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-30 -20 -10 10 20
MO-XEvi1 MO-XMyT1 XMyT1 1M 2M 3M XMyT1 XEvi1
Figure 18 : Expérience de perte de fonction par la technique d'oligos antisens de type Morpholinos (MO) se liant au site d'initiation de traduction de l'ARNm XMyT1 (MO- XMyT1).
(A) Représentation schématique de la liaison des deux oligos Morpholinos (MO1-XMyT1) et (MO2-XMyT1) aux ARNm XMyT1 de Xenopus laevis. Le codon initiateur de la traduction est en rouge. (B) Test in vitro de la spécificité et de l'efficacité des MO-XMyT1. L'efficacité et la spécificité des oligos morpholinos peuvent se vérifier par une manipulation de synthèse de protéines in vitro (TNT). (1) Expression de la protéine XMyT1. (2,3,4) Inhibition de l'expression de XMyT1 lorsque différentes concentrations de MO-XMyT1, dirigés contre le site d'initiation de traduction, sont ajoutés au mélange réactionnel. Les points 1 à 4 montrent que MO-XMyT1 sont efficaces. (5) Les MO dirigés contre le site initiateur de traduction de la protéine XEvi1 (MO-XEvi1) n'ont aucun effet sur l'expression de XMyT1. (6) Les MO-XMyT1 n'ont aucun effet sur l'expression de XEvi1. Les points 5 et 6 montrent que les MO-XMyT1 sont spécifiques.
Cette manipulation révèle une activité efficace et spécifique des MO-XMyT1 choisis pour l'expérience de perte de fonction en embryons de xénope. (C) Expérience de perte de fonction de XMyT1 et analyse par hybridation in situ de l'expression du marqueur XIA1 (décrit dans la littérature en tant que marqueur pancréatique) et du marqueur neuronal N-Tub. La partie antérieure des embryons est orientée à gauche de la photo. La partie injectée (mélange de MO1- XMyT1/MO2-XMyT1 à 5ng chacun et 50pg d'ARNm codant pour la -galactosidase) est située vers le haut. Les MO-XMyT1 n'ont aucun effet sur l'expression des marqueurs XIA1 (a) dans 93% des cas (n = 42/45) et N-Tub (b) dans 95% des cas (n = 35/37).
A
B
C
MO1 –
XMyT1 MO2 –
XMyT1
1 2 3 4 5 6
N-Tub MO-XMyT1
-130kDa
XIA1
a b
