Abréviations Abréviations
5AZA 5-azacytidine, inhibiteur de la méthylation de l'ADN ADA Adaptor protein
AdMLR Adenovirus Major Late Receptor ATPase Enzyme catalysant l'ATP
b Région basique
boîte E Séquence consensus de fixation des protéines du réseau Myc/Mad/Max CBP CREB-binding protein
CDK Kinase des cyclines
CDKI Inhibiteur des kinases des cyclines
ChIP Chromatin immunoprecipitation, immunoprécipitation de la chromatine DDM1 Decrease in DNA methylation
Dnmt DNA methyltransferase, Méthyltransférase de l'ADN ES Embryonic stem cells
FAT Factor Acetyltransferase, Acétyltransférase de protéines non-histones HAT Histone Acetyltransfarse, Acétyltransférase d'histones
HDAC Histone Deacetylase, Désacétylase d'histones
HIV Human Immunodeficiency Virus, rétrovirus de l'immunodéficience acquise
HKMT Histone Lysine Methyltransferase, Méthyltransférases d'histones sur des résidus lysines HLH Helix-loop-Helix, structure en hélice-boucle-hélice
HP Heterochromatin binding Protein, Protéine liant l'hétérochromatine ICF Immunodéficience, instabilté centromérique et anomalies faciales ISWI Imitation of switch
LZ Leucine Zipper, structure en tirette à leucines
MBD Methyl Binding Domain protein, protéine liant les sites CpG méthylés de l'ADN Miz-1 Myc Interacting Zinc Finger protein 1
NCoR Nuclear Receptor Co-Repressor
NLS Nuclearisation signal, signal permettant la translocation d'une protéine dans le noyau
nm Nanomètre
NuRD Nucleosome Remodelling and Deacetylation pb Paire de bases
PCAF CBP/p300 associated factor PCNA Proliferation Cellular Nuclear factor
PCR Polymerase Chain Reaction, Amplification génique en chaîne PEV Position effect Variegation
PHD Plant Homeodomain, homéodomaine de plante PKC Protéine Kinase C
PML Promyelocytic Leukemia protein
POZ Domaine caractéristique du Poxyvirus et à Doigts de Zinc
PRMT Histone Arginine Methyltransferase, Méthyltransférase d'histones sur des résidus arginine PwwP Domaine caractérisé par la répétition de la séquence Pro-Trp-Trp-Pro
RAR Retinoic Acid Receptor Rb Protéine du rétinoblastome
RT Reverse Transcription, Transcription réverse de l'ARN en ADNc SAM S-adénosyl-méthionine
SBS Domainde de liaison à l'ADN des protéines Smad SID Domaine d'interaction avec mSin3a
SIR (ou Sir) Silent Information Regulator SWI/SNF Switching/sucrose non-fermenting TAF TATA-binding protein-associated factor TF Transcription Factor, Facteur de transcription
TGFβ Facteur de croissance transformant, antimitogenique TPA Phorbol ester tetradecanoyl-phorbol acetate
TRRAP Transcription and Transformation Associated Protein TSA Trichostatine A (inhibiteur des HDAC)
UV Ultra-violet
Résumé Résumé
La méthylation de l’ADN est un phénomène épigénétique qui joue un rôle important dans le développement des mammifères et qui est associé à une répression transcriptionnelle. La méthylation de loci CpG de l’ADN est médiée par les méthyltransférases de l’ADN – les Dnmts. La méthylation joue également un rôle clef dès les stades précoces de la cancérogenèse dans une grande partie des tumeurs où on observe une méthylation, notamment la répression des gènes suppresseurs de tumeurs et une déméthylation, notamment l’expression de séquences d’ADN parasites.
Dans une première partie de la thèse, nous nous sommes intéressés à la méthyltransférase de l’ADN Dnmt3L et plus particulièrement à identifier les mécanismes par quels cette méthyltransférase peut réprimer l’expression génique. Dnmt3L, identifiée et clonée en 2000, est caractérisée comme une méthyltransférase dépourvue de son domaine catalytique jouant probablement un rôle dans la régulation de la méthylation de l’ADN plutôt que dans l’ajout de groupes méthyls à l’ADN. Son rôle est fondamental dans l’établissement de l’empreinte génétique maternelle. Des travaux récents, réalisés, notamment par notre équipe, ont permis de montrer que plusieurs Dnmt répriment la transcription non seulement en méthylant l’ADN mais également en interagissant avec les déacétylases d’histones, HDAC. Au regard de ces résultats, nous nous sommes intéressés à évaluer si Dnmt3L est également capable de réprimer la transcription en recrutant une activité HDAC. Des recherches menées de concert avec Rachel Deplus, étudiante en thèse au laboratoire, ont permis de montrer que Dnmt3L interagit avec les déacétylases d’histones, ce qui conduit à la répression de la transcription. Dans l’ensemble, nos résultats ont permis de montrer que Dnmt3L, bien que dépourvue d’activité méthyltransférase, peut, tout comme les autres Dnmt, également réprimer la transcription par le biais de son interaction avec les enzymes HDAC.
Dans une deuxième partie majeure de la thèse, nous nous sommes intéressés à l’étude des mécanismes par lesquels la méthylation de l’ADN peut être ciblée au sein du génome. Cette thématique bien que fondamentale, est encore peu connue à l’heure actuelle.
Des études très récentes, réalisées dans notre laboratoire, suggèrent que les Dnmt peuvent être recrutées au sein de loci spécifiques suite à leur association avec des facteurs de transcription.
Dans le cadre de ma thèse, nous avons pu montrer que la méthyltransférase de l’ADN Dnmt3a interagit in vitro et in vivo avec l’oncoprotéine Myc. Nous avons également pu
l’ADN. Bien que l’oncoprotéine Myc soit surtout connue pour être un activateur de la transcription, Myc est également décrit pour réprimer la transcription de certains gènes spécifiques. Il était donc raisonnable de proposer que Dnmt3a pourrait être recruté pour réprimer les gènes régulés négativement par Myc. En effet en testant l’activité promotrice du gène p21, un gène connu pour être réprimé par Myc, nous avons démontré que Dnmt3a agit comme un co-répresseur transcriptionnel de Myc. Par des essais d’immunoprécipitation de la chromatine (ChIP), nous avons démontré que Myc et Dnmt3a forment un complexe stable sur le promoteur du gène p21. D’autre part nous avons montré que la 5 azacytidine, un agent déméthylant, lève la répression médiée par Myc au sein du promoteur du gène p21.
En collaboration avec d’autres laboratoires, nous avons également effectué du séquençage au bisulfite du promoteur proximal de ce gène à partir d’ADN provenant de cellules sauvages pour Myc (myc+/+) ou invalidées pour Myc (myc-/-), montrant que la méthylation de ce promoteur est dépendante de la présence de Myc. Ainsi il semble que l’activité méthyltransférase de l’ADN de Dnmt3a soit requise pour sa fonction de co-répresseur des gènes régulés négativement par Myc.
Cette étude confirme et valide le nouveau concept du recrutement des Dnmt par des interactions protéine-protéine. Notre travail a également des implications sur la compréhension du rôle de la méthylation de l’ADN dans la tumorigenèse. De plus, cette étude a permis de montrer pour la première fois que l’oncoprotéine Myc n’est pas seulement impliquée dans une répression génique passive (séquestration de co-activateurs) mais également une répression active (recrutement du co-represseur Dnmt3a).
Préambule Préambule
Au cours de cette thèse de doctorat, nous nous sommes principalement intéressés à la méthylation de l’ADN et à son implication dans le contrôle épigénétique de la transcription.
La thèse s’articule autour de cinq parties :
La première partie comprend une introduction qui se divise en deux chapitres. Le thème de l’épigénétique est abordé dans le premier chapitre. Après un bref rappel des notions de base sur la chromatine et sur l’épigénétique, nous allons décrire le remodelage de la chromatine par des complexes ATP-dépendants et les modifications post-traductionnelles des histones. Ensuite nous allons nous focaliser sur la méthylation de l’ADN pour décrire aussi bien ses fonctions biologiques que les enzymes impliquées ainsi que les caractéristiques majeures de cette modification épigénétique qui nous a plus particulièrement intéressée. Dans le deuxième chapitre de l’introduction, nous allons illustrer le rôle et les caractéristiques des deux facteurs de transcription Myc et Miz, qui se sont révélés être impliqués dans le contrôle de la transcription par la méthylation de l’ADN.
La deuxième partie comprend une brève description des buts de ce travail. Ensuite, les résultats obtenus sont exposés dans la troisième partie et sont subdivisés en deux chapitres, correspondant aux deux articles majeurs de notre thèse. Le premier article porte sur la méthyltransférase de l’ADN Dnmt3L. nous tenons à mentionner que ce travail a principalement été celui de Rachel Deplus, étudiante en thèse de doctorat au laboratoire.
Toutefois nous avons contribué de manière importante et significative à ce travail (Rachel Deplus est ainsi première auteur de l’article portant sur Dnmt3L alors que nous y sommes deuxième auteur). Le deuxième article porte sur le ciblage des Dnmt, et en particulier sur le recrutement de Dnmt3a par les facteurs de transcription Myc et Miz-1. Cette étude a représenté le travail principal de notre thèse de doctorat concernant la méthylation de l’ADN.
La quatrième partie comprend la discussion et les perspectives des résultats obtenus et de notre travail en général.
Enfin, dans une partie annexe sont présentés les articles auxquels nous avons collaboré et qui sont en dehors de la thématique principale de la thèse, à savoir la méthylation de l’ADN.
