PÔLE SCIENTIFIQUE « MICROBIOLOGIE »

PÔLE SCIENTIFIQUE « MICROBIOLOGIE »

I – INTRODUCTION

Le pôle scientifique « Microbiologie » avec deux ingénieurs permanents, un ingénieur contractuel et un technicien de recherche, voit son activité régulièrement progresser.

Ces deux dernières années, plus d'une soixantaine de demandes d''interventions ponctuelles d’urgence, suite à des contaminations microbiologiques accidentelles, ont été traitées. D'autres demandes entrant soit dans de la cadre d'études préalables à la restauration (pour exemple le cas des peintures murales de Montireau), soit concernant des chantiers de restauration en cours comme celui des Salles-Lavauguyon ont également été traitées.

Les demandes émanant des archives nationales ou départementales ainsi que des musées sont également en hausse.

Enfin, le pôle continue à être mobilisé par la gestion du problème de contamination fongique qui touche la grotte de Lascaux depuis septembre 2001.

Les problèmes de développement de basidiomycètes sur le bois qui nécessitent expertise et établissement de protocole de traitement sont également une de nos spécificités de plus en plus sollicitée.

Notre activité de recherche accorde une attention particulière à la mise au point de nouvelles méthodes de traitement biocides (programme APACH sur la mise au point de nouvelles méthodes de traitement fongicide à base d'hydroxydes

Sallertaines (Vendée - 85), église Saint-Martin, développement de lichens orangés sur la toiture en ardoise

doubles lamellaires, utilisation des propriétés biocides de la lumière artificielle pour l'éradication des microorganismes chlorophylliens). En outre, nous développons l'aspect préventif de la conservation en travaillant sur les moyens d'anticipation des contaminations (mise au point d'un « nez » électronique pour capter les COVm).

Deux autres projets se sont également poursuivis : un projet ANR, « Plasmapal », concernant le développement d'un procédé de traitement de surfaces de bois par jets de plasma froid et un programme du Cercle des partenaires du patrimoine sur les mécanismes de colonisation des matériaux de couverture, soutenu financièrement par la société Lafarge.

Enfin, les enseignements, stages de formation et encadrement de stagiaires continuent d’être assurés.

2 – RECHERCHES

Sous contrats ou subventions

Détection de la contamination fongique des œuvres d’art par la voie des composés organiques volatils d’origine microbienne

Stéphane MOULARAT (Laboratoire de microbiologie des environnements intérieurs, Centre scientifique et technique du bâtiment, Champs sur Marne - 77)

Faisl BOUSTA - Geneviève ORIAL (LRMH) – Durée : 2005-2010

Les champignons sont des biocontaminants courants des environnements intérieurs et de nombreuses études ont démontré leur rôle dans la dégradation des matériaux qu’ils colonisent (bois, textile, papier, pigment, vernis…) jusqu’à la destruction totale des substrats.

À l’heure actuelle, les différents services de conservation du patrimoine mènent des actions correctives destinées à restaurer les matériaux altérés, mais il n’existe pas de procédure d’alerte permettant de stopper la contamination avant que des dégâts importants ne soient constatés. L’absence de techniques efficaces permettant de détecter et d’identifier précisément la présence d’un champignon dès le début de son développement explique cette situation. De plus, les techniques utilisées pour détecter une contamination fongique dans une ambiance s'appuient sur la culture des particules biologiques en suspension dans l'air et de ce fait ne permettent pas de détecter une contamination cachée (lorsqu’une moisissure se développe derrière une tapisserie, dans une charpente, ou derrière un tableau par exemple).

Dès le début de leur développement les champignons émettent des molécules volatiles (Composés Organiques Volatils d’origine microbienne – COVm) issues soit de leur métabolisme, soit de la dégradation du matériau par les enzymes ou les acides qu’ils produisent. Contrairement aux spores, ces composés se dispersent dans l’environnent sans être retenus par les supports. Par conséquent la détection de certains de ces composés spécifiques d’une ou plusieurs espèces fongiques permettrait, d’une part, l’identification d’une contamination dès le début du développement et, d’autre part, de détecter des contaminations « cachées » pour lesquelles les spores ne sont pas émises dans l’environnement.

Dans ce contexte, le LRMH et le CSTB développent une méthodologie adaptée à la surveillance des œuvres d’art vis-à-vis des risques liés au développement de moisissures notamment en mesurant des indicateurs chimiques spécifiques de la croissance fongique. Au cours de l’année 2008-2009, 5 indices spécifiques de contaminations fongiques ont été développés à partir de COV (Composés Organiques Volatils) cibles, identifiés en laboratoire durant les premières phases de l’étude.

Un système de capteurs, basé sur la détection des traceurs retenus a été développé et testé sur quatre sites patrimoniaux (château de Fontainebleau, château d’Escorpain, musée du Louvre et musée des Arts décoratifs). Au cours de ces expérimentations, le type de capteur a également pu être précisé : celui à base d'oxydes métalliques, utilisé au château d’Escorpain, n'a pas fourni la réponse satisfaisante et adaptée à la mesure. Le choix s'est donc orienté vers un capteur de type polymères pour le développement du futur système.

Les indices préalablement développés ont alors été appliqués aux prélèvements obtenus ainsi qu'à ceux réalisés précédemment au château de Champs-sur-Marne et dans la grotte de Lascaux.

Toutes ces mesures ont permis à la fois l’ajustement des indices développés et leur validation in situ. Notamment, la disposition spatiale des collecteurs a pu être caractérisée ainsi que les temps de prélèvement afin d’améliorer l’échantillonnage. La dispersion des COV a également été mise en évidence. Parallèlement, des mesures biomoléculaires ont été réalisées. Elles ont permis, outre la caractérisation de la qualité microbiologique de l’air des ces sites, la comparaison entre les valeurs des indices calculés et la diversité biologique de l’air. La concordance entre ces deux mesures renforce la validation des indices.

Capteurs mis en place au château d'Escorpain

Étude de l’impact et optimisation de la lumière artificielle sur le système photosynthétique des microorganismes chlorophylliens

Badr ALAOUI-SOSSE (Laboratoire de biologie environnementale, université de Franche-Comté, Besançon - 25) Faisl BOUSTA - Geneviève ORIAL (LRMH) – Durée : 2007-2010

L’utilisation dans les milieux obscurs à forte humidité ambiante (grottes, cryptes et tumulus...) de systèmes d'éclairage destinés à offrir une meilleure lisibilité des œuvres aux visiteurs, entraîne le développement de microorganismes chlorophylliens (algues, lichens, mousses...). Jusqu’à présent, le moyen privilégié de lutte contre cette « maladie verte » a consisté en l’utilisation d’algicides. Ces produits utilisés dans le cadre de traitements curatifs ou préventifs sont essentiellement des alkyles d’ammonium quaternaire. Ils sont commercialisés sous forme liquide, véhiculés dans l’eau ou dans un solvant organique. L’expérience montre que ces produits, bien que de la même famille chimique, ne donnent pas des résultats identiques en terme d’efficacité, suivant les situations de contamination rencontrées. La rémanence dans le temps de ces produits est mal maîtrisée. Enfin, la lixiviation des biocides par l’eau d’infiltration et les risques de contamination des nappes phréatiques représentent un problème non négligeable pour l’environnement.

Le but de ce travail, commencé en septembre 2007, est la recherche d’une solution efficace, pouvant représenter une alternative à l’utilisation de ces produits chimiques.

En tant qu’organismes photosynthétiques, les algues, les lichens et les mousses utilisent les rayonnements du spectre visible pour procéder à la photosynthèse. Pour ce qui concerne plus particulièrement les algues dont l’étude a été privilégiée ici, ces rayonnements n’ont pas tous la même efficacité. Selon le type d’organisme considéré et selon les pigments qu’il contient, les différentes longueurs d’ondes seront plus ou moins efficaces pour stimuler ou non le processus photosynthétique. Nous avons donc testé l’effet de divers types et mode d’irradiation sur la prolifération et la survie de colonies algaires provenant de plusieurs sites. L’efficacité de ces différentes irradiations a été déterminée en fonction des effets sur certains paramètres physiologiques déterminants du métabolisme des microalgues.

Deux types d’éclairage à visée biocide ont été expérimentés.

• Le premier éclairage, en lumière visible jaune ou verte, a donné des résultats décevants. La photosynthèse des algues, quoique légèrement atténuée, n’a pas été suffisamment réduite pour conduire à une mortalité cellulaire ni même à une diminution de la prolifération des algues. Ce type d’irradiation a donc été abandonné.

• Le deuxième éclairage, de type UV, a donné des résultats bien plus encourageants. La photosynthèse des

souches testées a été significativement affectée dès 20 minutes d’irradiation. Cet effet s’accentue lorsqu’on augmente la durée du traitement et, après 180 minutes d’irradiation aux UV, la photosynthèse disparaît complètement au profit d’un très fort phénomène de photo respiration qui traduit une très forte souffrance cellulaire. Ces observations sont corroborées par la diminution de la teneur en chlorophylles et par le fort taux de mortalité cellulaire mesuré chez les cultures traitées aux UV pendant des durées variables. L’appareil photosynthétique est donc détruit de manière irréversible par le traitement et le stress. Le but recherché est donc atteint.

Par suite, ces lumières ont été appliquées, en laboratoire, sur des matériaux contaminés par des algues vertes et les résultats obtenus ont été très satisfaisants.

Dès lors, il nous a semblé important de finaliser l'expérimentation par un essai sur site. C'est dans la grotte des Combarelles (commune des Eyzies-de-Tayac, Dordogne) que le système d'éclairage UV a été installé. Après une nuit d’exposition, les algues présentes sur la zone de test choisie ont presque complètement disparu. L'état de surface a été contrôlé régulièrement pendant les semaines qui ont suivi le traitement. Il s'avère que pendant trois mois les colonies algaires ne sont pas réapparues, ce que l'on peut considérer comme la rémanence de ce type de traitement.

L’utilisation dans les milieux souterrains d’un éclairage biocide fonctionnant en alternance avec l’éclairage habituel du site, c'est-à-dire lors de la fermeture de celui-ci, pourrait donc être envisagée comme un moyen de substitution, efficace et sans danger pour l’environnement, à l’utilisation des produits chimiques algicides.

Verre en pyrex contaminé par des algues vertes et exposé à une lumière UV

Partie témoin Partie exposée

Grotte des Combarelles, zone de test avant exposition aux

UV Grotte des Combarelles, zone de test après une nuit

d'exposition aux UV Culture témoin non exposée et

culture exposée 180 minutes aux rayonnements UV puis mis au repos (ER180)

Hors contrats ou subventions

Projet ANR : PLASMAPAL (Plasmas Appliqués aux Surfaces des Matériaux et des PALettes) Agence nationale de la recherche

BEYNEL-MANUSTOCK - FP BOIS - ACXYS TECHNOLOGIES - ARNAUD SA - PROJECTION PLASMA SYSTEME FCBA (Forêt cellulose bois construction ameublement) - LEGP (Laboratoire d'électronique des gaz et des plasmas) - USBB (Unité sciences du bois et biopolymères) - Laplace

Geneviève ORIAL - Emmanuel MAURIN - Faisl BOUSTA (LRMH) - Charlotte LECLAIRE (CPP) - Durée : 2006-2009

Ce projet a pour objectif la réalisation d’un pilote et le développement d'un procédé de traitement de surfaces de bois par jets de plasma froid (mélange de gaz ionisés) à pression atmosphérique.

L’exemple des palettes, outils de manutention, de stockage et de distribution, est typique du matériau soumis au développement du champignon du bleuissement et de moisissures. Pour limiter ces développements, la stérilisation par plasma froid semble présenter de nombreux avantages. En effet, cette technologie, en plus d’être un procédé de traitement non polluant par voie sèche, permet un traitement de surface à température ambiante, préservant ainsi les propriétés intrinsèques des matériaux. Dans le cadre de ce projet, le LRMH est chargé d’évaluer l’efficacité du traitement par jet de plasma selon deux axes : d’une part, apprécier l’action curative du traitement sur bois contaminé et, d’autre part, évaluer l’action préventive sur bois sain dans la perspective d’augmenter sa durée de préservation.

La première étape de ce programme a consisté en l’identification des souches fongiques responsables des contaminations des palettes. Les prélèvements effectués sur ces supports colonisés ont permis l'isolement des souches responsables des dégâts. Il s'agit de moisissures communes : Pénicillium sp., Trichoderma sp., Gliocladium sp. ainsi qu'un champignon du bleuissement Aureobasidium sp.

Il fallait dans un premier temps évaluer le caractère fongicide de la post décharge sur ces microorganismes. Afin de comprendre l’action du plasma sur les moisissures, les premiers essais ont d'abord été effectués sur des filtres de nitrocellulose colonisés, afin de s'affranchir d'une éventuelle interaction du matériau bois avec le plasma.

Les paramètres les plus performants de la technique ont été précisés grâce à une analyse paramétrique concernant le type de réacteur plasma, le temps de traitement, le débit, la puissance et les différents mélanges gazeux (mélanges N₂/O₂,).

La viabilité des cellules, avant et après traitement, a été appréciée par le biais des techniques classiques de remise en culture sur milieu gélosé et d'observations en microscopie à fluorescence. Les résultats obtenus montrent une meilleure efficacité de traitement avec le réacteur de type pulsé, avec un mélange gazeux N₂/O₂ de 90/10 et 99,9/0,1 et pour des puissances et débits testés les plus élevés. Ainsi, dans ces conditions optimales, une exposition du filtre contaminé à la post décharge pendant 7 à 9 minutes permet d’obtenir des taux d’inhibition de croissance supérieurs à 95 %.

Exposition d’éprouvettes de pin maritime à une post décharge d’azote

Exposition de filtres de nitrocellulose à une post décharge d’azote

Dans un deuxième temps et pour répondre à la problématique initiale, des essais ont été réalisés sur des échantillons de bois contaminés et les paramètres plasma optimisés y ont été appliqués. Il s'avère qu'après une heure de traitement aucune diminution de l’activité biologique n'est mise en évidence. Les raisons de ces résultats négatifs sont probablement liées à la nature même du matériau traité, les spores de moisissures ayant un accrochage plus en profondeur dans les cellules du bois et donc moins accessibles au plasma que sur le substrat cellulosique.

La deuxième partie du programme vise à étudier l’action préventive sur bois sain. Le but de cette étude est de greffer des molécules biocides sur les cellules du bois en injectant le produit directement au sein de la post décharge. La campagne d’essais, réalisée avec l’équipement de la société Acxys, n'a pas permis de mettre en évidence un quelconque greffage de la molécule sur le bois. Néanmoins, des tests complémentaires réalisés au LEGP ouvrent la voie à des perspectives intéressantes dans ce domaine.

Enfin, ce programme a fait l’objet de différentes communications, à l’exemple de la présentation d’un poster aux Journées techniques internationales de l’ICOMOS, à Metz en Mai 2008, ainsi qu’à la conférence internationale du COST Action IE0601 « Wood Science for Conservation of Cultural Heritage », à Braga au Portugal en novembre 2008. Par ailleurs, l’ensemble des résultats obtenus est valorisé dans la thèse de Mlle Élodie LECOQ, du LEGP, qui va être soutenue à Pau au mois de décembre 2009.

APACH (APport A la Conservation des grottes ornées des Hydroxydes doubles lamellaires)

Programme national de recherche sur la connaissance et la conservation des matériaux du patrimoine culturel

Voir la présentation de ce programme et les résultats dans le pôle scientifique « Grottes ornées », page 46.

Étude de l’implantation des colonisations biologiques sur les matériaux de couverture des monuments en fonction des propriétés de surface des matériaux

Société LAFARGE

Geneviève ORIAL - Jean-Didier MERTZ (LRMH) - Charlotte LECLAIRE - David GIOVANNACCI (CPP) Durée : 2007-2010

Les recouvrements biologiques (verdissements) sont fréquemment observés sur les monuments et les matériaux de couverture. Le phénomène prééminant dans la colonisation des tuiles est la faculté de rétention d’eau du substrat, celle- ci étant directement liée aux propriétés surfaciques du matériau.

Cette étude a pour objectif, en premier lieu, d’identifier les propriétés de surface prépondérantes au développement des microorganismes, de tuiles de différentes natures (terre cuite, béton classique de diverses formulations, béton haute performance) puis de déterminer les valeurs-seuils de ces caractéristiques pour limiter les recouvrements biologiques.

Une première étape de caractérisation des matériaux de couverture a été effectuée. Des mesures de porosimétrie et des courbes d’évaporation ont été réalisées et permettent de classer les différents substrats de tuiles en fonction de leur réserve potentielle en eau, prépondérante pour la croissance des algues.

Une seconde étape, en cours, devrait permettre d’évaluer cette réserve potentielle.

Par ailleurs, plusieurs séries de tuiles ont été disposées dans un banc de ruissellement pour obtenir une colonisation accélérée. Les éprouvettes y sont exposées dans des conditions optimales de croissance des algues (humidité 100 %, ruissellement d’un bouillon d’algues 3 h/jour, luminosité 12 h/24 h …). La cinétique de colonisation est évaluée en pourcentage de surface colonisée, après traitement informatique des images numérisées de tuiles. Ce traitement est effectué à l’aide d’un programme développé spécifiquement pour cette étude. La figure ci-après montre le résultat des étapes du traitement d’images : scanner brut de la tuile puis calcul de la surface colonisée après traitement par le logiciel Matlab^Ò.

Les premiers résultats mettent en évidence une cinétique de colonisation inégale en fonction des revêtements présents sur les tuiles : les tuiles en terre cuite et les tuiles béton sans revêtement de surface sont les plus rapidement colonisées.

En outre, l’utilisation de verres frittés et de tuile de même nature mais possédant un état de carbonatation différent ont permis, d’une part, de mettre en évidence le rôle prépondérant de la distribution porale et de la rugosité dans la colonisation par les algues et, d’autre part, d’identifier l’impact du pH sur cette même colonisation. L’impact réel de la rugosité sera prochainement déterminé par la mise en place de verre frittés à iso porosité et iso rugosité dans le banc de ruissellement.

En parallèle, les tuiles sont disposées sous différentes conditions d’hygrométrie contrôlées afin de corréler les cinétiques de colonisation avec les propriétés surfaciques des matériaux. Enfin, une exposition in situ, sous couvert végétal, devrait confirmer les résultats obtenus.

Grotte de Lascaux : recherche de la corrélation entre le développement des microorganismes et les paramètres physiques de l’atmosphère et des substrats (1^ère tranche)

Projet soutenu par la Direction régionale des affaires culturelles d'Aquitaine Claude ALABOUVETTE, coordinateur (INRA Dijon) - Adriana BERNARDI (CNR-ISAC Padoue)

Geneviève ORIAL - Faisl BOUSTA - Alexandre FRANÇOIS - Jean-Didier MERTZ - Mikaël GUIAVARC'H (LRMH) – David GIOVANNACCI (CPP) – Durée : 2006-2009

La compréhension et la maîtrise du phénomène de contamination microbiologique que connaît la grotte de Lascaux depuis plusieurs années nécessitent une connaissance approfondie de la diversité de la microflore présente ainsi que des conditions micro-climatiques qui prévalent à la surface des matériaux sur lesquels se développent les colonies.

La compréhension du degré de dépendance du développement des microorganismes vis-à-vis des conditions micro- climatiques et de substrat implique des investigations selon trois axes de recherche :

• la caractérisation des communautés microbiennes (fongique, bactérienne, algale) de la grotte,

• la caractérisation des conditions de température et d’activité de l’eau à la surface des matériaux,

• la caractérisation dynamique des paramètres du microclimat.

Le pôle scientifique « Microbiologie » s'est chargé de la caractérisation des communautés microbiennes de la cavité, par le biais des techniques pasteuriennes qui permettent de mettre en évidence les microorganismes cultivables.

Banc de ruissellement pour colonisation accélérée

Évaluation de la surface colonisée sur une tuile en béton haute performance : scanner brut et traitement sous Matlab

Les zones retenues, respectivement nommées PR1, PR2 et PR3, ont été choisies d'un accord commun par l’ensemble des partenaires. Elles sont situées à l'entrée du diverticule de droite et ont des topographies à peu près planes ou facilement accessibles. PR1 est une zone sèche, pouvant être considérée « de référence », PR2 une zone contaminée à humidité variable et PR3 une zone humide à contamination récurrente et périodiquement nettoyée.

Les premiers échantillons à analyser ont été collectés en février 2007, au démarrage du projet, ce qui correspond à la campagne T0. Il était initialement prévu de déclencher d'autres campagnes de prélèvements en fonction de l'alerte donnée par l'équipe de restaurateurs sur la régression et/ou l’apparition de contaminations visibles sur les zones choisies. Aucune modification de surface n'ayant été signalée, il n'y a pas eu d'autres prélèvements.

Toutefois afin de clôturer la première phase du projet, un deuxième et dernier échantillonnage a été effectué en juin 2009, sur les zones PR2 et PR3, (la zone PR1 étant inexploitable en terme de quantité de matière disponible) ce qui correspond a la campagne T+28 mois.

La détermination du spectre microbien à T0 permet de conclure que les sédiments constituant les zones PR1,2 et 3 présentent une flore tellurique faible à normale située entre 10⁴ et 10⁸ UFC/gramme de matière. Le cortège bactérien est peu diversifié. Les espèces rencontrées sont telluriques, communes dans tous les sols. Pour ce qui concerne les spores de moisissures, elles sont présentes dans des quantités moyennes entre 10⁴ et 10⁶ UFC par gramme pour PR3 et PR4.

Elles sont absentes dans PR1. Seules trois espèces ont été identifiées : Fusarium sp., Pénicillium sp., et Gliomastix sp.

Les analyses de la campagne à T+28 mois montrent que les bactéries hétérotrophes de la microflore totale se situent autour de 10⁸ UFC/gramme de matière. Le cortège bactérien reste très peu diversifié. Toutefois, les bactéries contribuant à la formation de nitrates (ferments nitriques) sont en quantité importante (entre 10⁵ et 10⁶ germes).

Pour faciliter la comparaison et essayer d'élaborer une première interprétation, les résultats des analyses des deux campagnes To et T+28 mois ont été regroupés par zone. Les histogrammes ci-après donnent l'exemple de la zone PR2.

Si, en 28 mois, le nombre de bactéries hétérotrophes a légèrement augmenté (passant de 10⁷ à 10⁸) de manière équivalente pour les deux zones, la diversité des espèces isolées demeure très faible avec même une diminution pour PR2, passant de 4 espèces bactériennes en 2007 à 2 en 2009. Toutefois, ces légères différences ne sont pas significatives d'une réelle modification de la flore hétérotrophe. Les moisissures sont stables en terme de numération. En revanche, les espèces isolées sont plus variées en 2009, avec une similitude dans la variation pour chacune des zones. Il est à noter qu'aucune espèce nouvelle n'a été identifiée et que toutes les moisissures présentes en PR2 et PR3 ont déjà été rencontrées, lors d'analyses précédentes, en d'autres localisations et sur d'autres substrats. Pour les germes entrant dans les cycles spécifiques, aucune évolution caractéristique n'est mise en évidence, sauf pour les bactéries nitriques qui progressent fortement dans les deux zones, passant du nombre de 10 à 10⁶ pour PR2 et à 10⁴ pour PR3, ce qui traduit un incontestable changement.

Comparaison des résultats de la microflore hétérotrophe pour PR2, à T0 (2007) et à T+28 mois (2009)

Zone PR2

1,0E+00 1,0E+02 1,0E+04 1,0E+06 1,0E+08 1,0E+10

GN MG DOX Algues Extait de

terre Bunt et

Rovira Milieux de culture

UFC/g de terre

2007 2009

Comparaison des résultats de la microflore des groupes fonctionnels pour PR3, à T0 (2007) et à T+28 mois (2009)

Zone PR2

1,0E+00 1,0E+02 1,0E+04 1,0E+06 1,0E+08 1,0E+10

Oxydant Fe Oxydation Mn

Mineralisation S Oxydation S

Denitrification Ammonification

Ferment nitriques Ferment nitreux

Nombre de germes/g de terre

2007 2009

Parallèlement, la détermination des taux de carbone et azote organiques dans les sédiments montre que la zone PR1 présente un taux de carbone supérieur aux zones PR2 et PR3 et des quantités similaires et très faibles pour le taux d'azote, dans les trois cas. La différence au niveau du carbone se retrouve dans le rapport C/N : les zones PR2 et 3 ont un rapport équivalent, la zone PR1 possède un rapport plus élevé mais qui reste bas et n'atteint pas 18. On peut en conclure que ces teneurs minimes sont le signe d'un sol pauvre. À T+28 mois, les résultats indiquent un taux d'azote organique légèrement plus bas en PR2 qu'en PR3 et une image inversée pour le carbone qui est en quantité un peu plus faible pour PR3. Les rapports C/N restent très bas.

L'examen des données permet de conclure qu'entre 2007 et 2009 le taux de carbone organique baisse légèrement dans les deux zones. Les teneurs en azote restent très faibles dans les deux localisations et pour les deux campagnes et sont même similaires pour PR3. Le rapport C/N reste identique en 2007 et 2009 pour PR2, il est légèrement plus bas pour PR3 en 2009. Toutefois ces variations ne sont pas significatives et les différents rapports obtenus permettent de considérer que le sol de la cavité est aride et ne s'enrichit pas dans le temps.

Les résultats des analyses microbiologiques des deux campagnes de prélèvements ne montrent pas d'évolution caractérisée du biotope, ni en nombre ni en espèces. Les teneurs en azote et carbone organiques ainsi que les rapports C/N ne varient pas non plus de manière notoire et révèlent les propriétés du sol de la cavité qui peut être considéré comme pauvre voire très pauvre. Cette constatation amène à une corrélation avec l'état de surface qui, d'après les informations fournies par l'équipe de restaurateurs en place, n'a pas évolué : aucune apparition de nouvelles colonies fongiques visibles ou régression de celles préexistantes au début du projet n'ayant été signalée. Seule une catégorie de microorganismes, les bactéries participant spécifiquement à l'oxydation des composés azotés en nitrates, ont vu leur nombre augmenter significativement en 2009, dans les deux zones. Malheureusement, il est difficile dans l'état actuel de nos connaissances (concernant deux seuls prélèvements espacés de 28 mois) de fournir une explication à ce phénomène. S'agit-il d'une modification du cycle de l'azote ou simplement d'un retour à un état initial ? La question reste posée.

Sélection de nouveaux produits biocides pour le traitement de pierres colonisées par les algues. Étude de leur efficacité et de leur innocuité

Geneviève ORIAL - Faisl BOUSTA - Alexandre FRANÇOIS (LRMH) – 2005-2009

Cette étude, commencée en septembre 2005, avait pour objectif initial de compléter une première sélection de biocides déjà réalisée par le LRMH, il y a plusieurs années.

Dans un premier temps, nous avons sélectionné une gamme de nouveaux biocides disponibles sur le marché et nous avons testé leur efficacité en laboratoire sur quatre souches d’algues responsables des recouvrements verts sur les monuments. Quatre produits, donnant les meilleurs résultats, ont été retenus : Biotin N à 2 %, Dévor’mousse à 3,3 %, New Dess à 30 %, Parmetol DF12 à 5 %.

Trois types de pierre ont alors été choisis en fonction de leur propriété intrinsèques (porosité, densité, etc.) différentes. Il s’agit des pierres de Tuffeau, Saint-Maximin (toutes deux de porosité élevée, de l'ordre de 40 %, mais de porométrie différente) et de Comblanchien (de porosité < 2 %). 42 éprouvettes ont été taillées par type de pierre. L’application des produits biocides a été faite par badigeonnage, au pinceau. Puis un mélange des quatre espèces d’algues a été préparé pour l’ensemencement des pierres. Les éprouvettes de pierre ont été mises sur des portoirs et exposées en extérieur, sous couvert végétal.

Les données climatiques locales sont quotidiennement recueillies et les éprouvettes régulièrement examinées. Ces observations, ainsi que des relevés photographiques ont été régulièrement effectués au cours de ces quatre années. Le suivi régulier de l’état de surface des échantillons devrait permettre d'évaluer l’efficacité des différents produits, leur devenir dans le temps et leur innocuité sur la pierre. Après deux ans d’exposition, les éprouvettes de Comblanchien (calcaire marbrier) ne présentent aucune colonisation visible.

En revanche, les recouvrements biologiques se sont progressivement développés sur pratiquement toutes les pierres de Tuffeau et Saint-Maximin, à partir de janvier 2007 (soit près d’un an ½ après le début de l’exposition). Aujourd'hui, les colonisations se sont bien installées sur les éprouvettes de Tuffeau et Saint-Maximin, avec quelques évolutions vers d'autres organismes comme des lichens ou des mousses. Les éprouvettes de Comblanchien sont toujours exemptes de développement biologique. Les clichés ci-dessous, relatifs au Tuffeau, illustrent ces évolutions.

Dans le cas particulier du Tuffeau, on constate une nette transformation de la colonisation entre 2007 et 2008 ainsi que l'apparition de lichens en 2009.

Un premier bilan peut d'ores et déjà être tiré des observations visuelles :

• dès trois ans après l'application des produits biocides, les surfaces de pierre ne présentaient plus aucune différence entre une éprouvette traitée, quel que soit le produit, et le témoin non traité. Tous les algicides ont donc perdu leur efficacité. La rémanence de ces produits, dans des conditions favorables de colonisation, est donc inférieure à trois ans ;

• les recouvrements algaires évoluent systématiquement, dans le temps, vers des organismes plus structurés comme les mousses et les lichens ;

• la porosité de la pierre a une influence majeure sur le développement et la cinétique de colonisation : le Comblanchien, matériau très peu poreux, n'est toujours pas colonisé, quatre ans après une exposition sous couvert végétal.

Ces conclusions seront étayées par la mise en corrélation de toutes les données collectées.

DÉCAGRAPH : DÉtection précoce de Contaminants biologiques et chimiques Appliquée au patrimoine GRAPHique

Programme national de recherche sur la connaissance et la conservation des matériaux du patrimoine culturel

Thi-Phuong NGUYEN (Bibliothèque nationale de France) - Anne LAMA (Archives nationales) - Stéphane MOULARA (Centre scientifique et technique du bâtiment)

Faisl BOUSTA - Geneviève ORIAL (LRMH) – Durée : 2009-2011

Une étude a été réalisée conjointement entre le LRMH et le Centre scientifique et technique du bâtiment (CSTB) en vue d'appliquer aux monuments historiques une recherche basée sur l'identification précoce des contaminants biologiques

État de surface des éprouvettes de Tuffeau

en 2006 État de surface des éprouvettes de

Tuffeau en 2007

État de surface des éprouvettes de Tuffeau en 2008

État de surface des éprouvettes de Tuffeau en 2009

État de surface des éprouvettes de Tuffeau en 2005

soient apparents et ne dégradent collections et monuments. Bibliothèques et archives souhaitent adapter cette méthode au patrimoine graphique. Basée sur l’analyse des Composés Organiques Volatils (COV), elle donnerait également des renseignements précieux sur la nature des polluants émis par les collections graphiques qui peuvent également, comme c’est le cas pour les papiers acides, contribuer à polluer l’air intérieur et altérer les collections saines et les matériaux du bâtiment.

Les résultats obtenus, à l’issue de ce projet, devraient aider à l’optimisation d’un appareil de surveillance, en cours de développement au CSTB en collaboration avec le LRMH, capable de détecter en continu l’ensemble des polluants qui contribuent à l'altération du patrimoine écrit et d’alerter en cas de début de contamination. Ce projet débutera en fin d’année 2009.

Régulation de l'humidité relative d'une vitrine par système d'électrolyse : étude pilote réalisée dans l'église de Saint-Vrain (Essonne) pour la vitrine de la « Châsse de Saint-Capray »

Dominique de REYER - Faisl BOUSTA (LRMH) Voir le pôle scientifique « Textile », page 105.

3 – ÉTUDES

Deux exemples d'études sont développés ci-après.

PARIS (75) - Musée du Louvre, salle des États, salle Percier et Fontaine, Pyramide

Détection des composés organiques volatils d'origines microbiennes (COVm) et de la pollution chimique (rapport N° 1247A)

Stéphane MOULARAT, Yael JOBLIN (Centre scientifique et technique du bâtiment) Faisl BOUSTA - Geneviève ORIAL (LRMH)

Le LRMH et le CSTB développent une méthodologie adaptée à la surveillance des œuvres d’art vis-à-vis des risques liés au développement de moisissures, notamment en mesurant des indicateurs chimiques spécifiques de la croissance fongique.

Les essais au musée du Louvre s’inscrivent dans ce projet et ont pour objectif de mettre au point et tester une stratégie d’échantillonnage de COVm dans de grands volumes avec un bruit de fond généré par des visiteurs. Les indices déterminés dans l'étude préalablement réalisée seront ensuite appliqués aux prélèvements afin d’obtenir une première validation in situ.

L’ensemble des prélèvements a été effectué au Louvre dans trois salles fréquentées par le public :

• la salle des États (salle 1), choisie pour ses grandes dimensions (environ 35 x 15 x 12 m). Les dimensions de cette salle permettront notamment d’évaluer l’homogénéité des COV à l’intérieur d’une salle et ainsi d’optimiser la stratégie d’échantillonnage ;

• la salle Percier et Fontaine (salle 2), dans laquelle le personnel se plaint de sensations d’oppression. L’ensemble des COV sera analysé dans cette salle afin de vérifier la présence d’une éventuelle contamination chimique. Lors de la mesure, la température et l’humidité relative de cette salle ont été relevées (25 °C et 46 % HR) ;

• la salle adjacente à la salle Percier et Fontaine (salle 3), dans laquelle le personnel ne ressent aucune sensation désagréable. Cette salle est équipée d’un système de climatisation ; lors de la mesure, la température et l’humidité relative de cette salle ont été relevées (24 °C et 54 % HR).

Aucune des salles sélectionnées ne présente de soupçon de contamination fongique (pas de traces de moisissures visibles, pas d’odeur de moisi, pas de dégât des eaux ni d’infiltration). Les environnements testés pourront donc être considérés comme des environnements non moisis pour la suite de l’étude.

Les prélèvements réalisés sont des prélèvements actifs de Composés Organiques Volatils (COV) au travers d'une cartouche remplie d’adsorbant TENAX. Le débit d’échantillonnage est de 100 mL/min durant 30 ou 60 mn selon le point de prélèvement.

À partir de ces collectes, deux types de traitement ont été appliqués :

• une analyse globale permettant de comparer les COV obtenus à chaque point de prélèvement ;

• l’application de 5 indices de contamination fongique permettant de statuer sur la présence où l’absence d’un développement fongique dans la salle investiguée. L’indice Gén correspond à une détection dans les environnements intérieurs, les indice Mus 1 et Mus 2 sont spécifiques des musées, l’indice Bas spécifique d’une contamination par des basidiomycètes et l’indice Cav spécifique d’environnements intérieurs naturels (cavités).

Chaque indice a été calculé à partir de tous les prélèvements réalisés dans les trois salles.

Pour l’ensemble des indices, une valeur strictement positive indique la présence d’un développement fongique dans la salle investiguée, alors qu’une valeur négative, ou nulle, l’exclut. Les résultats sont présentés dans le tableau ci-après.

Salle Position Hauteur du prélèvement (m)

Durée du prélèvement (min)

Valeur de l’indice

Gén* Mus 1* Mus 2* Bas* Cav*

Salle 1 A 1 30 -3 -6 -1 -3 -4

Salle 1 A 2,5 30 -4 -6 -1 -3 -4

Salle 1 B 1 30 -3 -6 -1 -3 -4

Salle 1 C 1 30 -4 -6 -1 -3 -4

Salle 1 C 1 60 -4 -6 -1 -3 -4

Salle 2 1,3 30 -4 -6 -1 -3 -4

Salle 3 0,3 30 -4 -6 -1 -3 -4

Calculs d’indice de contamination fongique Ces premiers tests permettent de confirmer l’homogénéité des COV à l’intérieur d’une salle, modérant ainsi l’importance du point de prélèvement. Cependant, le prélèvement peut être optimisé lorsqu’il est réalisé au centre de la pièce, à une hauteur fixée entre 1 et 2 m. Dans les conditions testées, la durée du prélèvement ne doit pas excéder 1 heure afin d’éviter une augmentation du bruit de fond.

L’homogénéité des COV a également été vérifiée entre les deux salles adjacentes ; par conséquent, la zone couverte par les indices est susceptible de dépasser la limite d’une salle.

Enfin, les calculs d'indices de contamination montrent qu’aucune des salles ne présente de développement actif de moisissures. Ces résultats concordent avec les observations in situ : aucune des salles sélectionnées ne présente de soupçon de contamination fongique (pas de traces de moisissures visibles, pas d’odeur de moisi, pas de dégât des eaux ni d’infiltration).

DIJON (21, Côte-d'Or ) Bastion de Guise (XVI^e siècle) Essai de traitement par biominéralisation (rapport n°1248A) Geneviève ORIAL (LRMH)

Le bastion de Guise, propriété de la ville de Dijon, est un des derniers vestiges des remparts. Il est construit en pierre calcaire de Dijon et présente un faciès d’altération typique de la gélifraction. Le matériau se dégrade horizontalement, se fissure puis se détache en petits blocs de quelques centimètres. Le niveau d’altération est hétérogène : le processus est actif pour certaines pierres alors que pour d’autres il semble stabilisé avec, parfois, la formation d’une minéralisation

Aspect du capteur mis en place dans la salle des États

La restauration du rempart étant devenu nécessaire, la technique de la biominéralisation c'est à dire la création artificielle d'un épiderme naturel et protecteur de calcite en surface du matériau, par le biais de bactéries carbonatogènes, a été envisagée et a fait l’objet d’un essai préalable. Mais la préparation des parements s'est avérée indispensable pour une mise en œuvre correcte du traitement : élimination des végétaux, purge des blocs desquamés.

Compte tenu du faciès d’altération et de la présence de nombreuses micro et macro fissurations, deux types de mise en œuvre ont été envisagés : le badigeon et la protection de surface renforcée. L'essai a été réalisé sur une travée d’une vingtaine de mètres de longueur sur la dizaine de mètres de hauteur.

Un protocole de suivi scientifique a été établi pour vérifier l’installation du biocalcin à la surface de la pierre. Il consiste principalement en des observations macroscopiques, microscopiques et ultramicroscopiques (microscopie électronique à balayage). Ces examens ont été complétés par des mesures d’absorption capillaire pour juger des améliorations des propriétés de surface du matériau. Enfin ces contrôles ont été associés à un relevé photographique des zones avant et après traitement .

Sur le plan du traitement de biominéralisation proprement dit, on peut dire que l’essai est positif : le biocalcin s’est bien installé, recouvrant la surface de la pierre d’une fine couche carbonatée quoique parfois discontinue. L’absorption d’eau est également en diminution. La pierre est bien protégée par cette couche de biocalcin.

Néanmoins, compte tenu du faciès d’altération et dans la mesure où la purge préconisée n’a pas pu être réalisée, le biocalcin s’est installé sur chaque petit fragment, individuellement ou sur des plages plus importantes ne comportant pas de fissurations.

Dans cette situation d’altération, il est impossible que la biominéralisation entraîne la formation d’un épiderme continu et comble des fissures parfois pluricentimétriques.

De même, la pose de mortiers biologiques sur ce matériau dans l’état ne paraît pas envisageable.

Il est clair que, sans purge de l’ensemble du mur, cette méthode de traitement de la pierre ne peut pas atteindre les objectifs souhaités, c'est-à-dire une restauration pérenne du rempart, sans chute ultérieure de pierre.

À la suite des conclusions de cette étude, la décision a été prise de procéder à la purge du mur et le traitement par biominéralisation a pu être étendu à l'ensemble du bastion.

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Aspect de la pierre après traitement par biominéralisation