+ ++++
VSG221 -
+ VSG221
++
++
Ble
SW1
- +++
Ble
20S71
Sn Culot
Produit Clone
Sn Culot
Produit
Clone
Résultats et discussion
40
Cette autre technique permet d’isoler des complexes ADN-matrice nucléaire à l’aide d’un traitement au diiodosalicylate de lithium (LIS) qui provoque une lyse douce de la membrane nucléaire (Mirkovitch et al., 1984; de Lange, 1992). Avant de rendre perméable les noyaux, les complexes ADN-matrice sont fixés par une incubation de 20 minutes à 37°C ou par ajout de CuSO
4. Une fois les noyaux rendus perméables grâce au LIS, les régions d’ADN non fixées à la matrice nucléaire (les boucles d’ADN) sont accessibles aux endonucléases alors que l’ADN associé à la matrice ne l’est pas. Un traitement endonucléolytique suivi d’une phase de centrifugation conduit à la séparation d’un culot constitué des complexes ADN-matrice et d’un surnageant constitué de fragments de boucles (Fig. 9). Lors de premiers essais, cette technique s’est avérée être très délicate. C’est pourquoi, nous nous sommes mis en contact avec Jovan Mirkovitch, concepteur de la méthode, pour la mettre au point chez le trypanosome.
Nous avons tout d’abord analysé au microscope à fluorescence les noyaux de trypanosomes après extraction par la méthode mise au point au laboratoire (Murphy et al., 1987). Une première constatation a été que le sucrose était nécessaire au maintien de la structure nucléaire. Ensuite nous avons procédé au traitement LIS, après fixation, avec quelques adaptations des méthodes décrites par Mirkovitch et al.
et De lange et al. (Mirkovitch et al., 1984; de Lange, 1992). Nous avons testé deux types de fixation proposés par ces auteurs à savoir la fixation avec du CuSO
4ou la fixation à 37°C. Des structures de type « halos » comme décrit dans la littérature ont été observées après fixation à 37 °C suivie du traitement au LIS (Fig. 32) (Cook et al., 1976; Vogelstein et al., 1980; Gerdes et al., 1994). L’expérience dans son ensemble a dès lors été envisagée.
L’expérience a été réalisée sur les clones 20S71 et SW1 (Fig. 28). Des réactions
PCR à l’aide d’amorces amplifiant spécifiquement le gène de résistance à la
phléomycine (produit Ble) ainsi que le VSG221 (produit VSG221) ont servi de premiers
tests (Fig. 33). Pour ce qui concerne le clone 20S71 où l’ES du VSG121 marqué par le
gène de résistance à la phléomycine est actif, un produit Ble est obtenu uniquement
dans la fraction culot. Pour le même clone un produit VSG221, correspondant à un
VSG situé dans un ES inactif, est aussi obtenu uniquement dans la fraction culot. Ce
dernier produit est cependant moins intense que le produit Ble. Dans le cas du clone
SW1, où l’ES du VSG121 est inactif, un produit Ble est amplifié dans les deux fractions
de manière équivalente. Par contre un produit VSG221, correspondant au VSG de l’ES
actif cette fois, est plus intense dans le culot que dans le surnageant. Il est aussi
amplifié de manière plus importante que le produit Ble. Ces résultats ont laissé
penser que le site d’expression actif était préférentiellement localisé dans la
Résultats et discussion
41
fraction culot. En d’autres termes, pour être actif, l’ES devait être associé à la matrice.
Dans le même temps, des réactions PCR à l’aide d’amorces amplifiant spécifiquement une région ribosomique (TbRib) ainsi qu’un gène codant pour un facteur de transcription (TbXpd) ont été réalisées. Chacune des réactions a amplifié un produit dans chacune des fractions pour chacun des clones (Fig. 33). Il a donc semblé que les unités de transcription, ribosomiques et Pol II, n’étaient pas contrôlées par un attachement différentiel à la matrice nucléaire.
Ces résultats préliminaires obtenus en PCR ont été encourageants mais nous n’avions aucun moyen de nous assurer que la PCR était quantitative. Nous avons dès lors voulu confirmer ces résultats par Southern blot. Pour ce faire, il fallait doser l’ADN récupéré en fin d’expérience. Cependant, des quantités faibles d’ADN difficilement dosables étaient récupérées en fin d’expérience. Pour pallier ce problème, nous avons modifié quelques points du protocole : la minimisation de la quantité de MgCl
2, l’utilisation d’un entraîneur lors de la précipitation et l’augmentation de la quantité d’EDTA. Un autre problème est alors survenu à savoir que l’EDTA précipitant avec l’éthanol, perturbait le spectre d’absorbance à 260 nm. Nous avons alors procédé au nettoyage des échantillons par passages sur colonnes « Centricon
®» (Millipore) ou par dialyses. Les quantités d’ADN récupérées étaient toujours assez faibles et très variées.
Le ratio culot/surnageant variait également d’une expérience à l’autre. Un Southern blot a néanmoins été réalisé avec l’ADN obtenu de deux expériences concernant 20S71. L’hybridation avec une sonde Ble a révélé dans chacun des cas un signal à la taille attendue uniquement présent voire plus intense dans la fraction surnageant. Ce résultat allait totalement à l’encontre de ce qui avait été obtenu en PCR.
Aucune conclusion n’a été tirée de ces expériences. La mise au point d’un protocole d’extraction de complexes ADN-matrice nucléaire chez le trypanosome a cependant été entamée. Il reste à améliorer le rendement et la reproductibilité de l’expérience.
8. L’élongation de la transcription au niveau des ESs.
Afin de rechercher les composants moléculaires pouvant être impliqués dans la
régulation de l’élongation de la transcription des ESs, deux voies de recherches ont
été poursuivies. D’une part nous nous sommes intéressés à un facteur général
d’élongation de la transcription nommé TFIIS dont le rôle nous a semblé intéressant
par rapport au modèle de régulation proposé par Vanhamme et al. (Vanhamme et al.,
Domaine I Domaine II Domaine III
1 77 148 238 265 309
« lin ker »
Fonction inconnue Liaison à la Pol II Stimulation du clivage de l’ARN
Fig. 34: Description schématique des domaines identifiés dans la structure du facteur général de
la transcription TFIIS chez la levure (Kettenberger
et al., 2003). Les positions des acides aminéslimitant ces domaines sont indiquées.
Résultats et discussion
42
2000). D’autre part, nous avons approché le mécanisme de manière plus générale en entamant la caractérisation du complexe de la Pol I du trypanosome.
8.1. TFIIS.
Comme déjà énoncé dans l’introduction, TFIIS est un facteur général d’élongation de la Pol II qui lui permet de redémarrer lorsqu’elle est bloquée par un site de pause. Ce facteur pourrait être impliqué dans la régulation de l’expression du VSG. En effet, en quantité limitante, il ne permettrait à la Pol de redémarrer la transcription qu’au niveau de l’ES actif. Il est vrai cependant que l’ES est transcrit par une Pol I. Un article décrivant l’implication de TFIIS dans l’élongation et le clivage de transcrits ribosomiques a appuyé notre choix (Schnapp et al., 1996). Un facteur d’élongation Pol II associé à la Pol I corroborerait notre modèle de Pol II
« RNA factory » associée à la Pol I du parasite. Même si cela s’avérait inexact, la caractérisation de ce facteur était d’autant plus intéressante qu’aucun facteur général de la transcription n’avait été caractérisé jusqu’alors.
Nous nous sommes donc lancés dans la caractérisation de ce facteur chez T.
brucei par invalidation à l’aide de l’outil qu’est le RNAi.
8.1.1 Structure.
La structure de TFIIS a été déterminée chez la levure (Morin et al., 1996;
Olmsted et al., 1998; Booth et al., 2000). TFIIS est constitué de trois domaines
structuraux (Wind et Reines, 2000). Les limites de ces domaines ont été redéfinies
récemment par Kettenberger et al. sur base d’un modèle tridimensionnel d’interaction
Pol II-TFIIS (Fig. 34) (Kettenberger et al., 2003). Un domaine I N-terminal est peu
conservé et de fonction inconnue. Les domaines II et III sont les plus conservés et
sont suffisants pour les fonctions connues de TFIIS in vitro et in vivo. Ces deux
domaines sont reliés par un court « linker » non structuré dont les résidus contribuent
à l’activité de TFIIS et confèrent une spécificité d’espèces aux interactions Pol II-TFIIS
(Awrey et al., 1998; Shimasaki et Kane, 2000). Le domaine II et « le linker » sont
requis pour la liaison à la Pol II (Awrey et al., 1998; Kettenberger et al., 2003). Le
domaine III constitue la partie la plus conservée du facteur TFIIS. Il est constitué d’un
motif appelé « zinc ribbon » où trois feuillets β anti-parallèles sont stabilisés par une
tétrade de cystéines qui chélatent le zinc (Wind et Reines, 2000). Ce domaine qui
semble interagir avec l’ARN (Kettenberger et al., 2003), est essentiel à la fonction de
Domaine PW WP
ScTFIIS TbTFIIS1 TbTFIIS2 1 467 213 1
309 1 141
Domain e II Domain e I D omain e III Fi g. 35 : Al ig n eme nts de s éque n ce s de 3 facteur s TFII S. Les sé que n ce s i n cl u ent l es facteu rs TFI IS de
T. brucei(T b T FI IS 1 e t T b T FI IS 2 ) ( G ene D B ID: re spec tive me nt T b 11.0 2 .260 0 e t T b 927 .2 .3580) e t
S. cerevisiae(Sc ) ( n
°d ’access io n G ene Bank: N P_011472 ). A . a lig ne ment sc hé matiq u e te nant c omp te d es div ers domaines du facteu r. B . Al ig nem ent des fragment s de s équen ce s c o rr es pon d a n t au x domai n es I I (flèch e gri s f o n cé) et I II ( flèch e gri s cl air) du fa cteu r TF II S en util is ant S cTFII S comme r éfér en ce. Le d oma ine d e lia is on a u Z in c ( « Zin c ri b b on ») ( Z B) d élimit é p ar 4 cys té ines (
z) est so ul ig né d’u n e f ine l ig ne al or s q u e le mo ti f c onservé Q .R S A D E ..T .F q u i le c o ns ti tu e es t s o u lign é d ’u n e lig ne é p ai ss e. L es a cides aminés id entiques e t s imil aires sont resp ectivement colorés en n oir et en gri s.
TbTFIIS1--------KWKTLLCKALMQGRKEEDEGRVADMALRIVKAIPGGRSESADTFRMLLVHLG TbTFIIS2TIGGGAQPQFVDRVQKLLLQPGDPHSFSVRSDDLRSVAEKICAEVTRSEDRM-YLLEHLS ScTFIISLRDQVLKALYDVLAKESEHPPQSILHTAKAIESEMNKVNNCDTNEAAYKARYRIIYSNVI TbTFIIS1DAKNRELRESIIEEKFSVEVLVRMKERDLLNPEERERQEAAFLARSRDTDLTEIRKATST TbTFIIS2KPGLSEIRRRLAMGELSGKDFLELSRWELMTQEEKEDAERRTTEKLR--NLEETERSLLH ScTFIISSKNNPDLKHKIANGDITPEFLATCDAKDLAPAPLKQKIEEIAKQNLYNAQGATIERSVTD TbTFIIS1TSTLFPCPSCKAKNCTWTQKQTRSADEPMTIFCICNICEHKWRRY57-213 TbTFIIS2TTSLFECPECHGRECEWRELQIRSADEPTTKFIKCIKCKHNWSEN290-467 ScTFIISR---FTCGKCKEKKVSYYQLQTRSADEPLTTFCTCEACGNRWKFS148-309
