Characterization of different milk protein aggregates by Asymmetrical Flow Field-Flow Fractionation coupled with Multiangle Laser Light Scattering (A4F-MALLS)

(1)

Characterization of different milk protein aggregates by Asymmetrical Flow Field-Flow Fractionation coupled with Multiangle Laser Light Scattering (A4F-MALLS)

T. Loiseleux

^1*

, A. Rolland-Sabate

¹

, C. Garnier

¹

, T. Croguennec

²

, S.

Guilois

¹

, M. Anton

¹

, A. Riaublanc

¹

1UR1268 INRA, Biopolymers Interactions Assemblies, Nantes, France

2UMR1253 INRA, Science and Technology of Milk and Egg, Rennes, France

* E-mail address: thibault.loiseleux@nantes.inra.fr

(2)

31 Mai 2017 Thibault Loiseleux

Introduction

^Méthode ^Résultats Conclusion et perspectives

Epaississants Gélifiants

(E407)

Natural product please!!!

Emulsion H/E

Contexte

Gélification de la phase continue

PROF I L

11 Industriels 6 Scientifiques

2

(3)

Introduction

 Utiliser les gouttes de matière grasse (MG) comme des nœuds pour texturer le produit sans utiliser d’agents de texture

 Utiliser des agrégats protéiques (Ag) pour stabiliser l’interface et connecter les gouttes de MG

Objectifs

Eliminer les texturants de type polysaccharides

Texturer des produits à faibles taux de MG

Objectifs

3

(4)

Introduction

Problématiques techniques

4  Nous voyons uniquement les grosses particules

 Pas de différenciation entre les grosses particules

DLS

SEC

 Les caséines interagissent avec la colonne

 Nous voyons les monomères alors que les agrégats sortent dans le volume mort ou

restent dans la colonne

Caséines

Protéines sériques

Agrégats de protéines laitières

Mélange monomères/agrégats

Systèmes polydispers

Différente taille/forme/densité

(5)

Introduction

Problématiques techniques

5 Trouver une technique séparative capable de fractionner les différentes entités y compris les assemblages avec

des caséines (contrairement à la SEC)

Asymmetrical Flow Field Flow Fractionation

(6)

Introduction

Méthode

Résultats Conclusion et

perspectives

Méthodes de fabrication des agrégats

Whey protein (WP)

Casein micelles (Cas)

Fractals Microgels

pH6.3

Ratio Cas/WP 82/18

Ratio Cas/WP 56/44

Ratio Cas/WP 30/70

Mixed 82/18 WP 82/18

Mixed 56/44 WP 56/44

Mixed 30/70 WP 30/70

Asymmetrical Flow Field Flow Fractionation coupled with Multiangle Laser Light Scattering (A4F-MALLS) + Transmission Electronic Microscopy

Heat

treatment Heat

treatment

1 2

3

6

(7)

Introduction

Méthode

Résultats Conclusion et

perspectives

Paramètres A4F et MET

Detectors

Fractal aggregates Microgel aggregates Mixed aggregates

Eluent (pH)

Millipore water containing 0.02 w/v%

NaN

₃

and 45 mM NaCl (pH 7)

Millipore water containing 0.02 w/v%

NaN

₃

and 45 mM NaCl (pH 7)

Millipore water containing 0.02 w/v% NaN

₃

, 45 mM

NaCl and 10mM CaCl

₂

(pH 6.3 or 7)

A4F method ² ¹ ²

Membrane Regenerated cellulose

Spacer (µm) ³⁵⁰

Temperature (°C) ²⁵

 MALLS

 UV Detector

 Differential Refractometer (DRi)

MET: Coloration négative

7

Elution : 2 min Focus : 2 min Focus + inject : 5 min

Relaxation : 1 min

(8)

Introduction

Résultats

Fractals

Méthode Conclusion et

perspectives

Méthodes de fabrication des agrégats

Whey protein (WP)

Casein micelles (Cas)

Fractals Microgels

pH6.3

Ratio Cas/WP 82/18

Ratio Cas/WP 56/44

Ratio Cas/WP 30/70

Mixed 82/18 WP 82/18

Mixed 56/44 WP 56/44

Mixed 30/70 WP 30/70

Asymmetrical Flow Field Flow Fractionation coupled with Multiangle Laser Light Scattering (A4F-MALLS) + Transmission Electronic Microscopy

Heat

treatment Heat

treatment

1 2

3

8

(9)

Introduction

Résultats

Fractals

perspectives

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1

0 10 20 30 40 50 60 70

N o rm a li ze d c o n ce n tr a ti o n ( A U )

Time (min)

Fractals

Conc. WPI

9

(10)

Introduction

Résultats

Fractals

perspectives

1 10 100 1000

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1

0 10 20 30 40 50 60 70

R a d iu s o f g y ra ti o n ( n m )

N o rm a li ze d c o n ce n tr a ti o n ( A U )

Time (min)

Fractals

Conc. WPI Conc. Fractals R

_G

Fractals

10

(11)

Introduction

Résultats

Fractals

perspectives

1 10 100 1000

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1

0 10 20 30 40 50 60 70

R a d iu s o f g y ra ti o n ( n m )

N o rm a li ze d c o n ce n tr a ti o n ( A U )

Time (min)

Fractals

Conc. WPI Conc. Fractals R

_G

Fractals

Df : 2.3

11

(12)

Introduction

Résultats

Microgels

perspectives

Méthodes de fabrication des agrégats

Whey protein (WP)

Casein micelles (Cas)

Fractals Microgels

pH6.3

Ratio Cas/WP 82/18

Ratio Cas/WP 56/44

Ratio Cas/WP 30/70

Mixed 82/18 WP 82/18

Mixed 56/44 WP 56/44

Mixed 30/70 WP 30/70

Asymmetrical Flow Field Flow Fractionation coupled with Multiangle Laser Light Scattering (A4F-MALLS) + Transmission Electronic Microscopy

Heat

treatment Heat

treatment

1 2

3

12

(13)

Introduction

Résultats

Microgels

perspectives

Microgels

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1

0 10 20 30 40 50

N o rm a li ze d c o n ce n tr a ti o n ( A U )

Time (min)

Conc. WPI

13

(14)

Introduction

Résultats

Microgels

perspectives

M

_W

= 8.4.10

⁷

g.mol

^-1

Microgels

10 100 1000

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1

0 10 20 30 40 50

R a d iu s o f g y ra ti o n ( n m )

N o rm a li ze d c o n ce n tr a ti o n ( A U )

Time (min)

Conc. WPI Conc. Microgels R

_G

Microgels

R

_G

= 100nm

M

_W

= 5.5.10

⁸

g.mol

^-1

14

(15)

Introduction

Résultats

Mixtes 82/18

perspectives

Méthodes de fabrication des agrégats

Whey protein (WP)

Casein micelles (Cas)

Fractals Microgels

pH6.3

Ratio Cas/WP 82/18

Ratio Cas/WP 56/44

Ratio Cas/WP 30/70

Mixed 82/18 WP 82/18

Mixed 56/44 WP 56/44

Mixed 30/70 WP 30/70

Asymmetrical Flow Field Flow Fractionation coupled with Multiangle Laser Light Scattering (A4F-MALLS) + Transmission Electronic Microscopy

Heat

treatment Heat

treatment

1 2

3

15

(16)

Introduction

Résultats

Mixtes 82/18

perspectives

Mixtes 82/18

1 10 100 1000

0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1

0 10 20 30 40 50 60 70 80

R a d iu s o f g ir a ti o n ( n m )

N o rm a li ze d C o n ce n tr a ti o n ( A U )

Times (min)

Conc. Caseines R

_G

Caseines

16

(17)

Introduction

Résultats

Mixtes 82/18

perspectives

Mixtes 82/18

1 10 100 1000

0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1

0 10 20 30 40 50 60 70 80

R a d iu s o f g ir a ti o n ( n m )

N o rm a li ze d C o n ce n tr a ti o n ( A U )

Times (min)

Conc. Caseines R

_G

Caseines Conc. WP82/18 R

_G

WP82/18

17

(18)

Introduction

Résultats

Mixtes 82/18

perspectives

Mixtes 82/18

1 10 100 1000

0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1

0 10 20 30 40 50 60 70 80

R a d iu s o f g ir a ti o n ( n m )

N o rm a li ze d C o n ce n tr a ti o n ( A U )

Times (min)

Conc. Caseines R

_G

Caseines Conc. WP82/18 R

_G

WP82/18

Conc. Mixtes 82/18 R

_G

Mixtes 82/18

18

(19)

Introduction

Résultats

Mixtes 82/18

perspectives

19 Mixtes 82/18

Pourquoi uniquement les micelles de grosses taille sont concernées?

 Plus grande quantité en nombre de caséines κ

 Encombrement stérique sur les petites micelles

X 21 X 7

(20)

Introduction

Résultats

Mixtes 82/18

perspectives

Mixtes 82/18

1 10 100 1000

0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1

0 10 20 30 40 50 60 70 80

R a d iu s o f g ir a ti o n ( n m )

N o rm a li ze d C o n ce n tr a ti o n ( A U )

Times (min)

Conc. Caseines R

_G

Caseines Conc. WP82/18 R

_G

WP82/18

Conc. Mixtes 82/18 R

_G

Mixtes 82/18

20

(21)

Introduction

Résultats

Mixtes 82/18

perspectives

Mixtes 82/18

1 10 100 1000

0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1

0 10 20 30 40 50 60 70 80

R a d iu s o f g ir a ti o n ( n m )

N o rm a li ze d C o n ce n tr a ti o n ( A U )

Times (min)

Conc. Caseines R

_G

Caseines Conc. WP82/18 R

_G

WP82/18

Conc. Mixtes 82/18 R

_G

Mixtes 82/18

21 R

_G

(nm) M

_W

(g.mol

^-1

)

MA 82/18; pH6.3 239.9 (+/- 1.9) 6.5.10

⁹

(+/- 0.24.10

⁹

)

Casein micelles 207.6 (+/- 2.1) 4.8.10

⁹

(+/- 0.19.10

⁹

)

(22)

Introduction

Résultats

Mixtes 82/18

perspectives

Mixtes 82/18

1 10 100 1000

0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1

0 10 20 30 40 50 60 70 80

R a d iu s o f g ir a ti o n ( n m )

N o rm a li ze d C o n ce n tr a ti o n ( A U )

Times (min)

Conc. Caseines R

_G

Caseines Conc. WP82/18 R

_G

WP82/18

Conc. Mixtes 82/18 R

_G

Mixtes 82/18

R

_G

(nm) M

_W

(g.mol

^-1

) MA 82/18; pH6.3 239.9 (+/- 1.9) 6.5.10

⁹

(+/- 0.24.10

⁹

)

Casein micelles 207.6 (+/- 2.1) 4.8.10

⁹

(+/- 0.19.10

⁹

) MA 82/18; pH 7 234.6 (+/- 1.6) 7.10

⁹

(+/- 0.22.10

⁹

)

22

(23)

Introduction

Résultats

Mixtes 56/44

perspectives

Méthodes de fabrication des agrégats

Whey protein (WP)

Casein micelles (Cas)

Fractals Microgels

pH6.3

Ratio Cas/WP 82/18

Ratio Cas/WP 56/44

Ratio Cas/WP 30/70

Mixed 82/18 WP 82/18

Mixed 56/44 WP 56/44

Mixed 30/70 WP 30/70

Asymmetrical Flow Field Flow Fractionation coupled with Multiangle Laser Light Scattering (A4F-MALLS) + Transmission Electronic Microscopy

Heat

treatment Heat

treatment

1 2

3

23

(24)

Introduction

Résultats

Mixtes 56/44

perspectives

24 Mixtes 56/44

1 10 100 1000

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1

0 10 20 30 40 50 60 70 80

R a d iu s o f g y ra ti o n ( n m )

N o rm a li ze d C o n ce n tr a ti o n ( A U )

Time (min)

Conc. Caseines

R

_G

Caseines

(25)

Introduction

Résultats

Mixtes 56/44

perspectives

25 Mixtes 56/44

1 10 100 1000

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1

0 10 20 30 40 50 60 70 80

R a d iu s o f g y ra ti o n ( n m )

N o rm a li ze d C o n ce n tr a ti o n ( A U )

Time (min)

Conc. Caseines R

_G

Caseines Conc. WP56/44 R

_G

WP56/44

Conc. Mixtes 56/44

R

_G

Mixtes 56/44

(26)

Introduction

Résultats

Mixtes 56/44

perspectives

26 Mixtes 56/44

1 10 100 1000

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1

0 10 20 30 40 50 60 70 80

R a d iu s o f g y ra ti o n ( n m )

N o rm a li ze d C o n ce n tr a ti o n ( A U )

Time (min)

Conc. Caseines R

_G

Caseines Conc. WP56/44 R

_G

WP56/44

Conc. Mixtes 56/44

R

_G

Mixtes 56/44

(27)

Introduction

Résultats

Mixtes 56/44

perspectives

27 Mixtes 56/44

Pourquoi nous avons un mélange d’éléments de différentes tailles et formes?

 Formation essentiellement de mixtes de petites tailles car peu de grosses micelles

 Présence d’agrégats fractals en solution car problème d’encombrement stérique sur les petites micelles (cinétique d’adsorption plus lente)

X 12 X 4

X

 Micelles

 Mixtes de petites tailles

 Fractals

(28)

Introduction

Résultats

Mixtes 56/44

perspectives

28 Mixtes 56/44

1 10 100 1000

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1

0 10 20 30 40 50 60 70 80

R a d iu s o f g y ra ti o n ( n m )

N o rm a li ze d C o n ce n tr a ti o n ( A U )

Time (min)

Conc. Caseines R

_G

Caseines Conc. WP56/44 R

_G

WP56/44

Conc. Mixtes 56/44

R

_G

Mixtes 56/44

(29)

Introduction

Résultats

Mixtes 30/70

perspectives

Méthodes de fabrication des agrégats

Whey protein (WP)

Casein micelles (Cas)

Fractals Microgels

pH6.3

Ratio Cas/WP 82/18

Ratio Cas/WP 56/44

Ratio Cas/WP 30/70

Mixed 82/18 WP 82/18

Mixed 56/44 WP 56/44

Mixed 30/70 WP 30/70

Asymmetrical Flow Field Flow Fractionation coupled with Multiangle Laser Light Scattering (A4F-MALLS) + Transmission Electronic Microscopy

Heat

treatment Heat

treatment

1 2

3

29

(30)

Introduction

Résultats

Mixtes 30/70

perspectives

30 1 10 100 1000

0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1

0 10 20 30 40 50 60 70 80

R a d iu s o f g ir a ti o n ( n m )

N o rm a li ze d C o n ce n tr a ti o n ( A U )

Times (min)

Mixtes 30/70

Conc. Caseines

R

_G

Caseines

(31)

Introduction

Résultats

Mixtes 30/70

perspectives

31 1 10 100 1000

0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1

0 10 20 30 40 50 60 70 80

R a d iu s o f g ir a ti o n ( n m )

N o rm a li ze d C o n ce n tr a ti o n ( A U )

Times (min)

Mixtes 30/70

Conc. Caseines

R

_G

Caseines

Conc. WP70/30

R

_G

WP70/30

(32)

Introduction

Résultats

Mixtes 30/70

perspectives

32 1 10 100 1000

0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1

0 10 20 30 40 50 60 70 80

R a d iu s o f g ir a ti o n ( n m )

N o rm a li ze d C o n ce n tr a ti o n ( A U )

Times (min)

Mixtes 30/70

Conc. Caseines R

_G

Caseines Conc. WP70/30 R

_G

WP70/30

Conc. Mixtes 70/30

R

_G

Mixtes 70/30

(33)

Introduction

Résultats

Mixtes 30/70

perspectives

33 Mixtes 30/70

Pourquoi le profil des mixtes 30/70 et des fractals sont similaires?

 Très peu de petites caséines présentent dans la solution et quasiment aucune grosse micelle

X 3

X

(34)

Introduction

Résultats

Mixtes 30/70

perspectives

34 1 10 100 1000

0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1

0 10 20 30 40 50 60 70 80

R a d iu s o f g ir a ti o n ( n m )

N o rm a li ze d C o n ce n tr a ti o n ( A U )

Times (min)

Mixtes 30/70

Conc. Caseines R

_G

Caseines Conc. WP70/30 R

_G

WP70/30

Conc. Mixtes 70/30

R

_G

Mixtes 70/30

(35)

Introduction Méthode Résultats Conclusion

Le plus industriel

35 Conclusion

+

 Polydisperses

 Mélange monomères/agrégats

 Différente taille et forme

 Présence de caséines DLS

SEC

Asymmetrical Flow Field Flow

Fractionation

Fractionner les monomère et les agrégats

Fractionner les agrégats

Travailler avec des agrégats contenant des micelles

Idée des mécanismes de formation des agrégats mixtes

A4F

(36)

Merci de votre attention

T. Loiseleux

^1*

, A. Rolland-Sabate

¹

, C. Garnier

¹

, T. Croguennec

²

, S.

Guilois

¹

, M. Anton

¹

, A. Riaublanc

¹

1UR1268 INRA, Biopolymers Interactions Assemblies, Nantes, France

2UMR1253 INRA, Science and Technology of Milk and Egg, Rennes, France

* E-mail address: thibault.loiseleux@nantes.inra.fr