Mise au point d’une méthode manuelle alternative dans la détermination de l’hématocrite

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REPUBLIQUE DU BENIN

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ECOLE POLYTECHNIQUE D’ABOMEY-CALAVI

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CENTRE AUTONOME DE PERFECTIONNEMENT (CAP)

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Mémoire de fin de formation en vue de l’obtention du diplôme de

LICENCE PROFESSIONNELLE Spécialité : Analyses Biomédicales

THEME:

Présenté par :

DOFONSOUHOU Toundé Florent

Tuteur : Superviseur :

Mr HOUSSOU Loukman Dr Jean Robert KLOTOE

Technicien de laboratoire Maître-assistant de Physiologie - Pharmacologie

REPUBLIQUE DU BENIN

Mise au point d’une méthode manuelle alternative dans la détermination de l’hématocrite

Année académique 2016-2017

Président du Jury : Dr. YADOULETON Anges Membre : 1) Dr. KLOTOE Jean Robert

2) Dr. BAGLO D. Tatiana

(2)

Réalisé par DOFONSOUHOU Florent Page 2

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MINISTERE DE L’ENSEIGNEMENT SUPERIEUR ET DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE

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UNIVERSITE D’ABOMEY-CALAVI

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ECOLE POLYTECHNIQUE D’ABOMEY-CALAVI

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DEPARTEMENT DE GENIE DE BIOLOGIE HUMAINE

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DIRECTEUR

Professeur SOUMANOU Mohamed

DIRECTEUR ADJOINT Docteur AHOUANNOU Clément

CHEF DE DEPARTEMENT Docteur ATCHADE Pascal

CHEF CAP

Professeur AWANTO Christophe

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LISTE DES ENSEIGNANTS DU DEPARTEMENT DE GENIE DE BIOLOGIE HUMAINE (GBH)

I-ENSEIGNANTS PERMANENTS

N° Noms et prénoms Matières enseignées

1 AGBANGNAN Pascal Méthodologie de la recherche

2 AHOYO Angèle Théodora Microbiologie médicale et TP de Microbiologie médicale, Santé Publique, Hygiène hospitalière 3 AKOWANOU Christian D Physique

4 AKPOVI Casimir Biologie cellulaire, Physiologie cellulaire,

Biochimie métabolique des lipides et enzymologie

5 ALAMOU Eric Biostatistique

6 ALITONOU Guy Chimie organique

7 ANAGO Eugénie Biochimie clinique

8 ATCHADE Pascal Parasitologie médicale et appliquée-mycologie 9 BANKOLE Honoré Bactériologie médicale et TP Bactériologie médical 10 DOUGNON Victorien Déontologie médicale et méthodologie de la

recherche

11 FAH Lauris Histologie médical, biochimie métabolique des glucides et immuno –hématologie

12 FANOU Brice Armand TP microbiologie médicale et Assurance Qualité en biologie médicale

13 HOUNSOSSOU Hubert Anatomie général

14 KLOTOE Jean Robert Santé et sécurité au laboratoire, Equipement Biomédicaux, Cytologie sanguine et Hémostase 15 LOKO Frédéric Biochimie analytique

16 LOZES Evelyne Immunologie générale et Immunopathologie 17 SEGBO Julien Biochimie structurale, Biologie moléculaire et

Biologie moléculaire appliquée

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Liste des enseignants permanents (suite)

18 SENOU Maxime Histologie Spéciale et Hémopathies 19 TCHOBO Fidèle Paul Chimie générale

20 YADOULETON Anges Entomologie médicale 21 YEHOUENOU Boniface Microbiologie générale

Liste des enseignants non permanents

N° Nom et prénoms Matières enseignées

1 AGBANNON Tiburce Gestion des entreprises et gestion hospitalière 2 AGOSSOU Gilles Droit de travail

3 DESSOUASSI Noel Biophysique des solutions

4 HOUNNON Hypolite Mathématique

5 KOUNASSO Gabriel Informatique médicale

6 YOVO Kokou Paulin Toxicologie et Pharmacologie

(5)

A

 mes épouses KINTOKONOU A. Lucienne et GBODOGBE M. Sonia.

Pour votre esprit de sacrifice et de dévouement que vous avez consenti à mon égard.

Veuillez trouver en ce travail un motif de consolation et ma profonde gratitude.

Que le miséricordieux vous gratifie de sa bonté inestimable pour votre assistance dans la réalisation de ce document.

Dédicace

(6)

Il y a des choses dans la vie qu’on ne peut imaginer, encore moins réaliser sans l’aval et le précieux concours de certaines personnes ressources. Leur méconnaître le mérite inhérent à sa sollicitude serait tout simplement de l’ingratitude.

C’est pour cela que je tiens à adresser mes sincères remerciements et à exprimer ma reconnaissance à tous ceux qui ont apporté leur contribution à l’amélioration de ce mémoire, en l’occurrence :

- Mon maître de mémoire, Dr Jean Robert KLOTOE, qui en dépit de ses multiples occupations, a accepté de diriger ce travail. Sa simplicité, sa jovialité, son amour du travail bien fait et sa maîtrise des contours du sujet ont toujours forcé mon admiration.

Daignez trouver ici le témoignage déférent de ma profonde gratitude.

- Mon tuteur, M. HOUSSOU Loukman, Merci du plus profond de mon cœur pour l’aide inestimable que vous m’avez apportée, dans tous les domaines et sans restriction aucune.Votre amour pour le travail bien et ordonné a indéniablement facilité ce travail qui s’est déroulé dans la bonne ambiance qui règne toujours autour de vous. Puisse Dieu vous accorder une longue vie bénie de toutes grâces.

- Les Biotechnologistes du CHUD-OP et du Laboratoire PEACE - LABO de l’ONG AIESCB, en particulier les sieurs Martin HEVIEFO, KOUDOKPODE S. Moise, LAGUIDE Warissi, AHOUITONON Serge.

Je ne saurai dire combien votre gentillesse et votre volonté de réussir m’ont marqué tout au long de ce travail. Veuillez accepter ici l’expression de ma profonde reconnaissance.

Remerciements

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- Tous les enseignants de l’Ecole Polytechnique d’Abomey-Calavi en général et en particulier ceux du CAP pour avoir contribué à ma formation.

- Tout le personnel du Centre de Santé Akpro-Missérété pour votre esprit de collaboration et de fraternité. Recevez mes sincères gratitudes.

- Vous mes chers parents :

o Mon feu père DOFONSOUHOU S. Félix o Ma mère Mme HOUEVOESSA A. Solange,

o Mes frères et sœur : YETONGBE Anicet, DOFONSOUHOU Elie, DOFONSOUHOU François, DOFONSOUHOU Jonas,

DOFONSOUHOU Fernando, DOFONSOUHOU Rita,

Pour votre soutien moral et financier que vous avez consenti à mon égard.

Veuillez trouver en ce travail un motif de consolation et ma profonde gratitude. . - A tous ceux qui de près ou de loin ont contribué à la rédaction de ce

mémoire.

(8)

Excellence, le Président du Jury

C’est un grand honneur que vous nous faites en acceptant de présider en ce jour le Jury de soutenance malgré vos multiples occupations.

Cher président, de par vos observations, nous espérons améliorer ce travail. Veuillez accepter l’expression de notre profond respect et de notre vive gratitude.

 Honorables membres du Jury

Nous sommes touchés par l’honneur que vous nous faites en acceptant de siéger dans le Jury de soutenance de notre rapport de fin de formation.

Vos remarques et suggestions contribueront à l’amélioration de la qualité scientifique de ce travail.

Nous vous prions de recevoir, nos hommages respectueux.

Hommages

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LISTE DES SIGLES ET ABREVIATIONS

EDTA Ethylène Diamine Tétra Acétique

EPAC Ecole Polytechnique d’Abomey-Calavi

CHUD-OP Centre Hospitalier Universitaire Départemental de l’Ouémé et du plateau

AIESCS Association pour l’information et l’éducation sur la santé communautaire du Bénin

The Hématocrite

tr/min Tours par minutes

Min Minutes

Hb Hémoglobine

NCCLS National committee for clinical laboratory standards

PCV Packed cell volume

Ml Millilitre

CV coefficient de variation TxHb Taux d’hémoglobine

CAP Centre autonome de perfectionnement

Km² Killomètrecarré

g/dl Gramme par décilitre

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LISTE DES TABLEAUX ET FIGURES

LISTE DES TABLEAUX N° de

tableau Titre Page

Tableau I Répartition des échantillons en fonction du taux d’hémoglobine

34

Tableau II Correlations des échantillons appariés 35 Tableau III Statistiques des échantillons appariés 37 Tableau IV Résultat du Test des échantillons appariés 39

LISTE DES

FIGURES

Figure 1: Principaux mécanismes de variations de l'hématocrite (d'après

Duhamel [15]). ... 21 Figure 2: Principe de mesure de la conductibilité. ... 24 Figure 3:Description par Coulter de son système de comptage des cellules

sanguines (d'après [18]) ... 26 Figure 4: Schéma simplifié du principe Coulter ... 26 Figure 5: Représentation en box plot des valeurs d’hématocrite suivant les

méthodes………..………...36 Figure 6: Influence de la vitesse de centrifugation sur l’hématocrite ... 38 Figure 7: Influence du temps de centrifugation sur l’hématocrite ... 38

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RESUME

L’hématocrite est un paramètre très important dans le typage de l’anémie. En absence d’automate d’hématologie ou de centrifugeuse à hématocrite, sa détermination est impossible.

Cette étude a eu pour objectif la mise au point d’une méthode alternative de détermination de l’hématocrite à partir de la centrifugeuse à rotor oblique standard.

Pour ce faire, 500 échantillons de sang prélevés sur EDTA ont été soumis à différentes techniques de mesure de l’Hte : 1000tr/min pendant 5min ; 3000tr/min pendant 5min ; 5000tr/min pendant 5min ; 5000tr/min pendant 10min et 5000tr/min pendant 20min. La centrifugation à 12000tr/min pendant 5min a été considérée comme méthode de référence.

Les résultats ont révélé une variation de la valeur de l’hématocrite suivant la vitesse de centrifugation et suivant le temps de centrifugation. Une forte corrélation (R² ≥ 0,95) a été observée entre la méthode de référence et les techniques de centrifugation à 5000tr/min pendant 10min et pendant 20min.

Mais seule la centrifugation à 5000tr/min pendant 20min a donné des résultats statistiquement égaux à la méthode de référence.

La centrifugation à 5000tr/min pendant 20min peut donc être utilisée comme méthode alternative dans la détermination de l’hématocrite.

Mots clés : hématocrite ; centrifugation ; référence ; corrélation.

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ABSTRACT

Hematocrit is a very important parameter in the typing of anemia. In the absence of a hematology automaton or a hematocrit centrifuge, its determination is impossible.

The purpose of this study was to develop an alternative method for determining hematocrit from the standard oblique rotor centrifuge.

To do this, 500 blood samples taken on EDTA were subjected to different techniques of measurement of Hte: 1000tr / min for 5min; 3000rpm for 5min;

5000rpm for 5min; 5000rpm for 10min and 5000rpm for 20min. Centrifugation at 12000 rpm for 5 min was considered as a reference method.

The results revealed a change in the value of the hematocrit according to the centrifugation rate and the centrifugation time. A strong correlation (R² ≥ 0.95) was observed between the reference method and centrifugation techniques at 5000rpm for 10min and for 20min. But only centrifugation at 5000rpm for 20min gave results statistically equal to the reference method.

Centrifugation at 5000 rpm for 20 min can therefore be used as an alternative method in the determination of hematocrit.

Key words: hematocrit; centrifugation; reference; correlation.

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Plan

Introduction

I. Synthèse de littérature II. Matériel et méthodes III. Résultats et discussion

Conclusion

Références bibliographiques

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INTRODUCTION

Parmi les paramètres d’exploration érythrocytaire, l’hématocrite est l’un des plus courants. Il indique le pourcentage du volume occupé par les globules rouges par rapport au volume total du sang. Bien qu’il existe plusieurs méthodes automatiques, la centrifugation demeure la méthode de référence en matière de détermination de l’hématocrite[1]. Elle permet de séparer les composants solides du sang des composants liquides et de les concentrer. Cette méthode est définie dans la norme DIN 58933-11. Conformément à cette dernière, les tubes capillaires en verre sont centrifugés jusqu’à ce que le produit de l’accélération centrifuge relative minimale agissant sur les érythrocytes (ACR ≥ 5000) et de la valeur numérique du temps de centrifugation en minutes s’élève à au moins 100 000[2 ; 3]. Ainsi, pour les centrifugeuses à hématocrite (ACR max 15 000 à 20 000), le temps de centrifugation est en moyenne de 5min. Mais peu de laboratoire dispose encore de ces types de centrifugeuses de nos jours. En effet, dans les laboratoires dotés d’automate d’hématologie, les autres petits matériels précédemment utilisés pour l’hémogramme tendent à disparaitre [1]. Les autrespetits laboratoires n’ont généralement que les centrifugeuses à rotor oblique (ACR < 5000). Cette situation engendre des difficultés pour la détermination de l’hématocrite par les techniciens biologistes. Certains optent alors pour une approche estimativeen utilisant ce que Savage décrit comme la

"règle des 3 et 9" (Numération des rouges en millions x 9 = Hte) et (Hb x 3 = Hte)[4]. D’autres ont recourt à une centrifugation des tubes à hématocrite par les centrifugeuses obliques. Dans un cas ou l’autre, la fiabilité du résultat est en cause.

Peut-on alors trouver une méthode alternative qui permette de déterminer efficacement l’hématocrite à partir de l’utilisation de la centrifugeuse à rotor oblique standard ?

C’est dans le but d’apporter une réponse à cette question que la présente étude a été réalisée. Elle vise les objectifs suivants :

(15)

Objectif général :

Mettre au point une méthode de détermination efficace de l’hématocrite à partir de centrifugeuse à rotor oblique standard.

Objectifs spécifiques :

- Evaluer la corrélation entre la méthode de référence et les techniques expérimentales

- Identifier la vitesse et le temps de centrifugation idéal pour une détermination de l’hématocrite à partir de centrifugeuse à rotor oblique standard

Le présent travail, hormis l'introduction et la conclusion, est organisé en trois parties :

- La première abordera la synthèse de littérature sur l’hématocrite, - La seconde traitera du matériel et des méthodes,

- La troisième présentera les résultats et la discussion

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I. SYNTHESE DE LITTERATURE

(17)

1. DEFINITION ET HISTORIQUE

A l'origine, l'hématocrite (du grec « haima » qui signifie sang séparé) est le nom de l'appareil conçu par Wintrobe en 1929 [1] pour mesurer le volume de globules par rapport à celui du sang qui les contient. Par extension, et de façon maintenant exclusive, c'est le résultat de l'examen effectué avec cet appareil.

Dans la technique originale, on utilise un tube de verre gradué de 0 à 100, long de 11 cm, que l'on remplit avec plusieurs millilitres de sang oxalaté et dans lequel on sépare par centrifugation la masse des globules rouges de celle du plasma.

En anglais, les termes packedcell volume (PCV) et hematocrit(Hct) sont souvent considérés comme synonymes. Dans la brochure du NCCLS (National committee for clinicallaboratory standards) [2] décrivant la technique utilisée pour la mesure du micro hématocrite, le sous-comité responsable retient définitivement le terme packedcell volume pour définir la valeur obtenue par centrifugation et réserve le terme hématocrite pour décrire le matériel et les méthodes utilisées. En France comme au Bénin, le terme hématocrite est utilisé dans tous les cas.

On peut dire que l'hématocrite reflète la même variable biologique que l'hémoglobine. Toutefois, compte tenu de son antériorité et de la simplicité de sa technique initiale de mesure par comparaison avec celle de l'hémoglobine, l'hématocrite est resté très populaire jusqu'à ce que l'industrie mette à la disposition des biologistes, et maintenant des cliniciens, des photomètres ou des spectrophotomètres simples, fiables et performants.

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2. DIFFERENTES SORTES D’HEMATOCRITES 2.1. Hématocrite veineux

Comme son nom l’indique, l’hématocrite veineux est la valeur de l’hématocrite après centrifugation du sang veineux. Cette valeur est couramment utilisée. Elle est encore appelée hématocrite centrifugé ou hématocrite périphérique. [1]

2.2. Hématocrite Corrigée

Il a été constaté qu’après centrifugation du sang, il persiste encore en moyenne 5% du plasma dans le volume occupé par le culot globulaire. C’est la raison pour laquelle, il a été suggéré qu’on applique à l’hématocrite veineux un facteur de correction pour plus de précisions.

[1]

2.3. Hématocrite Somatique

Le sang veineux étant plus concentré que le sang artériel, l’hématocrite de la circulation totale est inférieur à celui de l’hématocrite veineux.

2.4. Hématocrite réel

De ce qui précède, l’estimation de l’hématocrite réel nécessite une double correction par rapport à l’hématocrite veineux lu.

Hte © = Hte (V) x 0,95

Hte (S) = Hte (V) x 0,90

[1]

(19)

On a alors :

Hte réel= Hte (V) x 0,95 x 0,90

Hte réel= Hte (V) x 0,86

3. VALEURS NORMALES

Le volume des globules rouges est normalement de 40 à 45 mL pour 100 mL de sang chez l'homme et de 38 à 42 mL chez la femme. Selon les auteurs, les pays, les habitudes, le résultat est exprimé en pourcentage ou (mieux) par un nombre décimal [3, 4] (par exemple 45 % ou 0,45). Le dictionnaire des constantes biologiques [5] donne des fourchettes de 40 à 54 % - moyenne 45 % (homme) et de 37 à 47 % - moyenne 42 % (femme) et Tietz [6] de respectivement 41 à 53 % et 36 à 46 %. Les valeurs sont légèrement plus faibles (environ - 1,5 %) chez les noirs [7, 8]. On observe en outre chez un même sujet des variations au cours de la journée [9-11] et selon la posture [12, 13]. Dans un travail très important concernant la plupart des analystes de biologie clinique, Ricoset al. [14] font état d'un coefficient de variation (CV) de 2,8 % pour un même sujet et 6,4 % de sujet à sujet. L'hématocrite ne semble pas varier avec l'âge.

La mesure de l'hématocrite (Hte) est encore fréquemment demandée, en particulier pour évaluer les pertes sanguines et surveiller l'évolution des patients sous thérapeutique appropriée. Il fait partie intégrante de l'hémogramme (au même titre d'ailleurs que TxHb) tel que défini par la nomenclature des actes de biologie. Il y figure également de façon isolée (acte 2108 - B10).

La concentration moyenne en hémoglobine exprimée en unités conventionnelles étant de 15 g/dL, on considère habituellement un rapport de 0,33 entre l'hémoglobine et l'hématocrite et, sur certains appareils, on utilise cette valeur

[1]

(20)

pour calculer Hte à partir de TxHb mesurée. À l'inverse, sur d'autres appareils, le facteur de division " 3 " est utilisé pour calculer TxHb à partir d'Hte mesuré.

Cela n'est pas sans danger et nous y reviendrons. La plupart des analyseurs des gaz du sang " combinés " mesurent un de ces analystes et calculent l'autre.

Certains mesurent les deux.

4. VARIATIONS

La classification et les schémas qui suivent sont empruntés à Duhamel [15].

Dans les conditions normales, la quantité de globules rouges est proportionnelle au volume sanguin total (figure 1a). En cas d'anémie récente due à unehémorragie aiguë, on observe une perte parallèle de globules et de plasma.

L'hématocrite peut rester normal pendant les six heures suivant l'accident (figure 1b). Dans l'anémie chronique, la perte de volume érythrocytaire est compensée par une augmentation du volume plasmatique et l'hématocrite diminue (figure 1c). Dans l'hydrémie consécutive à la néphrite œdémateuse ou à certaines insuffisances cardiaques le volume globulaire ne varie pas mais le volume plasmatique augmente et l'hématocrite diminue (figure 1d). En cas d'hémoconcentration consécutive à des brûlures récentes ou à certains états de choc toxique ou infectieux, le volume d'érythrocytes reste normal mais le volume plasmatique diminue. L'hématocrite augmente (et donne une fausse idée d'hyperglobulie). Chez les brûlés, ce phénomène est suivi d'une anémie sévère, due à la combinaison de plusieurs facteurs (figure 1e). En cas de polyglobulie vraie (hypervolémie - maladie de Vaquez, insuffisance ventriculaire droite) les volumes globulaire et plasmatique augmentent, mais le premier proportionnellement plus que le second. L'hématocrite augmente (figure 1f).

(21)

Figure 1: Principaux mécanismes de variations de l'hématocrite (d'après Duhamel [15]).

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5. METHODES DE MESURE

Pour mémoire, rappelons qu'un " dispositif permettant la détermination de l'hématocrite " fait partie de la liste de l'instrumentation obligatoire dans un laboratoire d'analyses médicales (Arrêté du 2. 11. 1994 relatifs à la bonne exécution des analyses de biologie médicale. Titre 2. Chapitre 3. Alinéa 3.4.3).

5.1. Méthode manuelle

La méthode (microhématocrite) est directement dérivée de la méthode originale et s'applique en principe au sang veineux ou capillaire. Le sang veineux est prélevé sur EDTA, le sang capillaire sur tube hépariné. La centrifugation doit intervenir dès que possible, mais un délai maximum de six heures semble acceptable. Le tube capillaire doit être scellé avec une cire spéciale, mais certains utilisent encore le scellement à la flamme, procédé peu recommandable.

La centrifugeuse à micro hématocrite doit présenter des caractéristiques bien particulières, décrites en détail dans le document du NCCLS [2]. Elle doit en particulier être capable de fournir une gravité artificielle de 10 000 à 15 000 g à la périphérie pendantau moinscinq minutessans excéder une température internede 45 °C. La lecture finale directe est habituellement effectuée à l'aide d'une échelle circulaire spéciale fournie avec la centrifugeuse.

Pour le NCCLS [2] c'est la méthode de référence. Très connue, cette méthode présente un niveau de précision acceptable et ne nécessite qu'une instrumentation simple. Les sources d'erreurs sont identifiées et habituellement se compensent mutuellement. Elle pose toutefois un certain nombre de problèmes technologiques et pratiques sur lesquels nous reviendrons. À ce stade, observons seulement que le niveau de performance analytique demandé par le sous-comité du NCCLS (détection de différences de 0,5 % et répétabilité de lecture de ± 0,25 %) est très rarement atteint. Dans le travail de Ricos et al. [14], les limites supérieures des " spécifications souhaitables " ont une précision de 1,4 %, un biais de 1,7 % et une erreur totale de 4,1 % (p < 0,05).

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Les contrôles de qualité du College of americanpathologists montrent des CV situés le plus souvent autour de 3,0 à 5,0 %. Au Bénin, l’inexistence d’un systèmenational de contrôle de qualité ne permet pas de donner une statistique à son propos.

Il faut savoir que l'hématocrite capillaire ou artériel est d'environ 1 à 2 % inférieur à l'hématocrite veineux. Cela est lié aux mouvements d'eau (entre plasma et globules rouges) destinés à maintenir l'équilibre osmotique entre ces deux phases lors des mouvements ioniques liés au transport du CO2 dans le sang. La conséquence est un léger gonflement des érythrocytes " veineux " par rapport aux érythrocytes " artériels ", donc un hématocrite veineux plus élevé que l'hématocrite artériel [16].

5.2. Méthodes automatiques

Comme les méthodes utilisées font appel à la conductivité, quelques notions fondamentales de conductimétrie [17] sont rappelées dans la figure 2. Il existe de nombreuses applications des mesures de conductivité en chimie analytique et dans l'industrie (surveillance de processus chimiques, industrie alimentaire et pharmaceutique, préparation d'eau pure et ultrapure...). Dans les années 1950, la mesure de résistivité du plasma était utilisée pour évaluer globalement sa concentration totale en électrolytes en vue d'un diagnostic précoce d'hypertonie osmotique.

(24)

Figure 2:Principe de mesure de la conductibilité.

Lorsque deux électrodes sont immergées dans une solution conductrice (électrolyte) et reliées à une source électrique un courant est généré, qui circule entre les deux. Sa valeur est liée à la tension E appliquée entre les deux électrodes et à la résistance électrique R du " segment " de solution présent entre elles. En ne tenant pas compte des réactions éventuelles au niveau même des électrodes ou d'autres phénomènes annexes, la relation entre ces trois variables est exprimée par la loi d'Ohm : I = E/R, I = courant (en ampères), E = volts et R

= ohms. La conductance L est définie comme l'inverse de la résistance. I = EL.

L'unité de conductance L = 1/W (ou mho, ou Siemens = S). La conductivité est la conductance rapportée à l'unité de longueur. L'unité de conductivité est donc le S/cm. La résistivité est la résistance d'un cylindre d'un matériau conducteur dont on définit la longueur et la section. La conductance d'une solution, mesurée dans les conditions ci-dessus, dépend des caractéristiques spécifiques de l'appareil de mesure : distance d entre les électrodes (relation inverse) et surfaces a de celles-ci (relation directe). Elle dépend également de la concentration en ions ci dans l'unité de volume de la solution et de la conductance ionique équivalente lambda de ces ions. Nous pouvons donc écrire : L = a/d S cilambdai.

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Le symbole de somme S traduit le fait que les contributions à la conductance des divers ions présents dans la solution sont additives. Notons que pour éviter des complications liées à une électrolyse, la tension appliquée aux électrodes est alternative (fréquence d'environ 1 kHz). En outre, comme la conductivité varie sensiblement et proportionnellement en fonction de la température (augmentation de 2 à 3 % par degré celsius), la ligne de mesure doit être soigneusement thermostatée.

5.2.1. Le principe Coulter

Dans le principe décrit par Coulter (1956) [18] les cellules sanguines sont utilisées pour interrompre un courant passant entre deux électrodes. Le signal ainsi produit [19] est détecté et analysé. Les cellules sanguines, dont les membranes lipidiques sont non-conductrices, présentent une résistivité élevée et se comportent comme des isolants vis-à-vis d'un courant électrique à basse fréquence. La description ci-dessous et la figure 3 sont extraites de la présentation originale de Wallace Coulter à la National electronicsconference (États-Unis) en 1958 : " Une suspension très diluée de cellules est contenue dans un bécher E où l'on a immergé une électrode D. Un tube B est muni d'un orifice A très petit au travers duquel un volume très exactement défini de cette suspension est aspiré. La seconde électrode C est immergée dans ce tube.

Chaque fois qu'une cellule sanguine passe à travers l'orifice A, elle provoque une impulsion (liée à l'augmentation temporaire de résistivité) dont l'amplitude dépend de la taille de la cellule. Les impulsions sont comptées et leurs amplitudes mesurées. Connaissant le volume de suspension aspiré et le rapport initial de dilution on peut en déduire le nombre de cellules dans un volume de sang donné et mesurer leurs tailles. L'hématocrite peut être aisément calculé. ".

Pour la discussion qui suivra, il est très important de noter qu'ici le spécimen original est très dilué (habituellement 1/6 250). La figure 4 est une simplification de la précédente et permet de mieux comprendre la procédure utilisée.

(26)

Figure 3:Description par Coulter de son système de comptage des cellules sanguines (d'après [18])

Figure 4: Schéma simplifié du principe Coulter(d'après [18])

5.2.2. Le laser

Dans cette méthode plus récente le spécimen sanguin, très dilué comme dans le principe Coulter, passe dans une cuve en continu où il est exposé à un rayon laser. Chaque fois qu'une cellule traverse le faisceau, elle déclenche une impulsion dont l'amplitude est proportionnelle à son volume et à son contenu en hémoglobine.

(27)

Connaissant le volume de spécimen dilué ayant traversé la cuve et après traitement électronique approprié des impulsions, la valeur de l'hématocrite peut être calculée. Chez Bayer, afin que toutes les hématies donnent un signal assez identique quelle que soit leur position dans la cellule lors du comptage (face ou profil), elles subissent au préalable une sphérisationisovolsumétrique selon un procédé breveté. Une diffraction laser (petit angle) permet de mesurer le volume de la cellule. Une diffraction laser (grand angle) permet de mesurer la concentration en hémoglobine.

En France, pour ces deux méthodes, le dernier contrôle national de qualité fait état de CV compris entre 2 et 5 % (selon les appareils) pour un Hte de 30 % et entre 2,6 et 5,5 % pour un Hte de 20 %.

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II. MATERIEL ET METHODES

(29)

1. CADRE D’ETUDE

Les travaux se sont déroulés dans le laboratoire d’analyses biomédicales du centre de santé de la commune d’Akpro-Missérété. Située dans le département de l’Ouémé, la Commune d’Akpro-Missérété couvre une superficie de 79 Km². Elle est limitée au Sud par les Communes de Porto-Novo et des Aguégués ; au Nord par les Communes d’Adjohoun et de Sakété ; à l’Est par la Commune d’Avrankou et à l’Ouest par la Commune de Dangbo.

2. MATERIEL

2.1. Matériel biologique

Il est constitué d’échantillons de sang veineux prélevé dans les tubes EDTA.

Sans distinction d’âge ni de sexe.

Photo 1 : Prélèvement dans tube EDTA

2.2. Appareils

Les appareils utilisés sont :

- L’automate d’hématologie Sysmex KX-21N - Une centrifugeuse à hématocrite (NUVE NF 048)

- Une centrifugeuse à rotor oblique (EBA 21 HETTICH ZENTRIFUGEN)

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- L’automate d’hématologie ( Sysmex KX-21)

- Une centrifugeuse à hématocrite (NUVE NF 048)

- Une centrifugeuse à rotor oblique (EBA 21 HETTICH ZENTRIFUGEN)

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2.3. Méthodes de travail

2.3.1. Type d'étude

Il s’agit d’une étude prospective, descriptive a visé analytique qui a porté sur trois techniques de détermination de l’hématocrite : la technique de référence (centrifugation à 12000 tr/min pendant 5min) ; la détermination à l’automate et l’utilisation de la centrifugeuse à rotor oblique standard.

2.3.2. Echantillonnage

Les échantillons collectés proviennent des sujets reçus au laboratoire du centre de santé d’Akpro-Missérété et du Centre Hospitalier Universitaire Départemental de l’Ouémé -Plateau de Mai à Juillet 2017. L’échantillonnage a été réalisé par une méthode non probabiliste. Aucune distinction d’âge ni de sexe n’a été prise en compte.

2.3.3. Collecte des données

Sur chaque échantillon, le TxHb et Hte ont été d’abord déterminés à l’automate.

Ensuite Hte a été déterminé sur le même échantillon dans les conditions suivantes :

- 12000tr/min pendant 5min (méthode de référence) - 1000tr/min pendant 5min (méthode expérimentale 1) - 3000tr/min pendant 5min (méthode expérimentale 2) - 5000tr/min pendant 5min (méthode expérimentale 3) - 5000tr/min pendant 10min (méthode expérimentale 4) - 5000tr/min pendant 20min (méthode expérimentale 5)

Dans chaque cas deux tubes à hématocrite ont été utilisés et la valeur de l’hématocrite a été la moyenne de valeur des deux tubes.

(32)

2.4. Analyses statistiques

Pour les données quantitatives les moyennes et les écart-types ont été déterminés. Les fréquences ont été calculées au niveau des données qualitatives.

Pour évaluer la corrélation entre les différentes méthodes de détermination de l’hématocrite nous avons utilisé le test de corrélation de Pearson. La normalité de la population a été préalablement vérifiée par les tests de Kolmogorov- Smirnov et Shapiro-Wilk. Les moyennes ont été comparées par le test t.

L’objectif poursuivi par l’utilisation de ce test est de comparer les résultats obtenus par la méthode de référence aux résultats obtenus par les techniques expérimentales. Puisque les moyennes proviennent des mêmes patients, elles sont appelées moyennes dépendantes.

(33)

III. RESULTATS ET DISCUSSION

(34)

1. RESULTATS

1.1. Caractéristique de l’échantillon

L’étude a porté sur 500 sujets. Le taux d’hémoglobine varie de 2,2g/dl à 17,7g/dl. La moyenne globale est de 9,56g/dl avec un écart-type de 3,52. On note les tranches caractéristiques du taux d’hémoglobine. Les sujets n’ayant pas d’anémie représentent 1/3 des cas, ceux ayant une anémie légère ou modérée 1/3 et ceux ayant une anémie sévère 1/3 (tableau I).

Tableau I : Répartition de l’échantillon en fonction du taux d’hémoglobine

Tranche d’hémoglobine Fréquence Pourcentage Moyenne Ecart-type

Hbinf 7g/dl 156 31,2 5,2803 1,22433

Hb [7 à 10[ 94 18,8 8,5702 ,81542

Hb [10 à 12[ 94 18,8 11,0894 ,60312

Hb sup 12 156 31,2 13,5179 1,29149

Total 500 100,0 9,5610 3,52478

1.2. Etude de la corrélation entre les différentes méthodes de détermination de l’hématocrite

Le tableau II montre l’existence d’une corrélation entre l’hématocrite déterminé par la méthode de référence et les différentes techniques de la méthode expérimentale. Les corrélations les plus forte ont été enregistrées avec les centrifugations à 5000tr pendant 10min (R²= 0,970)et 20 min ( R²= 0,973).

Les box plots représentants les valeurs obtenues par chaque méthode montrent aussi que les boites des techniques de centrifugations 5000tr/min pendant

(35)

10min et 20min sont superposables à celui de la méthode de référence. On note que la médiane ainsi que le 1^er et le 3^è quantiles sont situés au même niveau.

Tableau II : Corrélations des échantillons appariés

N Corrélation Sig.

Paire 1 Hématocrite automate &

12000tr_5mn 434 ,895 ,000

Paire 2 1000tr_5mn & 12000tr_5mn 500 ,670 ,000

Paire 3 3000tr_5mn & 12000tr_5mn 500 ,838 ,000

Paire 4 5000tr_5mn & 12000tr_5mn 500 ,950 ,000

Paire 5 5000tr_10mn & 12000tr_5mn

500 ,970 ,000

Paire 6 5000tr_20mn & 12000tr_5mn

500 ,973 ,000

(36)

Figure 5: Représentation en box plot des valeurs d’hématocrite suivant les méthodes

(37)

1.3. Comparaison entre les valeurs d’hématocrites obtenues par les différentes méthodes

Les moyennes de l’hématocrite varient suivant la méthode (tableau III). La méthode automatique a donné la valeur la plus basse 29,40%. On remarque d’une part l’influence de la vitesse de centrifugation sur l’Hte (figure 6). D’autre part, le temps de centrifugation agit aussi sur Hte (figure 7). En observant les résultats (tableau III, figure 6 et 7), on aboutit à la conclusion que c’est la méthode 5000tr/min pendant 20min qui donne une moyenne et un écart-type très proche de la méthode automatique et de la méthode de référence.

Le test t de comparaison des moyennes montre qu’il n’existe aucune différence statistique (p = 0,225)entre la valeur moyenne de Hte de la méthode 5000tr/min pendant 20min et la méthode de référence (tableau IV).

Tableau III : Statistiques des échantillons appariés

Méthodes Moyenne de Hte

(%) N Ecart type Moyenne erreur

standard

1000tr - 5mn 56,94 500 20,056 ,897

3000tr - 5mn 38,59 500 15,426 ,690

5000tr - 5mn 31,90 500 11,738 ,525

12000tr - 5mn (référence)

29,61 500 10,956 ,490

5000tr - 10mn 30,50 500 10,934 ,489

5000tr - 20mn 29,47 500 10,881 ,487

Hématocrite automate

29,40 434 10,56886 ,50732

(38)

Figure 6: Influence de la vitesse de centrifugation sur l’hématocrite

Figure 7:Influence du temps de centrifugation sur l’hématocrite

0 10 20 30 40 50 60

1000tr 3000tr 5000tr Référence Automate

Moyenne d'hématocrite (%)

Vitesse de centrifugation

28 28,5 29 29,5 30 30,5 31 31,5 32 32,5

5mn 10mn 20mn Référence Automate

Moyenne hématocrite (%)

Temps de centrifugation

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Tableau IV : Résultat du Test des échantillons appariés

Moyenne Ecart type

Moyenne erreur standard

t P value

Hte automate -

12000tr - 5mn -1,42627 4,87349 0,23393 -6,097 0,000 1000tr - 5mn -

12000tr - 5mn 27,330 15,097 0,675 40,479 0,000

3000tr - 5mn -

12000tr - 5mn 8,976 8,649 0,387 23,205 0,000

5000tr - 5mn -

12000tr - 5mn 2,290 3,658 0,164 13,999 0,000

5000tr - 10mn -

12000tr - 5mn ,886 2,679 0,120 7,396 0,000

5000tr - 20mn -

12000tr - 5mn -,138 2,540 0,114 -1,215 0,225

(40)

2 DISCUSSION

L'hématocrite est un paramètre hématologique important. Il est utilisé soit directement pour confirmer une anémie, soit en complémentarité avec le nombre des hématies et le taux d’hémoglobine pour en déduire la constante érythrocytaires nécessaires dans le typage de l’anémie. Si l’automatisation est un rêve de tous les laboratoires, il faut tenir compte de l’appareillage de base existant dans la détermination. Cette étude basée sur l’utilisation de la centrifugeuse à rotor oblique standard a permis la mise au point d’une méthode alternative de détermination de l’hématocrite : la centrifugation à 5000 tr/min pendant 20min.

Comme nous l'avions remarqué, la méthode de référence est le microhématocrite (NCCLS) [2]. Les arguments en sa faveur sont : fiabilité, obtention directe de valeurs " vraies ", peu de problèmes liés à l'incorporation des globules blancs dans le volume globulaire " rouge ", au piégeage de plasma, aux conséquences d'une déshydratation cellulaire, faible volume de sang nécessaire (environ 50 mµL). Mais nous devons reconnaître que la méthode alternative présente quelques limites:

- cette méthode demande trop de temps pour être utilisée en routine. La probabilité pour qu’elle provoque un incident au laboratoire des urgences est forte ;

- elle constitue un risque potentiel de transmission de maladies infectieuses (accidents de centrifugation, contamination par le sang sortant du capillaire, risque de bris de capillaire).

En outre elle tend à surestimer, à l’instar de la méthode de référence la valeur d'Hte à cause du petit film de plasma entourant chaque hématie et à être faussée si ces méthodes sont très déformées. Enfin elle n'est pas exempte de problèmes préanalytiques (hémoconcentration liée à un garrot trop serré, dilution par du liquide interstitiel en méthode capillaire, formation de caillots...).

(41)

La lecture du niveau exact de séparation est parfois délicate en raison de la couche de leucocytes et de plaquettes. Les erreurs de parallaxe ne sont pas rares.

Les performances demandées sont rarement atteintes. Notons enfin que la valeur d'Hte ainsi déterminée varie significativement en fonction de l'osmolalité sanguine [20].

La méthode utilisant un compte-globules (principe Coulter ou laser) ne présente pas d'inconvénients techniques mais nécessite le partage du spécimen (deux entrées) et surtout la disponibilité d'un tel appareil au laboratoire. Là encore, des

" embouteillages " peuvent s'observer sur la paillasse. Pour Stott et al. [20] elle est techniquement exempte de toute critique car elle mesure un hématocrite "

isotonique " (très forte dilution) et reste insensible aux variations d'osmolalité ou de concentrations en protéines.

L’utilisation de l’automate d’hématologie pourla détermination de l'Hte est évidemment a priori la solution la plus élégante. La durée de mesure est rapide pour l'ensemble des paramètres de l’hémogramme, et les risques de contamination sont très faibles. En revanche, l'automate a un coût élevé, ce qui le rend non accessible aux petits laboratoires.

(42)

CONCLUSION

Cette étude a eu pour but la mise au point d’une méthode alternative de détermination de l’hématocrite. La centrifugation à 12000tr/min pendant 5min a été considérée comme méthode de référence. Les différentes techniques testées (1000tr/min pendant 5min ; 3000tr/min pendant 5min ; 5000tr/min pendant 5min ; 5000tr/min pendant 10min et 5000tr/min pendant 20min) ont révélé une variation de la valeur de l’hématocrite suivant la vitesse de centrifugation et suivant le temps de centrifugation. Une forte corrélation (R² ≥ 0,95) a été observée entre la méthode de référence et les techniques de centrifugation à 5000tr/min pendant 10min et pendant 20min. Mais seule la centrifugation à 5000tr/min pendant 20min a donné des résultats statistiquement égaux à la méthode de référence.

La centrifugation à 5000tr/min pendant 20min peut donc être utilisée comme méthode alternative dans la détermination de l’hématocrite.

(43)

REFERENCES BIBLLIOGRAPHIQUES

1 - JF Mollard. Hématocrite : les techniques de mesure et leurs limites dans le cadre de la gazométrie sanguine Volume 61, numéro 2, Mars - Avril 2003

2-NCCLS. Procedure for determining packed cell volume by the microhematocrit method - second edition; Approved Standard. NCCLS 1993 Document H7-A2. Vol. 13 n° 9. Villanova PA. 19085 États-Unis.

3 - NCCLS. Quantities and units: SI; Committee Report. NCCLS 1983 Document C11-CR. Villanova PA. 19085 États-Unis.

4 -Savage RA. Inconsistent relationship between hemoglobin and hematocrit.

Lab Med 1987 ; 18/12 : 868

5 - BlacqueBelair A, Mathieu de Fossey B, Fourestier M. Dictionnaire des constantes biologiques et physiques. 5e ed. Paris :Maloine 1980 : 568 p.

6 - Tietz NW. Textbook of clinical chemistry. Philadelphia: W.B. Saunders Co 1986 : 1829 p.

7 - National center for health statistics (NCHS). Hematological and nutritional biochemistry reference data of persons 6 months-74 years of age: united States, 1976-1980. Vital and health statistics, Series 11. Washington, DC, U.S.

Department of Health and Human Resources, PHS, NCHS, 1982.

8 - van Assendelft OW. Interpretation of the quantitative blood cell count. In:

Koepke JA, ed. Practical laboratory hematology. New York, Churchill : Livingstone : 1991 : 61-98.

9 - McCarthy EF, van Slijke DD. Diurnal variations of hemoglobin in the blood of normal men. J BiolChem1939 ; 120 : 567-72.

10 - Mole RH. Diurnal and sampling variations in the determination of haemoglobin. J Physiol (London) 1945 ; 104 : 1-5.

11 - Stengle JM, Schade AL. Diurnal-nocturnal variations of certain blood constituents in normal human subjects. Br J Haematol1957 ; 3 : 117-24.

12 - Eisenberg S. The effect of posture and position of the venous sampling site on the hematocrit and serum protein concentration. J Lab Clin Med 1963 ; 61 : 755-60.

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13 - Tombridge TL. Effect of posture on hematology results. Am J ClinPathol 1968; 49 : 491-3.

14 - Ricos C, Alvarez V, Cava F, et al. Current databases on biological variation: pros, cons and progress. Scand J Clin LabInvest 1999 ; 59 : 491-500.

15 - Duhamel G. L'hématocrite. Concours Med 1970 ; 10 : 7391-4.

16 - Comroe JH, Forster RE, Dubois AB, Briscoe WA, Carlsen E. The Lung.

Clinical physiology and pulmonary function tests. 2nd ed. Chicago: Year Book Medical Pub. Inc. 1962.

17 - Ewing GW. Instrumental Methods of Chemical Analysis. 3rd Ed. 1969.

Chap. 2 and 3. Mc Graw-Hill.

18 - Coulter W. High Speed Automatic Blood Cell Counter and Cell Size Analyzer. 1956.

19 - Lee LW. Elementary principles of laboratory instruments. 3rd. Ed. 1974.

Chap. 9 : 157-158. C.V. Mosby Comp.

20 - Stott R, Hortin GL, et al. Analytical artifacts in hematocrit measurements by whole-blood chemistry analyzers. ClinChem1995 ; 41 : 306-11.

(45)

Table des matières

Dédicace ... 5

Remerciements ... 6

Hommages ... 8

LISTE DES SIGLES ET ABREVIATIONS ... 9

LISTE DES TABLEAUX ET FIGURES ... 10

RESUME ... 11

ABSTRACT ... 12

INTRODUCTION ... 14

I. SYNTHESE DE LITTERATURE ... 16

1. DEFINITION ET HISTORIQUE ... 17

2. DIFFERENTES SORTES D’HEMATOCRITES ... 18

2.1. Hématocrite veineux ... 18

2.2. Hématocrite Corrigée ... 18

2.3. Hématocrite Somatique ... 18

2.4. Hématocrite réel ... 18

3. VALEURS NORMALES ... 20

4. VARIATIONS ... 20

5. METHODES DE MESURE ... 22

5.1. Méthode manuelle ... 22

5.2. Méthodes automatiques ... 23

5.2.1. Le principe Coulter ... 25

5.2.2. Le laser ... 26

II. MATERIEL ET METHODES ... 28

1. CADRE D’ETUDE ... 30

2. MATERIEL ... 30

2.1. Matériel biologique ... 30

2.2. Appareils ... 30

(46)

2.3. Méthodes de travail ... 31

2.3.1. Type d'étude ... 31

2.3.2. Echantillonnage ... 31

2.3.3. Collecte des données ... 31

2.4. Analyses statistiques... 32

III. RESULTATS ET DISCUSSION ... 33

1. RESULTAT ... 34

1.1. Caractéristique de l’échantillon ... 34

1.2. Etude de la corrélation entre les différentes méthodes de détermination de l’hématocrite ... 34

1.3. Comparaison entre les valeurs d’hématocrites obtenues par les différentes méthodes ... 37

2. DISCUSSION ... 40

CONCLUSION ... 42

REFERENCES BIBLLIOGRAPHIQUES ... 43