0-
15ng - Gal4 RCXMyT1
60ng - Gal4 RCXMyT1
15ng - Gal4 RDSIP1
60ng - Gal4 RDSIP1
Légende
Activitéluciférase relative
50 ng CtBP-VP16
Gal4 Gal4
N-term Gal4
RCXMyt1
Gal4 C-term
Activitéluciférase relative
0 ng CtBP-VP16 45 ng mMyt
Légende
50 ng CtBP-VP16
Gal4 Gal4
N-term Gal4
RCXMyt1
Gal4 C-term
Activitéluciférase relative
0 ng CtBP-VP16 45 ng mMyt
Légende
200 - 100 -
191
100
163
199
18 15 10
190
XCtBP
XMyT1 XCtBP
CeMyt1 XCtBP
rMyt1-L XCtBP
rMyt3 XMyT1 XCtBP pPC86
pPC97 PIE8
WB MYC
Myt1 1ZF-STOP Myt1 RC
A
B
C
D
Figure 24 : CtBP interagit avec Myt1.
(A) Révélation par coloration -gal de l'interaction entre la région centrale de XMyT1 (construction appât utilisée pour l'expérience du double hybride "RCXMyT1") et la protéine XCtBP identifiée par double hybride en levure. Cette activité
-gal mesurée est révélatrice d'une interaction entre les deux protéines étudiées et non le résultat d'une activation exercée par les protéines RCXMyT1 et XCtBP indépendamment l'une de l'autre. Cette expérience révèle également une interaction interspécifique entre d'une part XCtBP (xénope) et d'autre part XMyT1 (xénope), rMyt1-L, rMyt3 (rat), CeMyt1 (nématode). PIE8 est un activateur de la transcription et a servi de contrôle positif. XCtBP interagit de manière équivalente avec les trois membres Myt1-L, Myt1 et Myt3. XCtBP interagit deux fois moins avec la protéine CeMyt1 du nématode. Celui-ci contient un seul motif "PLDLT" non présent chez les vertébrés. (B) Les interactions entre la région centrale de XMyT1 (Myt1 RC) et une forme tronquée de XMyT1 constituée du 1er doigt à zinc jusqu'à l'extrémité C- terminale (Myt1 1ZF-STOP) avec CtBP1 et CtBP2 de souris sont confirmées par co-immunoprécipitation. Les protéines Myt1 RC et Myt1 1ZF-STOP sont marquées par l’épitope Myc et les protéines CtBP1 et CtBP2 sont marquées par l'épitope Flag. Ces protéines sont exprimées dans des cellules 293T après avoir été transfectées. Un signal plus fort est détecté lorsque l'on transfecte les cellules avec les constructions codant pour Myt1 RC et CtBP1/CtBP2 par rapport à celles transfectées par Myt1 1ZF-STOP et CtBP1. Un faible bruit de fond causé par la liaison entre Myt1 RC et les billes de sépharose a été détecté. SIP1 sert de contrôle positif à cette expérience. Cette dernière protéine contient un domaine de recrutement de CtBP. Les Western Blot, WB Flag et WB Myc, effectués à partir du lysat confirment respectivement la présence de CtBP1/CtBP2 et Myt1 RC/Myt1 1ZF-Stop bien que ce dernier soit faiblement exprimé. (C) Expérience du double hybride en cellules de mammifère (cellules MCF7) confirmant une interaction entre la région centrale de XMyT1 fusionnée à Gal4DBD et CtBP fusionnée à l'activateur transcriptionnel VP16. L'interaction entre CtBP et le domaine de recrutement de CtBP par SIP1 (RDSIP1) sert de contrôle positif. Cette expérience révèle une interaction entre la région centrale de XMyT1 (RCXMyT1) et CtBP. Une augmentation de l'activité luciférase est également observée lorsqu'on passe de 15ng RCXMyt à 60ng. (D) Expérience du double hybride en cellules de mammifère (cellules MCF7) étudiant l’éventuelle interaction entre différents mutants de XMyT1 (mMyt1) fusionnés à Gal4DBD et CtBP-VP16 de souris. 45 ng de mMyt1 et 50 ng de CtBP ont été utilisés. Cette expérience révèle une interaction entre la RCMyt1 et CtBP. Par contre les parties N-terminale (N-term) et C-terminale (C-term) de XMyT1 n’interagissent pas avec CtBP. De plus, cette expérience révèle que les trois fragments de la protéine XMyT1 se comportent comme répresseur lorsque l’on compare leur activité luciférase par rapport au seuil d’activité généré par Gal4 seul (en jaune). (E) Expérience de co- immunoprécipitation réalisée par surexpression, en embryons de xénope, de différents mutants de XMyT1 marqués avec l’épitope Myc à savoir la protéine complète XMyT1, la région centrale (RCXMyT1), la première moitié de RCXMyT1 (5'RCXMyT1), la deuxième moitié de RCXMyT1 (3'RCXMyT1) et XCtBP marqué avec l'épitope Flag. Un contrôle négatif a été réalisé en surexprimant XHRT1 marqué avec l'épitope Myc. Les embryons non injectés (NI) servent à montrer qu'aucunes protéines d'intérêts marquées par les épitopes Myc et Flag ne sont produites. En effet, contrairement aux embryons injectés, aucun signal n'est détecté par Western blot ce qui signifie qu'aucune protéine n'est exprimée. L’IP Flag/WB anti-Myc révèle une interaction entre XCtBP/XMyT1 (cf. a) et XCtBP/RCXMyT1 (cf. b) ce qui n’est pas le cas pour XCtBP/5'RCXMyT1 et XCtBP/3'RCXMyT1. Les western blot (WB anti-flag et WB anti-Myc) confirment la présence de toutes nos protéines utilisées pour cette co-immunoprécipitation.
Luc XCtBP / VP16
UAS
N-term RC C-term
H- L-
1 2 3 4 5 6
IP Flag / WB anti-Myc
XCtBP
NI WB anti-Flag
X M yT 1
5’
R C X M y T 1
3’
R C X M y T 1
R C X M y T 1
X H R T 1
N I
