II. Matériel et méthodes 2.1. Matériel
2.1.1. Matériel végétal
Une quantité de 2000 kg de la partie aérienne de Pituranthos chloranthus (Figure 13), espèce végétale est prélevé des parcours d’Oued Laadira (Oued El Haimeur) et d’Oued Nimel appartenant à la région de Ghardaïa (Figures 14) durant la période entre Décembre 2010 et Avril 2011. Toute la quantité végétale est séchée à l’air libre à l’abri de la lumière et à température ambiante pendant quelques jours puis broyée et conditionnée dans des sacs de papier jusqu'à leur utilisation.
Figure 13 : Pituranthos chloranthus, Mars 2012 en Oued Nimel (Photo originale) 2.1.2. Matériel animal
Le matériel animal est constitué du lait collecté de chamelles vivant en système intensif d’une population locale, au niveau de deux fermes privées appartenant à deux éleveurs BAZINE Kacem et OULED BRAHIM Brahim.
Figure 14 : Carte topographique représentative de la région d’Oued Laadira (Oued El Haimeur) et d’Oued Nimel (Source : Institut National de Cartographie et de Télédétection)
2.1.3. Appareillage
2.1.3.1. Appareillage utilisé au laboratoire de l’institut national spécialisé de la formation professionnelle Mohamed Cherif Msaadia-Ghardaïa
- Centrifugeuse max. 12 000×g (SIGMA, France).
- Centrifugeuse butyromètre (Gerber, Allemagne).
- Lactodensimètre (Gerber, Allemagne).
- pH mètre (HANNA Instrument, Romania).
- Spectrophotomètre UV-Visible (SCHIMADZU, Japon).
- Etuve (Memmert GmbH, Allemagne).
- Dessiccateur (Memmert GmbH, Allemagne).
- Balance analytique sensible (Denver Instrument, Allemagne).
- Appareil LACTOSTAR (Funke Gerber, Allemagne).
- Bain- Marie (MEMMERT, Allemagne).
2.1.3.2. Appareillage utilisé au Laboratoire de Microbiologie du Centre Algérien du Contrôle de la qualité et de l'emballage (C.A.C.Q.E) de Ghardaïa
- Autoclave (SANOCLAV, France).
- Compteur de colonies (STUART SCIENTIFIC, UK).
- Homogénéisateur des tubes à essai (MS1 Minishaker, USA).
- Agitateurs magnétiques de paillasse, chauffants et non chauffants (YELLOWLINE, Allemagne).
- Etuves bactériologiques (MEMMERT, Allemagne).
- Microscope optique (Hund WETZLAR/C300).
- pH mètre (MP 220 METTLER TOLEDO, UK).
- Bain- Marie (GRANT W22, Allemagne).
- Hotte à flux laminaire à UV (ASTEC HLF).
- Distillateur (SCHOTT, Allemagne).
2.1.3.3. Petit matériel
Un certain nombre d’accessoires et petit matériel spécifique est utilisé dans le cadre de cette étude : Micropipettes, gants et masques pour manipulation des produits dangereux, laine de verre et différents types de verrerie (béchers, fioles jaugées, fiole à vide, pipettes graduées, tubes à essais, burette…).
2.1.4. Produits chimiques
- Solvants : acide sulfurique, alcool isoamylique, éthanol.
- Sels et tampons : solution de pH étalon, soude, phénolphtaléine, carbonate de sodium anhydre, sulfate de cuivre, tartrate double de sodium et de potassium.
- Colorants et réactifs spécifiques : Bleu de Méthylène, violet de Gentiane, Lugol, réactif de Folin-Ciocalteu, réactif de Fuchsine, Sérum albumine bovine (ASB) (SIGMA ; USA).
2.2. Méthodes
2.2.1 Collecte de lait de chamelle
Les échantillons de lait sont collectés à partir de 16 chamelles appartenant à un troupeau de dromadaires implanté dans la région de Ghardaïa, durant une période de lactation située entre le 6ème et le 9ème mois. Ces chamelles sont élevées en système intensif. Elles appartiennent à deux éleveurs situés à distance de 5 km entre eux. Il n’a pas été détecté de signe clinique de mammite selon le vétérinaire conventionner avec les éleveurs. L’ensemble des animaux est divisé en quatre groupes. Chaque groupe comprend quatre chamelles:
• Le premier groupe témoin (A0) (contrôlée ou sous surveillance) : les chamelles reçoivent une alimentation ordinaire dépourvue de la plante cible (100% de concentré).
• Le deuxième groupe (A10) reçoit un aliment ordinaire contenant 10% de la plante cible.
• Le troisième groupe (A25) reçoit un aliment ordinaire contenant 25% de la plante cible.
• Le quatrième groupe (A50) reçoit un aliment ordinaire contenant 50 % de la plante cible.
La quantité d’alimentation journalière consommée par la chamelle est de 12 kg/j.
L’ensemble des douze chamelles, témoins non incluses, subissent une période d’adaptation par la plante cible pendant 14 jours avant de faire les traitements ci-dessus (DEREJE et UDEN, 2005). L’expérimentation a démarré en même temps, c'est-à-dire dans la même période ; entre juin et aout 2011.
Après une période de 21 jours d’élevage par ce régime alimentaire (DEREJE et UDEN, 2005), on collecte les échantillons du lait. La traite se fait d’une façon traditionnelle, c’est-à-dire manuellement. Au moment de prélèvement des échantillons de lait, la chamelle est d’abord tétée par son chamelon afin de stimuler la descente du lait, ensuite, le chamelon est écarté. Pour chaque échantillon, une quantité entre un demi-litre et un litre est prélevé dans des flacons stériles après avoir nettoyé le pis de la chamelle avec une compresse à usage unique imbibée d’eau distillée, les premiers jets de lait sont éliminés (TOURETTE, 2002).
Les flacons sont placés immédiatement dans une glacière contenant des blocs réfrigérants et transportés vers le laboratoire pour l’analyse. La durée de transport ne dépasse pas 3 heures.
Afin de tenir compte des conditions réelles de terrain, aucun conservateur n’a été rajouté.
2.2.2. Analyses physicochimiques et biochimiques 2.2.2.1. Analyses physicochimiques
2.2.2.1.1. Détermination du pH
La valeur du pH est mesuré à +22°C à l’aide d’un pH mètre, étalonné par une solution de pH étalon (solution de pH connue). La valeur du pH est lue directement après immersion de son électrode dans l’échantillon de lait à analyser. étalonné par une solution de pH étalon.
2.2.2.1.2. Dosage de l'Acidité Dornic
Le dosage de l'Acidité Dornic est réalisé avec une solution d'Hydroxyde de Sodium N/9 en présence de Phénolphtaleine (VIGNOLA, 2002) (Annexe 01).
2.2.2.1.3. Détermination de la Densité
La Densité est déterminée à l'aide d’un Lactodensimètre.
2.2.2.1.4. Détermination de Point de Congélation
Le Point de Congélation est déterminé automatiquement par l’appareil de LACTOSTAR emploi un système infra-rouge compact.
2.2.2.1.5. Détermination de la Conductivité Electrique
La Conductivité Electrique est déterminée automatiquement par l’appareil de LACTOSTAR.
2.2.2.2. Analyses biochimiques
2.2.2.2.1. Détermination de la teneur en matière sèche totale (MST) et en matière sèche dégraissée (MSD)
La MST est déterminée par dessiccation à l’étuve réglée à 103 ± 2°C pendant 3 heures d’une quantité de 10 ml de lait entier. La teneur en MSD est déterminée automatiquement par l’appareil de LACTOSTAR.
2.2.2.2.2. Détermination de la teneur en Matière Grasse
La détermination de la teneur en MG est réalisée selon la méthode acido butyrométrique de GERBER (norme AFNOR : NFV04-210 de Décembre 1974), (Annexe 02).
2.2.2.2.3. Détermination du taux de protéines
Le taux de protéines du lait est dosé par la méthode colorimétrique de LOWRY et al., (1951), par utilisation de réactif de Folin-Ciocalteu dont l’acide phosphomolybdo-tungstique est le constituant actif qui donne naissance d’une couleur bleu foncé par une réaction d’oxydoréduction avec les groupements fonctionnels des acides aminés des protéines du lait.
Le sérum albumine bovin (BSA) est utilisé comme protéine de référence pour tracer la courbe d’étalonnage DO=f(C) (Figure 15) à une longueur d’onde de 750nm (Annexe 03).
-20 0 20 40 60 80 100
Concentration en protéines ( µg/ml) -0,02
0,00 0,02 0,04 0,06 0,08 0,10 0,12
D O à 750 nm
R² = 0,9983
y = 0,00123631631*x
Figure 15 : Courbe étalon du dosage des protéines par la méthode de LOWRY et al., (1951). L’albumine sérique bovine (BSA) est utilisée comme protéine étalon ; R=
coefficient de corrélation.
2.2.2.2.4. Détermination de la teneur en lactose
Le lactose est déterminé automatiquement par l’appareil de LACTOSTAR.
2.2.3. Analyses microbiologiques
Nous procédons dans cette étude au dénombrement des différents groupes microbiens dans les échantillons de lait collectés par les chamelles des lots expérimentaux (A0, A10, A25 et A50). Pour chaque prélèvement, un volume de 1 ml de lait est dilué dans un volume de 9 ml d’une solution de tryptone sel. On obtient ainsi une dilution mère de 10-1 à partir de laquelle on réalise des dilutions décimales jusqu’à 10-7. La solution de tryptone sel est obtenue par dissolution de 9.5g de tryptone sel en poudre dans un litre d’eau distillée. Cette solution est répartie en volumes exactes de 9 ml dans des tubes en verre, qui sont fermés puis portés à l’autoclave à 120°C/20mn. Les ensemencements ont été réalisés en double exemplaire, en boîtes de pétri. Plusieurs milieux de culture ont été utilisés. Ils varient selon leur sélectivité ou non et leur emploi est dicté par la nature des germes recherchés. Les dénombrements ont été effectués à l’aide d’un compteur de colonies. Nous n’avons tenu compte que des boites qui contiennent entre 30 et 300 colonies (PRESCOTT et al., 2002).
Les analyses macroscopiques consiste à la détermination des caractéristiques macroscopiques des différentes colonies observées (la taille, la forme, la couleur, l’odeur, le contour, l'aspect …), et il est procédé au test de la catalase et de l’oxydase.
Les analyses microscopiques consistent à la détermination à l’aide d’un microscope photonique, si les germes ciblés portent ou pas la coloration de GRAM.
Le but assigné à cette partie du travail, se concentre sur deux volets, le premier est de voir l'effet de Pituranthos chloranthus sur la flore indigène et exogène du lait de chamelle. Le second, est de voir la qualité microbienne du lait de chamelle de cette population locale.
Les levures et les moisissures n'ont pas fait l'objet de la présente étude.
2.2.3.1. Temps de réduction du bleu de méthylène (TRBM)
Le TRBM permet d’estimer la charge microbienne du lait frais. La rapidité de cette décoloration est directement proportionnelle au nombre de germes présents (LARPENT et al., 1997). Une quantité de 10 ml de lait est versé dans un tube en verre auquel on ajoute 1 ml de la solution de bleu de méthylène. Le tube est mis au bain-marie à 37°C, il est homogénéisé par simple retournement chaque demi-heure. Le temps au bout duquel la coloration bleue de
la solution a disparu est soigneusement noté : c’est le temps de réduction du bleu de méthylène (BONNEFOY et al., 2002).
2.2.3.2. Dénombrement de la flore aérobie mésophile totale (FAMT)
L’ensemencement se fait dans la masse sur milieu Plate Count Agar (PCA) (LEYRAL et VIERLING, 2007) (Annexe 04), incubée à l’étuve à 30°C pendant 24 à 48 heures. Le dénombrement de la FAMT est un bon indicateur de la contamination globale du lait (BOURGEOIS, 1980).
2.2.3.3. Dénombrement des Coliformes
Les coliformes sont recherchés sur gélose au cristal violet, au rouge neutre et à la bile VRBL (Violet Red Bile Agar) (MARCHAL et al., 1987) (Annexes 04). L’ensemencement est effectué en profondeur en doubles couches et les cultures sont ensuite incubées à 34°C pour les coliformes totaux et à 44°C pour les coliformes thermotolérants pendant 24 à 48 heures (CORRY et al., 2003). Le dénombrement des coliformes dans le lait permet de mettre en évidence une contamination fécale (et donc la présence possible d’Entérobactéries pathogènes comme les salmonelles, Yersinia, E.coli, etc.) (TOURETTE, 2002).
2.2.3.4. Dénombrement des Entérobactéries
Les entérobactéries sont recherchées sur gélose glucosée biliée au cristal violet et au rouge neutre VRBG (BRANGER et al., 2007) (Annexes 04). L’ensemencement est effectué en profondeur et les cultures sont ensuite incubées à 37°C, pendant 24 à 48 heures (CORRY et al., 2003).
2.2.3.5. Recherche de Staphylococcus aureus
Les Staphylocoques sont identifiés sur le milieu de Baird-Parker additionnée au jaune d’œuf et au tellurite de potassium (MARCHAL et al., 1987) (Annexe 04).
L’ensemencement se fait en surface par étalement de 0.1 ml d’inoculum. L’incubation est réalisée à 37°C pendant 24 à 48 heures. Le milieu de Baird-Parker est souvent plus favorable à la croissance, la sélection et la différentiation des Staphylocoques, à partir des produits alimentaires.
Les Staphylococcus aureus sont identifiés par le halo d’éclaircissement entourant leurs colonies (noires) et résultant de l’hydrolyse des lipoprotéines du jaune d’œuf (MARCHAL et al, 1987).
2.2.3.6. Pré-identification des Streptococcus ssp
La gélose Bile-Esculine (BEA) est destinée à l’isolement sélectif et à la différentiation des Streptococcus ssp (streptocoques fécaux), qui prolifèrent normalement et donnent des colonies noires caractéristiques (MARCHAL et al., 1987) (Annexe 04).
L’ensemencement se fait en surface par étalement de 0.1 ml d’inoculum. L’incubation est réalisée à 37°C pendant 24 à 48 heures (BONNEFOY et al., 2002).
2.2.3.7. Dénombrement des Clostridium sulfito-réducteur
Les Clostridium sulfito-réducteur sont dénombrés sur le milieu viande-foie sulfité (VF) en tube, pour favoriser les conditions d’anaérobiose, avec un traitement thermique de 10 min à 80°C afin de détruire les formes végétatives et d’activer les spores des clostridies : elles peuvent persister sous forme latente dans le lait, germer dès que les conditions sont favorables et sécréter des substances toxiques (BONNEFOY et al., 2002) (Annexe 04).
2.2.3.8. Dénombrement des bactéries lactiques
Les lactobacillus sont dénombrés sur un milieu sélectif, c’est le milieu de Man, Rogosa et Sharpe (MRS) (MARCHAL et al., 1987) L’ensemencement se fait en profondeur et l'incubation à lieu à 30°C, pendant 48h (DWORKIN et al., 2006) (Annexe 04).
Le dénombrement des lactocoques se fait sur milieu M17. L'ensemencement est réalisé en profondeur en doubles couches. L'incubation est réalisée à 30°C pendant 48 heures pour les bactéries lactiques mésophiles et à 45°C pendant 48 heures pour les bactéries lactiques thermophiles (HASSOUNA et MASRAR, 1995 ; DOWNES et ITO, 2001).
2.2.4. Analyses statistiques
Les résultats obtenus par la présente étude sont analysés statistiquement par utilisation de logiciel STATISTICA 6 version 2003, dont le but est de voir l’effet de l’alimentation par Pituranthos chloranthu sur les différents paramètres physicochimiques et microbiologiques du lait de chamelle par utilisation de test ANOVA d’un seul facteur et le test de X2.
