III.1 Le gène XMyT1 III. Résultats

III. Résultats

III.1 Le gène XMyT1

III.1.1 Caractérisation de la famille des gènes NZF/Myt

Les publications rapportent d'une part la présence d'un seul gène Myt1 chez la drosophile (Drosophila melanogaster), le nématode (Caenorhabditis elegans), le poisson-zèbre (Danio rerio) et le xénope (Xenopus laevis) et d'autre part la présence de trois gènes chez le poulet (Gallus gallus), la souris (Mus musculus), le rat (Rattus norvegicus), et l'humain (Homo sapiens). Ces trois gènes sont Myt1-L, Myt1 et Myt3.

Afin de déterminer à quel gène XMyT1 est apparenté, nous avons entrepris de répertorier et d'analyser tous les gènes de la famille Neural Zinc Finger/Myelin Transcription Factor (NZF/Myt). Pour cela, nous avons d'une part recherché dans la littérature les différents gènes Myt identifiés chez les différentes espèces. D'autre part nous avons effectué une recherche informatique en utilisant le programme "blast"

disponible sur les sites web "National Centre for Biotechnology Infirmation "NCBI"

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov), Ensembl Genome Browser (http://www.ensembl.org/)

et Eukaryotic Genomics "JGI" (http://genome.jgi-psf.org). Pour cette dernière, nous

avons introduit la séquence peptique de XMyT1 comme référence afin d'identifier les

ADNc codant pour des protéines similaires chez d'autres espèces. Nous avons

identifié par des recherches informatiques la présence de trois gènes Myt chez le

xénope (Xenopus tropicalis) et chez le poulet. Nous avons décidé de les nommer

respectivement XtMyt1-L, XtMyt1, XtMyt3 et cMyt1-L, cMyt1, cMyt3. Nous avons

également identifié deux gènes Myt chez le poisson-zèbre que nous avons nommés

ZMyt1-L et ZMyt1. Enfin, nous avons identifié un seul gène Myt1 chez le nématode

(Caenorhabditis briggsae) et chez l'ascidie commune (Ciona intestinalis) que l'on a

nommé respectivement CbMyt1 et CiMyt1. Concernant Ciona intestinalis, bien qu'il

s'agisse d'une espèce faisant partie de l'embranchement des chordés, elle n'est pas

reprise dans le groupe des vertébrés. Cette espèce se situe donc à la jonction entre les

vertébrés et les invertébrés. L'ensemble des protéines Myt répertoriées a été analysé et comparé à l'aide du programme informatique Vector NTI afin de générer un arbre phylogénétique (cf. Fig.17). D'une part, ce programme a classé les protéines Myt des vertébrés (comprenant les deux espèces de xénope, le poisson-zèbre, le poulet, la souris, le rat et l'humain) en trois catégories à savoir les protéines Myt1-L, Myt1 et Myt3. D'autre part, ce programme a classé les protéines Myt des invertébrés (comprenant la drosophile et les deux espèces de nématode) dans une seule catégorie séparée des vertébrés. La protéine Myt1 de Ciona intestinalis a été classée parmi les protéines des vertébrés mais dans aucune des trois catégories formées par Myt1-L, Myt1 et Myt3. Afin d'avoir un aperçu général sur les différents gènes de la famille NZF/Myt, nous avons créé un tableau récapitulatif comprenant tous les membres Myt identifiés dans la littérature et par criblage informatique (cf. tableau 1).

Vertébrés Myt1-L

Xen.t. Danio r. Gallus g. Mus m. Rattus n. Homo s.

Synonymes NZF1, Png1

Chromosomes ND 20 3 12 6 2

Protéines (aa) 959 1150 1140 1182 1211 1131

Exons 22 20 23 27 21 26

Myt1

Xen.t. Danio r. Gallus g. Mus m. Rattus n. Homo s.

Synonyme NZF2

Chromosomes ND 23 20 2 3 20

Protéines (aa) 1116 1210 1081 1127 1125 1121

Exons 20 ND 23 23 21 23

Myt3

Synonymes NZF3, St18

Chromosomes ND 2 1 5 8

Protéines (aa) 977 1020 1045 1017 1047

Exons ND 18 24 18 26

Invertébrés Myt1

C.elegans C.briggsae Droso.mel. Ciona int.

Synonymes /

Chromosomes I ND X ND

Protéines (aa) 539 524 942 771

Exons 8 10 10 ND

Tableau 1 : Caractérisation des gènes Myt chez les vertébrés et les invertébrés.

Les données, reprenant la localisation chromosomique, le nombre d'acides aminés et le nombre d'exons, proviennent du site web Ensembl Genome Browser. On observe chez tous les vertébrés que les trois gènes sont localisés sur des chromosomes différents et qu'ils sont constitués d'un grand nombre d'exons. Légende : (ND) Non déterminé, (aa) acides aminés.

XMyT1 présente le plus de similitude avec les protéines Myt1 par rapport aux

protéines Myt1-L et Myt3 issues des différentes espèces étudiées (cf. tableau 2). En

effet, l'analyse informatique ayant permis de réaliser l'arbre phylogénétique montre

que la protéine XMyT1 présente 41% à 46% de similitude avec les protéines Myt1-L,

72% à 85% de similitude avec les protéines Myt1 à l'exception de ZMyt1 chez le

poisson-zèbre où l'on observe 59,5% de similitude et finalement 45% à 53% de

similitude avec les protéines Myt3. Aussi, on observe que le facteur XMyT1 présente

de 12% à 19% de similitude avec les protéines Myt1 d'invertébrés et 22% de

similitude avec celle identifiée chez l'ascidie commune. Aussi, cette analyse indique

que l'amphibien comporte comme les autres vertébrés trois gènes Myt.

Vertébrés Myt1-L Xen.t.

XtMyt1-L

Danio r.

ZMyt1-L

Gallus g.

cMyt1-L

Mus m.

mMyt1-L

Rattus n.

rMyt1-L

Homo s.

hMyt1-L Xen.laevis

XMyT1 41,3% 45,6% 42,3% 41,4% 42,1% 43,4%

Myt1 Xen.t.

XtMyt1

Danio r.

ZMyt1

Gallus g.

cMyt1

Mus m.

mMyt1

Rattus n.

rMyt1

Homo s.

hMyt1 Xen.laevis

XMyT1 84,7% 59,5% 77,8% 72,9% 71,9% 73,6%

Myt3 Xen.t.

XtMyt3

Gallus g.

cMyt3

Mus m.

mMyt3

Rattus n.

rMyt3

Homo s.

hMyt3 Xen.laevis

XMyT1 44,8% 50,7% 51,4% 50,4% 52,5%

Invertébrés Myt1 C.elegans

CeMyt1

C.briggsae CbMyt1

Droso.mel.

dMyt1

Ciona int.

CiMyt1 Xen.laevis

XMyT1 13,9% 12,3% 19,2% 21,9%

Tableau 2 : Analyse des séquences protéiques de tous les membres de la famille Myt/NZF et comparaison de ces séquences avec celle de XMyT1.

La protéine XMyT1 présente le plus de similitude avec les protéines Myt1 par

rapport aux protéines Myt1-L et Myt3 issues des différents vertébrés. Par contre,

XMyt1 présente le moins de similitude avec les protéines des invertébrés. Cette

analyse a été réalisée avec le logiciel Vector NTI.

Grâce aux recherches informatiques "blast", la découverte des trois gènes Myt chez Xenopus tropicalis, nous a permis d'entreprendre l'étude de leur profil d'expression par hybridation in situ. Afin de vérifier si l'expérience a été menée correctement, nous avons réalisé en parallèle le profil d'expression de N-Tub sur les embryons de Xenopus laevis ce qui a servi donc de contrôle positif.

Malheureusement, aucun signal détectable n'a pu être observé sur les embryons de Xenopus tropicalis. Nous avons réalisé cette même expérience, en utilisant à nouveau les sondes XtMyt1-L, XtMyt1 et XtMyt3 de Xenopus tropicalis, sur des embryons de Xenopus laevis mais sans succès. Par conséquent, nous n'avons pu réaliser une étude comparative des profils d'expression des trois gènes Myt chez l'amphibien. En effet, à ce jour, seul le profil d'expression de XMyT1 a pu être observé au niveau des neurones primaires au cours de l'embryogenèse précoce.

III.1.2 Etude de la fonction de XMyT1

III.1.2.1 Expérience de perte de fonction chez le xénope – Technique des oligos de type Morpholino

L'étude du rôle de XMyT1 s'est réalisée dans un premier temps par une

expérience de perte de fonction en utilisant la technique des oligos antisens de type

morpholino. Cette expérience a pour but de bloquer la traduction de XMyT1. En

effet, les oligos morpholinos sont spécifiques de la séquence de l'ARNm de XMyT1

et s'hybrident au niveau de l'ATG d'initiation de traduction. Cette expérience de perte

de fonction a été réalisée par micro-injection des oligos morpholinos dans le pôle

animal d'un blastomère d'embryon issu du stade 2-4 cellules. Deux oligos

morpholinos différents ont été choisis. L'efficacité de ces oligos morpholinos à

inhiber la traduction de XMyT1 a été testée par une expérience de transcription et de

traduction in vitro. La concentration finale du mélange des deux oligos morpholinos

injectés était de 1ng, 5ng et 10ng par cellule. A ce mélange, 50pg d'ARNm codant

pour la β-galactosidase a été ajouté afin d'identifier le côté injecté. L'activité de ceux-

ci sur la neurogenèse a été analysée par hybridation in situ réalisée sur des embryons arrêtés au stade neurula tardif (stade 16). Nous avons utilisé le marqueur pancréatique XIA1 et le marqueur neuronal N-Tub. Les raisons de l'intérêt porté au facteur de transcription XIA1 sont développées au point III.1.2.2.2.Cette expérience de perte de fonction n'a pas permis d'apporter plus d'information sur l'activité de XMyT1 dans la différenciation neuronale. En effet, en comparant la partie injectée à celle non-injectée, aucune modification de l'expression des marqueurs XIA1 et N- Tub n'a été détectée dans respectivement 93% des cas (n = 42/45) et 95% des cas (n

= 35/37; cf. Fig.18).

III.1.2.2 Identification de cibles de XMyT1

Afin de mieux comprendre le rôle de XMyT1, nous avons entrepris d'identifier les gènes qu'il est susceptible de réguler. D'une part, nous avons testé la capacité de XMyT1 à activer l'expression de différents marqueurs neuronaux dans des expériences de gain de fonction en embryons de xénope. D'autre part, nous avons réalisé un criblage informatique sur des banques de séquences promotrices disponibles sur les sites web DataBase of Transcriptional Start Sites "DBTSS"

(http://dbtss.hgc.jp) et The Eukaryotic Promoter Database "EPD"

(http://www.epd.isb-sib.ch) à l'aide du consensus AAAGTTT reconnu par la protéine orthologue chez la souris Myt1 (Kim and Hudson, 1992).

III.1.2.2.1 Identification des gènes correspondant à des cibles potentielles de XMyT1 par criblage informatique

Nous avons sélectionné les gènes potentiellement activés par XMyT1, c'est-à-

dire ceux qui contiennent le consensus dans leur promoteur et qui sont exprimés au

niveau du SNC aux stades précoces du développement embryonnaire. La banque de

séquences promotrices DBTSS est beaucoup plus complète que la banque EPD. En

effet, les séquences promotrices disponibles auprès de la banque DBTSS comprennent 5000pb situées en amont de l'ATG d'initiation de traduction tandis que les séquences disponibles auprès de la banque EPD comprennent 500pb situées en amont de l'ATG d'initiation de traduction. De plus, le criblage effectué avec la banque DBTSS permet de réaliser une recherche de consensus d'intérêt qui est conservé à la fois chez la souris et l'humain ce qui permet de réduire les candidats

"faux-positifs".

Le criblage informatique a permis de sélectionner quatre gènes dont leur promoteur contient, à la fois chez la souris et chez l'humain, le consensus reconnu par XMyT1. Ces gènes sont Neuroligin3 exprimé à partir du stade 25 (stade bourgeon caudal) et dont le consensus a été localisé dans la région en amont de l'ATG d'initiation de traduction située de -400pb à -100pb, fragilXmental exprimé aux stades maternel et 15 (stade neurula) et dont le consensus a été localisé dans la région au niveau de l'ATG d'initiation de traduction située de -100pb à +200pb, Axotrophin exprimé aux stades maternel, 10.5 (stade gastrula) et 15 et dont le consensus a été localisé dans la région en amont de l'ATG d'initiation de traduction située de -1000pb à -700pb et Postsynaptic protein (CRIPT) exprimé aux stades maternel et 10.5 et dont le consensus a été localisé dans la région en amont de l'ATG d'initiation de traduction située de -1000pb à -700pb. Les informations de ces quatre derniers gènes sont issues du site web Xenopus Database "XDB"

(http://xenopus.nibb.ac.jp). Nous nous sommes également intéressés au gène Nitric Oxyde synthase (NOS) car le laboratoire du Dr. Scheinker a identifié dans son promoteur des motifs similaires au consensus reconnu par Myt1 (données non publiées). De plus, le monoxyde d'azote (NO) pourrait réguler la transition des cellules neurales précurseurs entre la prolifération et la différenciation durant le développement du cerveau (Peunova et al., 2001). Aussi, il a été décrit comme répresseur de la neurogenèse chez les mammifères adultes (Packer et al., 2003).

XNOS est exprimé au niveau des cellules adjacentes à la zone des précurseurs neuronaux en division durant la neurogenèse à un stade plus tardif (le stade têtard).

L'ADNc de XPLP a également été commandé car le gène Proteolipid binding

Protein (PLP) a été décrit comme cible potentielle de Myt1 chez la souris (Kim and

Hudson, 1992) mais aucune donnée in vivo n'a été réalisée jusqu'à ce jour. L'ADNc

de ces six candidats a été commandé à partir des sites web XBD et I.M.A.G.E.

Consortium (http://image.llnl.gov). Ces six cibles potentielles ont été analysées par hybridation in situ sur des embryons de xénope allant du stade blastula au stade têtard afin d'observer leur profil d'expression. Pour cette expérience, nous avons utilisé la sonde N-Tub comme contrôle positif. Bien que l'expérience ait correctement fonctionné, aucune expression n'a été détectée pour ces six gènes ce qui n'a pas permis de poursuivre l'étude de leur régulation par XMyT1 via des expériences de gain et de perte de fonction effectuées sur embryons de xénope.

III.1.2.2.2 Identification de gènes correspondant à des cibles potentielles de XMyT1 par des expériences de gain de fonction

Pour ces expériences de gain de fonction, nous avons surexprimé XMyT1

seul et XMyT1 combiné à Xash3 en embryons de xénope. Nous avons co-injecté les

ARNm de XMyT1 combiné à XAsh3 car ils ont une action synergique sur l'induction

de la différenciation neuronale et ce de manière insensible à l'inhibition causée par la

voie de signalisation Delta/Notch (Bellefroid et al., 1996). Ceci est observé par

l'expression ectopique du marqueur neuronal N-Tub. Ces expériences de gain de

fonction permettent d'analyser par hybridation in situ l'activité de XMyT1 sur

l'expression de différents composants de la cascade neuronale. Nous avons étudié en

embryons de xénope, les effets de la surexpression de XMyT1 (dose de 250pg

d'ARNm, codant pour l'expression de XMyT1, injecté dans un blastomère aux stades

2-4 cellules) sur différents marqueurs et composants de la cascade de différenciation

neuronale. Leur expression a été analysée par hybridation in situ. Nous avons utilisé

deux marqueurs neuraux XSoxD et XSox3 (Penzel et al., 1997; Mizuseki et al., 1998)

et cinq marqueurs impliqués dans la différenciation neuronale tels que les facteurs

bHLH XNgnr1 et XAth3, le facteur HLH XCoe2/Xebf2, le facteur à doigts à zinc

XMTGR1 et enfin le marqueur neuronal N-Tub. Pour cette étude, nous avons

également utilisé la sonde XIA1 dont l'orthologue chez la souris IA1/INSM1 a été

décrit dans la littérature comme facteur de transcription à doigts à zinc induit par les

facteurs bHLH Ngn3 et NeuroD dont l'expression est localisée à la fois dans le SNC et le pancréas (Goto et al., 1992; Lan et al., 1993; Li et al., 1997; Xie et al.,2002;

Breslin et al., 2003; Mellitzer et al., 2006). Parallèlement, nous avons réalisé des expériences de surexpression de XMyT1 combiné à XAsh3. Nous avons injecté un mélange de 250pg de chaque ARNm, codant pour l'expression de XMyT1 et de XAsh3, dans un blastomère aux stades 2-4 cellules. Nous avons utilisé le marqueur XPak3 impliqué dans le cycle cellulaire durant la neurogenèse précoce et le marqueur neuronal elrC (Carruthers et al., 2003) qui n'a jamais été testé auparavant sur des embryons surexprimant XMyT1. Nous avons également utilisé le marqueur pancréatique XIA1 (celui-ci est décrit en tant que tel dans la littérature). Finalement, le marqueur N-Tub a été utilisé comme contrôle positif de cette expérience de gain de fonction. Cette étude a révélé que XMyT1 induit l'expression des gènes XIA1 dans 95% des cas (n = 55/58), XPak3 dans 52% (n = 12/23), elrC dans 89% des cas (n = 40/45) et N-Tub dans 71% des cas (n = 20/28) ce qui s'observe par un élargissement et une augmentation de la densité des bandes de neurones primaires. La surexpression de XMyT1 combiné à XAsh3 induit l'expression de ces quatre derniers marqueurs de manière ectopique à savoir dans 93% des cas (n = 37/40) pour XIA1, dans 71% des cas (n = 17/24) pour XPak3, dans 94% des cas (n = 34/36) pour elrC et dans 96% des cas (n = 27/28) pour N-Tub. La surexpression de XAsh3 seul montre une induction de leur expression assez similaire à celle exercée par XMyT1. En effet, XAsh3 induit l'expression de XIA1 dans 92% des cas (n = 56/61), XPak3 dans 68%

(n = 30/44), elrC dans 86% des cas (n = 37/42) et N-Tub dans 82% des cas (n = 31/38; cf. Fig.19). XMyT1 n'a montré aucun effet sur l'expression des facteurs impliqués dans la cascade neuronale tels que le facteur bHLH XAth3 dans 96% des cas (n = 25/26) et le facteur HLH XCoe2/Xebf2 dans 88% des cas (n = 23/26).

XMyT1 n'a également montré aucun effet sur l'expression des marqueurs neuraux XSoxD dans 92% des cas (n = 47/51) et XSox3 dans 90% des cas (n = 33/37; cf.

Fig.20). Nous pouvons dire que XMyT1 fonctionne en amont des gènes XIA1, XPak3

et elrC, à une étape précoce de la différenciation neuronale. D'après les recherches

faites dans la littérature, nous avons observé que le gène XIA1 présente de

nombreuses similitudes avec XMyT1. En effet, ces deux gènes codent pour un facteur

de transcription à doigts à zinc, ils sont exprimés à la fois dans le développement du

système nerveux et du pancréas et enfin ils sont induits par les facteurs bHLH NeuroD et Ngn3. Par conséquent, nous nous sommes orientés vers une étude détaillée du profil d'expression de XIA1, de son mode de régulation et de son rôle éventuel durant la neurogenèse.

III.1.3 Etude du mécanisme d’action de MyT1

III.1.3.1 Recherche de partenaires protéiques de XMyT1 par la technique du double hybride en levures

Malgré l'importance de XMyT1 dans la neurogenèse, son mode d'action reste à ce jour inconnu. Afin d'identifier des partenaires protéiques de XMyT1, nous avons entrepris une expérience de double hybride en levure. Pour ce faire, nous avons utilisé la région centrale de XMyT1 (RCXMyT1) située entre les deux domaines à doigts à zinc. Cette région centrale combinée à l'un des deux domaines à doigts à zinc a été décrite dans une expérience de gène rapporteur comme étant la partie essentielle à l'activité de XMyT1 (Bellefroid et al., 1996). RCXMyT1 a été inséré dans le plasmide pPC97 en phase avec le domaine de liaison à l'ADN Gal4 (Gal4DBD). Ainsi le pPC97 constitue le vecteur "appât". Pour ce criblage de partenaires protéiques, nous avons utilisé la banque d'ADNc générée à partir d'ARNm issus d'embryons de xénope au stade neurula tardif (banque générée par le Dr. R. Van Wayenbergh, IRIBHN – IBMM – ULB). Pour cette banque, les ADNc ont été insérés dans le plasmide pPC86 en phase avec la région transactivatrice de Gal4 (Gal4TA). Ainsi, le pPC86/banque d'ADNc constitue le vecteur "proie". Les plasmides pPC97 et pPC86 codent respectivement pour les gènes leu

et trp

permettant ainsi aux levures cotransformées de se développer en milieu de croissance carencé en leucine et en tryptophane (SD-LT, Chevrey and Nathans, 1992).

L'interaction entre la région centrale de XMyT1 et un partenaire protéique potentiel

active l'expression des gènes His3, Ade et LacZ permettant ainsi aux levures

cotransformées de se développer également en milieu de croissance dépourvu

d'histidine et d'adenine (SD-LHTA). De plus, cette interaction active l'expression de la β -galactosidase ce qui permet d'effectuer des expériences contrôles de coloration lacZ sur levures issues de cultures aussi bien solide que liquide (cf. Fig.21).

Nous avons utilisé 10 millions de levures que nous avons cotransformées avec les vecteurs pPC97/RCXMyT1 et pPC86/banque d'ADNc. Etant donné que la taille des inserts de la banque d'ADNc fait environ 1,5kb et que la taille du génome du xénope est estimé à 1,5 milliard de paires de bases (cette dernière donnée est issue du site web Ensembl Genome Browser), nous avons transformé 10 équivalent génomique. La première étape de sélection consistait à faire pousser ces levures en milieu de croissance carencé SD-LHT. Nous avons obtenu 132 candidats positifs. La deuxième étape consistait à augmenter la pression de sélection en repiquant les 132 colonies en milieu de croissance carencé SD-LHTA. Il restait 50 candidats. La troisième étape de sélection a été le test de coloration β-gal ce qui a donné 16 colonies positives (cf. Fig.22). A l'aide du programme informatique "blast"

disponible sur le site web NCBI, nous avons analysé les séquences des 16 candidats.

Nous avons identifié diverses protéines à savoir C-terminal Binding Protein (XCtBP),

nuclear matrix Protein, Smad Anchor receptor activation (X-SARA),

Heterochromatin prot-1 gamma (X-HP1-γ), Keratin type I, Heat Shock Protein (X-

Hsp90β), Actin, kinase C receptor protein, myc-related DNA binding protein (X-

MyoD), Cold-Inducible RNA-binding protein (X-CIRP), ATPase, Chodromodulin 1

precursor (X-ChM-I). Toutes ces protéines ne sont apparues qu'une seule fois sur les

16 candidats à l'exception de Keratin type I qui est apparu deux fois. Nous n'avons

pas réussi à séquencer correctement quatre candidats sur les 16. Ces derniers restent

indéterminés. Parmi ces résultats, le candidat C-terminal Binding Protein (XCtBP),

une protéine constituée de 437aa, a été retenu car il s'agit d'un cofacteur de

transcription et que XMyT1 est un facteur de transcription.

III.1.3.2 Caractérisation du partenaire protéique XCtBP identifié par la technique du double hybride en levures

CtBP reconnaît les motifs Pro-X-Asp-Leu-Ser (PXDLS) et agit comme corépresseur transcriptionnel chez la drosophile, le xénope et les mammifères (Crossley and Turner, 2001). La présence d'une lysine en septième position du motif PXDLSXK, permettrait un recrutement contrôlé selon que cette lysine est acétylée ou non. Un autre motif similaire présente une forte affinité avec CtBP à savoir Pro- X-Asp/Asn-Leu-Ser/Thr (PX

/

L

/

; Molloy et al., 1998). De plus, une série de motifs dits dégénérés recrutant CtBP a été mise à jour tels que VLDLS chez la drosophile (Nibu et al., 2001), ALDLS chez le virus EBNA3A (Hickabottom et al., 2000) et GLDLS chez la souris (Deltour et al., 2002). Fonctionnellement, CtBP joue un rôle dans le développement du système nerveux embryonnaire. Il a été démontré chez la souris que l'invalidation du gène CtBP2 induit une perturbation de la formation des axes de l'embryon, une malformation du cœur et du système nerveux central (Chinnadurai, 1999). Chez le xénope, deux gènes CtBP ont été identifiés.

Ceux-ci sont dupliqués compte tenu de la tétraploïdie de son génome. Ils ont été nommés XCtBP (Brannon et al., 1999) et XCtBP1 (Sewalt et al., 1999). Nous pourrions arbitrairement nommé les deux gènes dupliqués XCtBP-Like et XCtBP1- Like.

Nous avons retrouvé trois motifs dans la RCXMyT1 susceptibles d'interagir avec XCtBP à savoir PGDLS, PENLS et TLDLS. Le second motif contient une lysine en septième position à savoir "PENLSTK". Le troisième motif "TLDLS"

constituerait un nouveau motif dégénéré non décrit à ce jour. L'analyse de l'alignement des séquences peptidiques de la région centrale de XMyT1 avec celles des protéines Myt1-L, Myt1 et Myt3 issus de différentes espèces (Drosophila melanogaster, Caenorhabditis elegans, Caenorhabditis briggsae, Ciona intestinalis, Xenopus tropicalis, Danio rerio, Gallus gallus, Mus musculus, Rattus norvegicus, Homo sapiens) révèle que les trois motifs ne sont pas conservés de la même manière.

Le premier motif "PGDLS" est présent uniquement chez les deux espèces de xénope

analysées. Le deuxième motif "PENLS" est, chez tous les vertébrés analysés,

parfaitement conservé dans toutes les protéines Myt1, partiellement conservé

"PQNLS" dans toutes les protéines Myt1-L et absent dans toutes les protéines Myt3.

Le troisième motif "TLDLS" est parfaitement conservé dans les protéines Myt1-L, Myt1 et Myt3 chez tous les vertébrés analysés. Par contre, aucun de ces trois motifs n'a été identifié dans les protéines orthologues chez Caenorhabditis elegans, Caenorhabditis briggsae et Ciona intestinalis (cf. Fig.23). Néanmoins, il existe d'une part chez les deux espèces de nématode un motif de recrutement reconnu par CtBP à savoir "PLDLT" et d'autre part un motif dégénéré chez Ciona intestinalis à savoir

"ALDLS". Lors de l'analyse de la séquence peptidique de Myt1 chez la drosophile (dMyt1), nous avons identifié le troisième motif "TLDLS". Par conséquent, la drosophile est le seul invertébré possédant un des trois motifs identifiés chez les vertébrés.

III.1.3.3 Interaction entre les protéines XMyT1 et XCtBP surexprimées dans des cellules en culture

Cette interaction entre XMyT1 et XCtBP a été confirmée par différentes expériences. Dans un premier temps, nous avons réalisé des mesures d'activité β- galactosidase faite sur culture liquide de levure. Cette activité β-gal mesurée est révélatrice d'une interaction entre les deux protéines étudiées et non le résultat d'une activation exercée par les protéines RCXMyT1 et XCtBP indépendamment l'une de l'autre. Ayant conclu à une interaction entre XCtBP et XMyT1, nous avons étudié ensuite l'interaction entre XCtBP et d'une part les protéines Myt1-L, Myt3 de un vertébré et d'autre part la protéine Myt1 de un invertébré. Pour cela, nous avons réalisé une expérience de coloration lacZ sur levure en milieu liquide (cf. Fig.24A).

Cette expérience révèle une activité β-gal équivalente lorsque l'on cotransforme les

levures avec XCtBP/Myt1-L, XCtBP/Myt1 et XCtBP/Myt3. Ainsi nous déduisons

une interaction entre XCtBP et Myt1-L, Myt1 et Myt3. Nous concluons également à

une interaction interspécifique entre d'une part XCtBP de xénope et d'autre part

XMyT1 (de xénope), rMyt1-Like, rMyt3 (de rat) et CeMyt1 (de nématode). Par

contre, on mesure une activité β-gal deux fois moindre concernant l'interaction révélée entre les protéines XCtBP et Myt1 du nématode. Celui-ci contient un seul motif "PLDLT" non présent chez les vertébrés. Les propriétés d'interaction entre les membres Myt et CtBP sont donc conservées évolutivement. Dans un deuxième temps, nous avons réalisé en collaboration avec le Department of Development, Flanders Interuniversity Institute for Biotechnology (VIB) des expériences sur une lignée cellulaire embryonnaire de rein humain (HEK293T) de co- immunoprécipitation (co-IP) et de double hybride en cellules de mammifères (cf.

Fig.24B,C,D). Pour l'expérience de co-IP, réalisée sur cellules 293T, nous avons utilisé deux constructions codant pour des formes tronquées de la protéine XMyT1.

La première construction est constituée du premier doigt à zinc jusqu'à la fin de la partie C-terminale (aa1122; Myt1 1ZF-Stop). La deuxième construction est constituée de la région centrale située entre les deux domaines à doigts à zinc (Myt1 RC). Ces deux dernières constructions sont fusionnées avec l'épitope Myc. Nous avons également utilisé deux constructions codant pour les protéines complètes CtBP1 humaine (hCtBP1) et CtBP2 de souris (mCtBP2). Ces deux dernières protéines sont marquées avec l'épitope Flag. Nous avons utilisé pour cette expérience de co-IP la protéine Smad-interacting protein-1 (SIP1) de souris qui a servi de contrôle positif. En effet, SIP1 a été décrite comme protéine interagissant à la fois avec CtBP1 et CtBP2 (Eisaki et al., 2000; van Grunsven et al., 2000; Sheng et al., 2003). Lorsque les lysats, contenant Myt1 RC/hCtBP1, Myt1 RC/mCtBP2 et Myt1 1ZF-Stop/hCtBP1 sont immuno-précipités avec l'anticorps anti-Flag, nous récupérons uniquement les constructions Myt1 par western blot direct en utilisant l'anticorps anti-Myc. Ainsi, les résultats observés en co-IP confirme les mesures d'activité β-gal et donc l'interaction entre d'une part les protéines tronquées de XMyT1 à savoir Myt1 RC et Myt1 1ZF-Stop et d'autre part hCtBP1 et mCtBP2 (cf.

Fig.24B). Pour l'expérience du double hybride en cellules de mammifère (cellules

MCF7), nous avons utilisé une construction codant pour une protéine de fusion entre

une forme tronquée de XMyT1 constituée de la région centrale et le domaine de

liaison à l'ADN Gal4 (RCXMyT1-Gal4). Nous avons également utilisé une

construction codant pour une protéine de fusion entre mCtBP2 et l'activateur

transcriptionnel VP16 (CtBP-VP16). Nous avons testé la capacité de RCXMyT1- Gal4 à interagir avec CtBP-VP16. Pour ce faire, nous avons transfecté deux doses de RCXMyT1-Gal4 à savoir 15ng et 60ng. Nous avons utilisé pour cette expérience une construction codant pour une protéine de fusion entre une forme tronquée de SIP1 constituée du domaine de recrutement de CtBP et le domaine de liaison à l'ADN Gal4 (RDSIP1) qui a servi de contrôle positif. Les résultats obtenus en double hybride en cellules de mammifère montrent que l'interaction entre mCtBP2 et RCXMyT1 se fait de manière dose-dépendante (cf. Fig.24C). Nous avons réalisé une seconde expérience de double hybride en cellules de mammifère (également réalisée sur cellules MCF7) dans laquelle nous avons utilisé trois constructions codant pour trois formes tronquées de XMyT1 fusionnées au domaine de liaison à l'ADN Gal4.

La première construction code pour la région N-terminale constituée du second acide

aminé jusqu'au premier domaine à doigts à zinc, celui-ci n'étant pas inclus. La

deuxième construction code pour la région centrale située entre les deux domaines à

doigts à zinc. La troisième construction est la région C-terminale constituée de du

second domaine à doigts à zinc (celui-ci n'étant pas inclus) jusqu'au dernier acide

aminé (aa1122). Nous avons également utilisé une construction codant pour la

protéine complète mCtBP2 complète fusionnée à l'activateur transcriptionnel VP16

(CtBP-VP16). Nous avons mesuré l'activité luciférase dans deux situations. Dans la

première situation, nous avons transfecté les cellules uniquement avec 45ng d'une

des formes tronquées de XMyT1 afin de comparer leurs valeurs d'activité luciférase

mesurées avec la valeur "seuil" d'activité luciférase engendrée par le vecteur pGL3-

luc

dépourvu d'insert. Cette situation permet de révéler si les trois formes tronquées

de XMyT1 se comporte comme activateurs ou répresseurs de la transcription. Dans

la deuxième situation, nous avons cotransfecté les cellules avec 45ng d'une des trois

formes tronquées de XMyT1 et 50ng de CtBP-VP16. Cette situation permet de

révéler si les trois parties de XMyT1 (N-terminale, centrale et C-terminale)

interagissent avec mCtBP2. Les résultats obtenus en double hybride en cellules de

mammifère montrent qu'il n’y a pas d'interaction entre mCtBP2 et les parties N-

terminale et C-terminale de XMyT1 mais bien entre mCtBP2 et RCXMyT1. Cette

expérience a également révélé que les différentes parties non à doigts à zinc de

XMyT1 fusionnées à Gal4DBD se comportent comme répresseur de la transcription

(cf. Fig.24D; cette dernière activité sera développée au point III.1.3.4). Cette collaboration a donc permis de révéler à la fois que l'interaction entre XMyT1 et CtBP est spécifique uniquement de la région centrale de XMyT1 et que cette interaction peut être croisée entre protéines venant de différentes espèces. Dans un troisième temps, nous avons réalisé une expérience in vivo de co-IP sur embryons de xénope (cf. Fig.24E). Celle-ci s'est effectuée en surexprimant en embryons de xénope XCtBP avec différentes constructions de XMyT1 à savoir XMyT1 sauvage, RCXMyT1, une forme tronquée constituée du premier domaine à doigt à zinc et la première moitié de la région centrale (5'RCXMyT1) incluant les deux premiers motifs et une autre forme tronquée constituée de la deuxième moitié de la région centrale et du deuxième domaine à doigts à zinc (3'RCXMyT1) incluant le troisième motif. Nous avons utilisé la protéine XHRT1 comme contrôle négatif de cette co-IP (Taelman et al., 2006). Nous avons observé une interaction uniquement entre la protéine complète XMyT1 et XCtBP ainsi qu’entre RCXMyT1 et XCtBP. Il se pourrait que les deux constructions tronquées codant pour les deux moitiés de la région centrale forment une structure empêchant XCtBP d'accéder aux motifs ce qui suggère que la région centrale doit être intacte.

III.1.3.4 Identification des motifs dans XMyT1 interagissant avec XCtBP

Afin d’identifier les sites de XMyT1 interagissant avec XCtBP, nous avons généré différentes constructions mutantes de la RCXMyT1 fusionnées à Gal4DBD.

Ces constructions comprennent toutes les combinaisons des mutations ponctuelles des trois sites potentiels recrutant XCtBP. Par conséquent, les motifs PGDLS, PENLS et TLDLS ont été respectivement mutés en PAAAS, PAAAS et TAAAS.

Les expériences qui suivent sont issues d'une collaboration avec le laboratoire du

Professeur Huylebroeck. Ces mutants ont été testés, dans un premier temps, seuls

dans une expérience de gène rapporteur. On observe que tous les mutants continuent

à réprimer la transcription du gène rapporteur (cf. Fig.25A) suggérant que XMyT1

interagirait avec d’autres corépresseurs. Ce dernier cas de figure est correct si l'on se réfère à la publication récente faite par l'équipe du Professeur Hudson dans laquelle il a été démontré chez la souris que Myt1 interagit avec le corépresseur Sin3β (Romm et al., 2005). Ces mutants ont été testés, dans un deuxième temps, en double hybride en cellules de mammifères. Pour ce faire nous avons utilisé une construction supplémentaire codant pour une protéine de fusion entre CtBP2 de souris et l'activateur transcriptionnel VP16 (mCtBP2/VP16). Nous mesurons une activité β–

gal équivalente et la plus élevée, à savoir près de 40 unités, lorsque l'on cotransfecte les cellules avec mCtBP2/VP16 et l'une des constructions mutantes RCXMyT1 contenant au moins le site TLDLS. Par contre, nous mesurons une activité β–gal équivalente mais deux fois moindre, à savoir en moyenne 20 unités, lorsque l'on cotransfecte les cellules avec mCtBP2/VP16 et l'une des constructions mutantes RCXMyT1 dépourvues du site TLDLS. Finalement, nous mesurons une activité β–

gal de près de 10 unités lorsque l'on cotransfecte les cellules avec mCtBP2/VP16 et la construction mutante RCXMyT1 dépourvue des trois sites recrutant CtBP. Par conséquent, cette expérience de double hybride en cellules de mammifère révèle que le 3

site (TLDLS) a la plus grande affinité pour mCtBP2 (cf. Fig.25B). Rappelons que l'alignement des séquences peptidiques (cf. point III.1.3.2) montre que ce 3

site de type dégénéré est conservé à la fois dans les trois protéines Myt1-L, Myt1 et Myt3 chez toutes les espèces analysées à l'exception de Caenorhabditis elegans, Caenorhabditis briggsae et Ciona intestinalis. Ces résultats suggèrent que le motif TLDLS est le plus important et qu'il jouerait un rôle prépondérant dans l'activité répressive exercée par le corépresseur CtBP.

III.1.3.5 Etude de la signification de l’interaction avec XCtBP

Afin de comprendre la signification de l'interaction entre XMyT1 et XCtBP,

nous avons généré une construction XMyT1Δ

codant pour la protéine XMyT1

complète ne pouvant plus recruter XCtBP. Pour cela, nous avons effectué des

mutations ponctuelles au niveau des acides aminés de ses trois motifs. Par une

expérience de co-IP, nous avons confirmé la perte d'interaction entre XCtBP et XMyT1 (cf. Fig.26). Cette construction a permis de mieux comprendre le mécanisme transcriptionnel de XMyT1 grâce à des expériences effectuées in vivo et in vitro.

Nous avons mesuré à l'aide d'une expérience de rétro-trancsription et d'amplification

par PCR quantitative en temps réel (RT-qPCR) le nombre de copies d'ARNm de

XIA1 et N-Tub induites par la surexpression en embryons de xénope de XMyT1,

XMyT1

, XMyT1 combiné à XAsh3 et XMyT1

combiné à XAsh3. Nous

avons effectué cette expérience dans deux conditions différentes. La première

condition est la surexpression de XMyT1 sauvage et muté en cellules naïves. Ceci

consiste en l'injection des ARNm d'intérêt en embryons de xénope puis en la

dissection des calottes animales au stade blastula afin de séparer l'ectoderme du

mésoderme ce qui empêche l'induction neurale des cellules du pôle animal par le

mésoderme. La seconde condition est la surexpression de XMyT1 sauvage et muté,

combiné ou pas à XAsh3, en cellules neuralisées. Pour cela nous co-injectons, en

plus du mélange d'ARNm d'intérêt, le facteur Noggin. Dans les conditions naïves,

afin d'observer une activité répressive ou activatrice de la transcription, nous avons

mesuré le nombre de copies d'ARNm de XIA1 et N-Tub exprimées dans les calottes

animales non injectées et l'avons comparé au nombre de copies d'ARNm de XIA1 et

N-Tub issus des calottes animales induites par la surexpression de XMyT1 d'une part

et XMyT1

d'autre part. Par contre, dans les conditions neuralisantes, nous

avons mesuré le nombre de copies d'ARNm de XIA1 et N-Tub exprimés dans les

calottes animales induit par la surexpression de Noggin et l'avons comparé au

nombre de copies d'ARNm de XIA1 et N-Tub issus de calottes animales induit par la

surexpression de XMyT1, XMyT1

seuls et combinés à XAsh3. Dans chacune

des deux conditions, nous avons normalisé les valeurs obtenues pour les expressions

de XIA1 et N-Tub par les valeurs obtenues pour l'expression du gène Xenopus

glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (XGAPDH). Pour réaliser ces

expériences, nous avons construit les amorces spécifiques à partir du logiciel Primer3

disponible sur le site web (http://cbr-rbc.nrc-cnrc.gc.ca/cgi-bin/primer3_www.cgi) en

utilisant les paramètres appropriés (Rozen and Skaletsky, 2000).

L'expérience de RT-qPCR en conditions naïves montre que XMyT1 réprime faiblement l'expression de XIA1 tandis que le mutant n'est plus capable d'exercer cette répression. Par contre, on observe que les protéines XMyT1 sauvage et mutante activent tous les deux l'expression de N-Tub de manière similaire. Afin de vérifier si la répression de l'expression de XIA1 causée par XMyT1 sauvage n'est pas un artefact, nous avons en parallèle surexprimé XNgnr1 en embryons de xénope en travaillant les mêmes conditions que celles utilisées pour XMyT1. Nous avons ainsi observé, comme attendu, une augmentation significative de l'expression de XIA1 et N-Tub (cf. point III.1.2.3.2). Ces résultats suggèrent que le recrutement de XCtBP joue un rôle dans l'activité transcriptionnelle de XMyT1 et que ce rôle est restreint au gène XIA1 (cf. Fig.27). En effet, dans les conditions utilisant des cellules naïves, XMyT1 perd sa capacité à réprimer l'expression du gène XIA1 en absence d'interactions avec XCtBP. L'expérience de qPCR en conditions neuralisantes montre que XMyT1 sauvage se comporte comme activateur de la transcription en augmentant l'expression de XIA1. Nous observons que XMyT1

induit environ deux fois plus l'expression de XIA1. De même la co-injection de XMyT1 combiné à XAsh3 montre un effet synergique dans l'induction de XIA1 et celle-ci double lorsque l'on co-injecte XMyT1

combiné à XAsh3. Ce résultat montre que le recrutement de XCtBP réduit l'activité transcriptionnelle de XMyT1 ainsi que l'activité transcriptionnelle synergique de XMyT1/XAsh3. Cette expérience montre également que les protéines XMyT1 sauvage et mutante activent tous les deux l'expression de N-Tub de manière similaire. De même, les co-injections de XMyT1/XAsh3 et XMyT1

/XAsh3 activent l'expression de N-Tub de manière similaire bien que cette activation soit plus importante que XMyT1 seul. Ces résultats montrent à nouveau que le recrutement de XCtBP a une signification dans l'activation de XIA1 uniquement.

Afin de mieux comprendre le mode d'action de la protéine XMyT1 sur

l'activation de l'expression du gène XIA1 observée par hybridation in situ et par

qPCR, nous avons réalisé, en cellules de mammifères, des expériences de gène

rapporteur contenant en amont la séquence promotrice humaine de IA1 (séquence

localisée de -1656pb à + 30pb, aimablement fournie par le Dr. Lan). Nous avons

travaillé sur une lignée de cellules épithéliales humaines isolées à partir d'un adénocarcinome (Hela). Dans un premier temps, nous avons mesuré l'activité transcriptionnelle, en utilisant des doses croissantes (100pg et 250pg), de la protéine XMyT1 sauvage et de la protéine XMyT1

mutante ne pouvant plus interagir avec XCtBP. Ensuite, nous avons comparé la capacité de ces deux protéines à réguler l'expression de la transcription du gène rapporteur. Nous avons observé que les protéines XMyT1 et XMyT1

activent toutes les deux la transcription.

Cependant, nous avons constaté que l'activité de XMyT1

est près de deux fois plus élevée que celle de la protéine sauvage (cf. Fig.28A). Dans un deuxième temps, nous avons voulu comparer l'activité synergique de XMyT1 sauvage et mutante lorsqu'elles sont combinées à XAsh3. Pour ce faire, nous avons cotransfecté 250pg de XMyT1 et XAsh3 d'une part et 250pg de XMyT1

et XAsh3 d'autres part.

Nous avons à nouveau observé que l'activité transcriptionnelle exercée par la

combinaison XMyT1

et XAsh3 est près de deux fois plus élevée que celle

exercée par la combinaison de XMyT1 et XAsh3 (cf. Fig.28B). Dans ces deux

dernier cas de figures, la protéine XMyT1 active la transcription de manière plus

prononcée lorsqu'elle n'est plus capable de recruter le corépresseur XCtBP. Dans un

troisième temps, nous avons voulu vérifier si les activités d'activation de la

transcription, observées par XMyT1 et XMyT1

transfectés seuls ou combinés à

XAsh3, étaient spécifiques à la séquence promotrice d'IA1. Pour ce faire, nous avons

comparé l'effet de XMyT1, transfecté à des doses croissantes (100pg, 250pg et

500pg), sur le gène rapporteur contenant la séquence promotrice d'IA1 humaine et

sur le gène rapporteur dépourvu de cette séquence promotrice. Nous avons observé

que XMyT1 n'active pas la transcription du gène rapporteur dépourvu de la séquence

promotrice d'IA1 et ce à aucune des doses utilisées. Par conséquent, l'activation de la

transcription exercée par XMyT1 est spécifique au promoteur d'IA1. Ensuite, nous

avons effectué une analyse informatique des séquences promotrices d'IA1

(constituées des 2000pb situées en amont de l'ATG d'initiation de la traduction) chez

la souris, le rat et l'humain afin d'identifier le consensus AAAGTTT reconnu par les

domaines à doigts à zinc de la protéine XMyT1 (Kim and Hudson, 1992). Nous

n'avons identifié aucun consensus d'intérêt dans les promoteurs des trois espèces

analysées. Ainsi, nous avons voulu vérifier si les activités d'activation de la

transcription exercées par XMyT1 et XMyT1

nécessitent les domaines à doigts

à zinc. Pour cela, nous avons utilisé des formes tronquées de XMyT1 à savoir une

protéine constituée uniquement de sa région centrale (RCXMyT1) et une protéine

constituée de son premier domaine à doigts à zinc et sa région centrale

(ZFRCXMyT1). Nous avons transfecté des doses croissantes de ces deux

constructions et avons comparé leur activité avec celle de XMyT1 sauvage. Nous

avons observé que ZFRCXMyT1 continue à activer la transcription mais plus

faiblement que XMyT1 et que RCXMyT1 continue également à activer la

transcription mais près de deux fois moins que XMyT1 (cf. Fig.28C). Ces résultats

indiquent que le domaine à doigts à zinc, qui a pour rôle la fixation de la protéine à

l'ADN, n'est pas nécessaire à l'activation de la transcription mais qu'il augmente

l'efficacité de cette activation. Par ailleurs, ces résultats suggèrent que la région

centrale pourrait soit à elle seule reconnaître dans le promoteur d'IA1 un motif non

identifié divergent de la séquence AAAGTTT identifiée in vitro soit activer la

transcription en se fixant elle-même sur des facteurs bHLH par exemple. Dans ce

dernier cas, nous citons des facteurs bHLH car la séquence promotrice d'IA1 utilisée

contient des E-box (Breslin et al., 2003). De plus, il a été montré chez la drosophile

que le facteur de transcription à doigts à zinc SENS réprime la transcription lorsqu'il

se fixe au motif "S-binding" et qu'il active la transcription en se fixant aux facteurs

bHLH lorsque la protéine SENS mutante n'est plus capable de se fixer au motif "S-

binding" (Acar et al., 2006). En conclusion, ces expériences de gène rapporteur ont

permis de confirmer les résultats observés précédemment dans les expériences de

surexpression de XMyT1 en embryons de xénope. En effet, l'activation de

l'expression de XIA1 par XMyT1 s'était observée par hybridation in situ et par RT-

PCR quantitative en temps réel.

III.2 Le gène XIA1

III.2.1 Profil d’expression de XIA1

Afin d'analyser le profil d'expression de XIA1 au cours de l'embryogenèse du xénope, nous avons commandé un ADNc (EST IMAGE CLONE 10928-P09), constitué de 3390pb, qui code pour la protéine XIA1 constituée de 433aa. Cette protéine présente 62% d’identité avec les protéines de souris et humaine. On observe par hybridation in situ l’expression de XIA1 dès le stade neurula précoce (stade 12) au niveau des trois bandes de neurones primaires comprenant les neurones moteurs, les interneurones et les neurones sensoriels présents dans la partie dorsale de l’embryon. XIA1 est également exprimé dans les neurones situés dans les placodes trigéminales, le prosencéphale et le mésencéphale. Les stades plus tardifs tels que bourgeon caudal (stade 26) et têtard (stade 33) montrent une expression de XIA1 localisée dans le SNC antérieur et dans l’entièreté du tube neural. A ces stades-ci XIA1 s'exprime dans la région antérieure de l'embryon comprenant les placodes olfactives et le prosencéphale mais aussi dans les nerfs crâniens, les vésicules optiques, le mésencéphale, le rhombencéphale et ventralement dans des cellules qui semblent impliquées dans le développement du muscle lisse (Smith et al., 2000;

Talikka et al., 2004; cf. Fig.29). Une étude plus détaillée du profil d'expression de XIA1 effectuée grâce à diverses coupes transversales à partir de têtards montre que XIA1 s’exprime dans la zone subventriculaire du tube neural. Le profil d’expression de XIA1 chevauche celui de XMyT1 (cf. Fig.30).

III.2.2 Régulation de l’expression de XIA1

Il a été démontré que XIA1 est activé par Ngn3 dans le pancréas et par

NeuroD dans des cellules en culture (Breslin et al., 2003; Mellitzer et al., 2006). Afin

de déterminer la position (amont/aval par rapport aux autres gènes impliqués dans la

neurogenèse précoce) de XIA1 dans la cascade, nous avons testé, en collaboration

avec la doctorante F. Christulia, la capacité des différents facteurs, régulateurs de la

neurogenèse, à moduler l'expression de XIA1. Nous observons que XIA1 est régulé

positivement par les facteurs bHLH XNgnr1, XNeuroD, XAth3 et XAsh3, par le

facteur HLH Xebf3, le facteur bHLH/Lzip à doigts à zinc XMxi1 et par la

combinaison du facteur bHLH XAsh3 et le facteur à doigts à zinc XMyT1. Pour cette

étude, tous ces facteurs ont été injectés à 250pg en embryons de xénope dans le pôle

animal d'un blastomère au stade deux cellules. Dans tous ces cas de figure, à

l'exception des facteurs XAsh3 et XMyT1 injectés seuls, nous observons dans la

partie injectée une expression ectopique de cellules exprimant XIA1 à savoir dans

96% des cas (n = 23/24) pour XNgnr1, dans 96% des cas (n = 26/27) pour NeuroD,

dans 97% des cas (n = 31/32) pour XAth3, dans 96% des cas (n = 52/54) pour

XMxi1 et dans 82% des cas (n = 23/28) pour Xebf3. L'induction de XIA1 exercée par

XAsh3 se manifeste dans 92% des cas (n = 56/61) par une augmentation de la densité

des bandes de neurones primaires. L'expression du gène XIA1 est également induite

par XMyT1 dans 95% des cas (n = 55/58). Ceci s'observe, comme dans le cas de

XAsh3, par un épaississement et une augmentation de la densité des bandes de

neurones primaires exprimant XIA1 dans la partie injectée. Nous observons aussi que

XIA1 est régulé négativement par la voie de signalisation Delta/Notch. En injectant

les dominants négatifs SuH

et Delta

qui tous deux augmentent le nombre de

neurones primaires, nous observons un épaississement des bandes de neurones

exprimant XIA1 dans respectivement 88% des cas (n = 37/42) et 85% des cas (n =

34/40). De manière convergente, la surexpression de gènes neurogéniques réprimant

la neurogenèse NotchICD et Su(H)

, induit une inhibition des bandes neuronales

exprimant XIA1 dans respectivement 95% des cas (n = 36/38) et 85% des cas (n =

33/39; cf. Fig.31). En conclusion, par ces expériences de gain de fonction, nous

observons que comme dans le cas du pancréas, l'expression de XIA1 est induite par

Neurogenin. Nous observons également que d'autres facteurs bHLH tels que NeuroD,

XAth3 et XAsh3 sont capables d'induire l'expression de XIA1 bien qu'ils semblent

exprimés après XIA1. Il est donc probable que ces facteurs fonctionnent comme

activateurs indirects de l'expression de XIA1. Ces effets observés sont probablement

dus à la capacité de ces protéines à imiter l'activité de XNngr1.

III.2.3 Etude du rôle de XIA1

Dans une expérience de gène rapporteur, IA1 se comporte comme répresseur de la transcription (Breslin et al., 2002). Aussi, il a été montré que les doigts à zinc deux et trois sont suffisants pour son activité transcriptionnelle. D'autres expériences de gène rapporteur ont montré que le gène IA1 peut s'auto-réguler et également réguler le gène NeuroD/2 β . La répression exercée par IA1 sur le promoteur de NeuroD/2 β se fait plus efficacement par le recrutement de la protéine cylin D1, impliquée dans le cycle cellulaire, et des HDAC1 et HDAC3 (Liu et al., 2006).

Concernant son implication dans la neurogenèse, rien n'est connu à ce jour. Nous

avons donc tenté de comprendre le rôle de XIA1 dans la différenciation neuronale en

réalisant des expériences de gain de fonction. Pour ce faire, nous avons surexprimé

en embryons de xénope la protéine XIA1 sauvage mais également une construction

codant pour une forme tronquée de XIA1. Celle-ci a été générée dans le but de

fonctionner comme dominant négatif. Cette protéine mutante comprend uniquement

le domaine à doigts à zinc (ZF-XIA1). Nous avons injecté un mélange de 250pg

d'ARNm codant pour une de ces deux constructions et 50pg d'ARNm codant pour la

galactosidase dans un blastomère aux stades 2-4 cellules. La surexpression de XIA1

sauvage n'a montré dans 87% des cas (n = 53/61) aucun effet sur le marqueur

neuronal N-Tub. De même, la surexpression du mutant n'a également montré aucun

effet sur N-Tub à savoir dans 79% des cas (n = 44/56; cf. Fig.32). Par conséquent,

suite à cette expérience de gain et perte de fonction, le facteur XIA1 semble ne pas

être requis lors de la neurogenèse précoce. Ce facteur pourrait jouer un rôle plus

tardivement dans le développement neuronal.

III.3 Le gène Myt1-L

III.3.1 Expérience de perte de fonction chez la souris-Construction d’un vecteur d’invalidation de MyT1-L

Le rôle de la famille de gènes NZF/Myt dans la neurogenèse n'a été mis en

évidence que chez le xénope. Une fonction équivalente par ce facteur de transcription

dans la neurogenèse n'a pas encore été démontrée chez les mammifères. Nous avons

donc entrepris une expérience d'invalidation d'un des gènes Myt chez la souris. Nous

avons choisi d'invalider le gène Myelin transcription factor1-Like (Myt1-L), un des

membres de la famille exprimé spécifiquement dans les cellules neuronale. Myt1-L

est également nommé dans la littérature Postmitotic neural gene-1 (Png1) et Neural

zinc finger-1 (NZF1). Myt1-L est un gène de grande taille faisant près de 145 kb

constitué de 27 exons (cf. Fig.33A). Il est localisé sur le chromosome 12 chez la

souris. L'ARNm de Myt1-L est constitué de 4532 bases et comporte de nombreux

codons méthionine. Ce transcrit code pour une protéine de 1182 aa qui comporte

deux domaines à doigts à zinc (ZF) constitué de deux ZF et quatre ZF. Parmi les trois

membres Myt1-L, Myt1 et Myt3 seules les protéines Myt1-L et Myt1 compte un ZF

supplémentaire et ce chez tous les vertébrés analysés. Ce septième ZF se situe dans la

partie N-terminale de la protéine (au niveau du 3

exon codant). Notre stratégie a

consisté à éliminer les trois premiers exons codants, afin de retirer l'ATG d'initiation

de traduction, en les remplaçant par une cassette de sélection néomycine (Neo-Tk)

par recombinaison homologue (cf. Fig.33B). Nous n’avons pas voulu insérer la

cassette Neo-Tk au niveau des deux domaines ZF étant donné la longue distance qui

les sépare (près de 50kb), ni l’insérer au niveau d’un des deux domaines ZF car il a

été démontré, chez le xénope par une expérience de délétion, qu’un seul des deux

domaines ZF lié à la région centrale de XMyT1 suffit à se fixer à l’ADN et à activer

l'expression d'un gène rapporteur (Bellefroid et al., 1996). Nous avons également

vérifié s'il existait des transcrits alternatifs. Ces derniers peuvent rendre inefficace la

stratégie adoptée pour l'invalidation du gène Myt1-L. En effet, un transcrit alternatif

codant pour un variant de la protéine Myt1-L ne possédant pas la région invalidée

pourrait par effet de redondance fonctionnelle compenser l'activité de la protéine sauvage absente ce qui empêcherait l'observation du phénotype Myt1-L

. Cette étape est d'autant plus importante que l'ARNm de Myt1-L comporte de nombreux codons méthionine susceptibles de générer la traduction pour les éventuels transcrits alternatifs. Une recherche informatique effectuée à partir du site web Ensembl Genome Browser, nous a permis d'identifier onze EST formant cinq transcrits alternatifs différents. L'analyse des séquences de ces onze EST a révélé que le premier exon comportant l'ATG d'initiation de traduction est toujours présent ce qui conforte notre stratégie d'invalidation adoptée, dans laquelle nous éliminons les trois premiers exons codants afin de supprimer l'ATG d'initiation de traduction du premier exon codant (cf. Fig19c).

Nous avons dans un premier temps criblé une banque d'ADNc génomique

issue de la lignée de souris 129-SVJ (BAC genomic library, Genomesystem) à l'aide

d'une sonde radioactive d'ADNc de Myt1-L. Neuf clones ont été ainsi obtenus. Par

séquençage et analyse des ces séquences via le programme informatique "blast",

nous avons vérifié que ces clones contenaient bien les fragments d'ADN génomique

de Myt1-L. Grâce à la séquence complète du gène Myt1-L et à sa structure

introns/exons disponibles tous deux sur le site web Ensembl Genome Browser, nous

avons pu définir avec précision les tailles des fragments d'ADN génomique contenus

dans les neuf clones isolés et définir avec précision les introns et exons présents dans

ces fragments. Nous avons ensuite élaboré une stratégie pour la construction du

vecteur de ciblage (pBKSII/NEO/DTA-Myt1L; cf. Fig.34A). Ce vecteur de ciblage

s'est fait en plusieurs étapes: la première étape consiste à insérer dans le plasmide

pBKSII deux nouveaux sites de restriction contigus 5' PacI – SmaI 3' entre les sites

de restriction XhoI et KpnI présents dans le site de clonage multiple. Ces deux

nouveaux sites de restriction serviront à insérer le grand bras (cf. 5

étape). La

deuxième étape consiste à insérer le bras 5' en amont de la cassette de sélection

positive néomycine "Neo-Tk" dans le vecteur pMC1Neo au niveau du site de

restriction BamHI. Ce bras 5' est extrait par digestion BamHI à partir du clone RP21-

376A7 contenant le fragment chromosomique d'intérêt dans le plasmide PAC4 issu

de RPCI mouse PAC library 21. Après digestion du clone RP21-376A7, le bras 5' a

été isolé à l'aide d'une sonde ADN radioactive. La troisième étape consiste à éliminer

le site de restriction SmaI du pBKSII étant donné que nous avons ajouté un site SmaI à la 1

étape. Celui-ci servira à linéariser la construction finale. Pour ce faire, on clive dans le site de clonage multiple au niveau des sites EcoRI et BamHI. Cette dernière digestion est traitée par l'enzyme Klenow générant des bouts francs qui seront ligués. La quatrième étape consiste à extraire du pCM1Neo le fragment contenant le bras 5' et la cassette Neo-Tk par digestion au niveau des sites de restriction HindIII et XhoI. Ce fragment est inséré dans le pBKSII en utilisant les mêmes sites de restriction. La cinquième étape consiste à extraire le bras 3', bras qui sera placé en aval de la cassette Neo-Tk, par digestions PacI et SmaI, également à partir du clone RP21-376A7. Il sera ensuite ligué en utilisant ces mêmes sites dans le pBKSII. La sixième étape consiste à ajouter dans le pBKSII au niveau du site de restriction SalI, la cassette de sélection négative DTA, extraite par digestion SalI du plasmide pBL-DTA. Cette construction de ciblage a été vérifiée par diverses digestions enzymatiques, par PCR et séquençage (cf. Fig.34B). Un criblage a été réalisé en collaboration avec le Laboratoire de Biologie de Développement du Professeur Szpirer. Nous avons travaillé sur des cellules ES de type E14 issues de la lignée 129-SVJ qui sont idéales pour produire des chimères par injection au stade blastula des cellules ES ayant intégrées la cassette Neo-Tk. Parmi les cellules électroporées avec le gène de ciblage et sélectionnées en milieu généticine (G418), mille colonies présentant un événement de recombinaison homologue ou un événement d'insertion aléatoire ont été repiquées et leur génotype a été analysé par southern blot à l'aide d'une sonde extérieure à la construction (située en amont du bras 5', cf. Fig.34C). L’allèle sauvage donne une bande de 9 kb tandis que l’allèle invalidé donne une bande de 7,5 kb. Aucun clone positif n’ayant été identifié (cf.

Fig.34D), nous n'avons pu par conséquent donner suite à cette expérience. Les étapes

suivantes consistaient en l'utilisation des clones positifs et de les agréger avec des

embryons au stade morula. Ces derniers devaient ensuite être réimplantés dans des

souris pseudo-gestantes de lignée CD1 (pelage blanc). Les souris chimériques ainsi

obtenues devaient être croisées avec des souris sauvages permettant de sélectionner

leur descendance sur base de la couleur du pelage brun (s'il y a eu colonisation de la

lignée germinale par le clone de cellules ES issues de la lignée 129-SVJ). Le

croisement de souris hétérozygotes Myt1-L

entre elles devait permettre de générer

des souris homozygotes Myt1-L

afin d'étudier leur phénotype.