1.1 Origine des Rats

MATERIEL ET METHODES

1. Protocoles généraux

1.1 Origine des Rats

Deux lignées de rats ont été utilisées pour réaliser ce travail. La lignée SPRD-Cu3 qui est une lignée consanguine dérivée de la lignée non consanguine SPRD (Greenhouse et al, 1990) et la lignée WKY/E56 (WKY), ont été obtenues de la Medizinische Hochschule Hannover, Institut für Versuchstierkunde und Zentrales Tierlaboratorium (Hanovre, RFA).

1.2 Induction de tumeurs mammaires : traitement au DMBA

Une seule dose intargastrique de DMBA a été administrée à des rats femelles vierges âgés de 54 à 56 jours par gavage oral, à raison de 65 mg/Kg (masse corporelle de l’animal) (Gould et al, 1986, Hugins et al, 1981). Le DMBA (Sigma-Aldrich) a été dissout dans de l’huile de sésame (Sigma-Aldrich) chauffée au bain marie à 100°C. La préparation a été laissée à température ambiante afin qu’elle refroidisse avant d’être administrée aux rats.

1.3 Extraction d’ADN génomique

Trois méthodes d’extraction d’ADN génomique ont été utilisées lors de ce travail.

1.3.1 Phénol-Chloroforme

Cette méthode est une méthode classique d’extraction d’ADN. Un traitement à la RNase précède les différentes étapes d’extraction d’ADN et permet de débarrasser l’échantillon des molécules d’ARN contaminantes.

Protocole

- Prélever environ 20mg de tissu d’intérêt et ajouter 750 µl d'une solution (100 mM Tris-HC1 pH 8.5, 5 mM EDTA, 0.2% SDS, 200 mM NaC1, 100 µg/ml Protéinase K) - Vortexer brièvement et incuber pendant une nuit à 55°C

- Ajouter 1,5 µl de solution de RNAse A (4mg/ml) et inverser le tube 25 fois - Incuber à 37°C pendant 15 à 60 minutes

- Centrifuger les débris 5 minutes à 14000 rpm

- Récupérer le surnageant et réaliser deux extractions successives au phénol/

chloroforme/ alcool isoamylique (25 :24 :1)

- Précipiter l'ADN par addition de 750 µl d'isopropanol - Centrifuger et laver le culot dans 500 µl d'éthanol 70%

- Centrifuger et resuspendre l'ADN dans 100 µl de Tris EDTA

1.3.2 « AquaPure Genomic DNA Isolation Kit » de BioRad (Cat. Num.: 732-6343) Le principe de cette méthode est le suivant : après digestion du tissu d’intérêt, les cellules sont lysées par adjonction d’un détergent anionique en présence d’un inhibiteur de DNases. Ensuite, un traitement à la RNase permet de débarrasser l’échantillon des molécules d’ARN contaminantes. Pour finir deux étapes de précipitations sont effectuées. La première permet de précipiter les agents contaminants dont les protéines, contenus dans l’échantillon et de récupérer l’ADN génomique présent dans le surnageant. Celui-ci est précipité lors de la deuxième étape et resuspendu dans une solution de conservation.

Protocole

- Prélever 5 à 10 mg de tissu dont on veut extraire l’ADN puis ajouter 300 µl de Solution de Lyse et 20 µl d'une solution de Protéinase K (20mg/ml).

- Vortexer brièvement et incuber pendant une nuit à 55°C jusqu'à digestion complète du tissu

- Ajouter 1,5 µl de solution de RNAse A (4mg/ml) et inverser le tube 25 fois - Incuber à 37°C pendant 15 à 60 minutes

- Ajouter 100 µl de solution de précipitation de protéines et vortexer - Centrifuger à 14000 x g pendant 3 minutes

- Récupérer le surnageant contenant l'ADN puis ajouter 300 µl d’isopropanol 100% et mélanger en inversant le tube 50 fois

- Centrifuger à 14000 x g pendant 1 minute et jeter le surnageant - Laver le culot 2 fois avec 500 µl d'éthanol 70%

- Sécher le culot au dessiccateur

- Resuspendre le culot dans 100 µl de solution d'hydratation

1.3.3 « GenElute™ Mammalian Genomic DNA Purification Kit » de Sigma-Aldrich (Cat. Num.:G1N350)

Cette méthode d’extraction d’ADN génomique est basée sur un principe de rétention

des molécules d’ADN sur une membrane silicatée contenue dans une colonne à

microcentrifugeuse. Les cellules sont d’abord lysées par une solution saline qui assure la

dénaturation des macromolécules. Ensuite la préparation est passée sur une colonne de filtration. Après une étape de lavage qui permet de débarrasser l’échantillon des contaminants, l’ADN est récupéré par élution dans une solution de Tris-EDTA.

Protocole

- Prélever environ 10 mg de l'organe dont on veut extraire l'ADN puis ajouter 180 µl de solution de lyse T et 20 µl de sol de Protéinase K

- Vortexer brièvement et incuber pendant une nuit à 55°C jusqu'à digestion complète du tissu

- Ajouter 200 µl de Solution de Lyse C et vortexer - Ajouter 200 µl d'éthanol et vortexer

- Préparer les colonnes de filtration en ajoutant 500 µl de solution de préparation et centrifuger 1 minute à 12.000 x g

- Transférer le lysat dans une colonne et centrifuger à 6500 x g pendant 1 minute

- Laver par deux fois avec 500 µl de solution de lavage en centrifugeant pendant 2 minutes à 13000 x g après chaque lavage

- Eluer l'ADN en appliquant 200 µl de solution d'élution (10mM Tris-Hcl, 0,5 mM EDTA, pH 9.0) et en centrifugeant à 6500 x g pendant 1 minute.

1.4 Analyse des marqueurs microsatellites 1.4.1. Amplification des marqueurs microsatellites

Les PCR ont été effectuées sur l’ADN génomique préalablement dilué à 10 µg/ml en utilisant des amorces spécifiques pour chaque marqueur microsatellite étudié. L'amorce sens de chaque marqueur contenait un fluorochrome (Hex ou FAM) à l’extrémité 3'. Les oligonucléotides ont été obtenus d'Eurogentec (Seraing) et leurs séquences ont pour la plupart été obtenues via la base de données RGD (Rat Genome Database): http://rgd.mcw.edu.

Les réactions PCR ont été effectuées dans un volume final de 50 µl qui contient 100 ng d'ADN génomique, 0,5 µM de chaque amorce, 500 µM de dNTPs, 1U de Taq polymérase, du tampon réactionnel (60nM Tris-HCL, 15nM (NH4)SO4, 3,5nM MgCl2, pH 8.5) et de l’eau distillée.

Le programme PCR suivant a été utilisé en routine : dénaturation initiale à 94°C pendant 3

minutes suivi des 35 cycles de 94°C pendant 30 secondes, X°C pendant 30 secondes, 72°C

pendant 1 minute et finalement une extension finale à 72°C pendant 3 min. X désigne la

température d'hybridation des amorces utilisées, celle-ci dépend de la séquence des amorces.

1.4.2. GeneScan (Applied Biosystems)

1 µl de chaque produit PCR a été déposé sur plaque 96 puits en présence de 9 µl de Hidi formamide (Applied Biosystems). Les échantillons ont été analysés par électrophorèse capillaire en utilisant un séquenceur automatique à capillaires 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems) qui permet la séparation et la détection de produits PCR fluorochromés.

Les données brutes ont été analysées en ayant recours aux logiciels GeneScan et Genotyper (Applied Biosystems) ou plus récemment GeneMapper (Applied Biosystems).

1.4.3. Gel d'acrylamide

Il existe des marqueurs pour lesquels nous ne disposions pas d’amorces sens fluorochromées, dans ce cas nous avons effectué les PRC avec des amorces classiques et déposé les produis PCR sur gel d’acrylamide non dénaturants. La concentration en acrylamide et la taille des gels utilisés ont été déterminées selon la longueur des fragments amplifiés et le degré de polymorphisme des marqueurs d’intérêt. Après migration, les gels ont été colorés au SYBR Green Nucleic Acid Gel Stain (Roche, Cat. Num : 11988131001) et visualisés par exposition à la lumière U.V. en utilisant l'Image Master VDS system (Amersham Biosciences).

2. Analyse de perte d’hétérozygotie

2.1 Génération de tumeurs

Des rats SPRD-Cu3 ont été croisés avec des rats WKY afin d’obtenir des animaux F1 (Hétérozygotes pour tous les marqueurs polymorphes). Les femelles F1 ont été traitées par administration d’une seule dose de DMBA par gavage oral à l’âge de 55 jours. Les animaux ont été euthanasiés au CO2 à la troisième semaine après apparition de la première tumeur et disséqués afin de prélever un échantillon de foie et un échantillon de chaque tumeur formée (1 à 5). Les échantillons de tissus ont été plongés quelques secondes dans l’azote liquide et conservés à -20°C jusqu’à extraction de l’ADN.

L’ADN génomique a été isolé à partir d’environ 20 mg de tissu à analyser en ayant recours à la méthode d’extraction au phénol-chlorophorme décrite précédemment.

2.2 Deux techniques d’analyse de perte d’hétérozygotie

2.2.1 Méthode « GeneScan » : PCR de marqueurs microsatellites

Les marqueurs ont été sélectionnés sur base de leur localisation disponibles dans les bases de données RGD (Rat Genome Database): http://rgd.mcw.edu et Ensembl Genome Browser : http://www.esembl.org/index.html.

Table 15 : Liste des marqueurs analysés pour des éventuelles pertes d’hétérozygotie Chromosome

RNO

Marqueur

RNO1 D1Rat245, D1Rat246, D1Rat327, D1Rat1, D1Rat4, D1Rat252, D1Rat15, D1Rat20, D1Rat93, D1Arb33, D1Rat260, D1Arb36, D1Rat410

RNO1 D1Rat324, D1Rat306, D1Rat81, D1Rat88

RNO2 D2Mit29, D2Uwm15, D2Got2, D2Rat6, D2Got14, D2Rat38, D2Rat307, D2Rat4, D2Rat14

RNO5 D5Rat124, D5Rat209, D5Rat190, D5Rat130, D5Rat2, D5Rat100, D5Rat92, D5Rat196, D5Rat26, D5Rat39

RNO9 D9Rat41, D9Rat139, D9Rat158

RNO10 D10Rat47, D10Rat71, D10Rat116, D10Rat19, D10Rat97, D10Rat203

RNO18 D18Rat102, D18Rat55, D18Wox16, D18Rat89, D18Wox6, D18Rat11, D18Rat45, D18Rat44, D18Wox13

Les PCR ont été effectuées sur l’ADN génomique selon le protocole « GeneScan » décrit précédemment. Ensuite, les échantillons ont été analysés par électrophorèse capillaire en utilisant un séquenceur automatique à capillaires 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems) qui permet la séparation et la détection de produits PCR fluorochromés. Nous avons ensuite traité les données issues de ces analyses grâce au programme de génotypage Genotyper (Applied Biosystems) et ainsi pu comparé les rapports allèliques dans le tissu sain et dans la tumeur pour chaque marqueur dans toutes les paires d’échantillons. Notons que les paires d’échantillons Foie/Tumeur ont été traitées simultanément de l’extraction à l’électrophorèse afin d’éviter des biais d’analyse.

2.2.2 Séquençage et détection des SNP (Single Nucleotide Polymorphism)

Les réactions PCR ont été réalisées grâce à l’utilisation du kit « Expand High Fidelity PCR System » (Cat. Num. 1732640. Roche). Les amorces ont été obtenues chez Sigma- Aldrich.

-Séquence (5’-3’) des paires d’amorces utilisées pour l’analyse du marqueur D1Rat1 : (1) GAGAAAAACACAGCAAAGGAC / TATGATTGACCTACTCCTGC. (2) ACCCAATGAAGTTTAGGCAAG / TACCGAGTCAATGTGTCTTCT. (3) GGCACAGATGAAGACAGAAC / GTCCATCACCTTAGTCAATA.

-Séquence (5’-3’) des paires d’amorces utilisées pour l’analyse du marqueur D5Rat190 : (1)

CGAAAGGCAACGACAATGATA / TGGCACAGGCTTCAAATCC. (2) GAACCTCTAAACCGTAAGCC / CCTGTCCAAACCAACTCAAG. (3) TAACCACCTAACCATCTGCC / CATTCTTTGTTTTGCGTTTGTA . (4) TTTCCTTCCTGTCTGCCTC / ACGAATACAGGCAGGGAAAG.

Les produits PCR à séquencer ont été séparés sur gels d’agarose 1.25%. Les bandes contenant les produits d’intérêt ont été récupérées et les produits PCR ont été purifiés sur colonne en utilisant le kit « DNA Gel Extraction » (Cat. Num. LSKG EL050. Millipore). Les réactions de séquence ont été effectuées grâce à l’utilisation du kit « BigDye Terminator V3.1 Cycle Sequencing V2» (Cat. Num. 4337456. Applied Biosystems). Les séquences ont été réalisées par la société BioVallée. Les séquences ont ensuite été analysées grâce à l’utilisation de la suite de logiciel Vector NTI 9.0 (Invitrogen).

2.2.3 Pyroséquençage PSQ 96MA Systems (Biotage)

La technique de pyroséquençage est une technique de séquençage de courtes régions d’ADN (environ 50 pb). Au cours de la réaction de séquence, une cascade enzymatique abouti à la formation de lumière visible lorsqu’un nucléotide est incorporé. Il est donc possible de quantifier l’incorporation des nucléotides et ainsi de réaliser un analyse quantitative des séquences produites. Cette technique est utilisée dans le cadre de la recherche de SNP (Single Nucleotide Polymorphism), de génotypage d’échantillons et grâce à ses propriétés quantitatives, dans la recherche de perte d’hétérozygotie. Le principe de la technique de pyroséquençage est détaillé dans la Figure 18. Les SNP qui ont servi à la quantification des allèles ont été nommés SNP-D1Rat1 et SNP-D5Rat19, leur position est reprise dans l’Annexe3. Ces SNP ont été détectés lors de la mise au point de la méthode de discrimination allèlique décrite ci-dessus.

2.2.3.1 Réaction PCR

Les réactions PCR ont été réalisées grâce à l’utilisation de kit « FastStart High Fidelity PCR system » (Cat. Num. 03553426001. Roche). Deux particularités sont à mentionner : pour chaque réaction, une des deux amorces était biotinilée et le nombre de cycle a été suffisant pour consommer toutes les amorces. Les amorces ont été obtenues chez Sigma- Aldrich. La séquence des amorces utilisées est reprise dans l’Annexe 3.

-Séquence (5’-3’) des amorces utilisées pour l’analyse du marqueur D1Rat1 :

D1Rat1.r.biotin (TGGAGGCCAGCATGAGCTATAA)

D1Rat1.f (ATTGTGCAAATCAACTGGTCTGAA).

-Séquence (5’-3’) des amorces utilisées pour l’analyse du marqueur D5Rat190 : D5Rat190.r.biotin (TTGCGTTTGTATATGTGCAGGTC)

D5Rat190.f (TTTGGTCACACGCTTGTTTAATA).

2.2.3.2 Immobilisation des brins biotinilés

L’immobilisation du brin biotinilé a été effectuée grâce à l’utilisation du kit « Pyro Gold Reagents PSQ 96 MA » (Biotage). Elle s’effectue à l’aide de billes de sépharose couplées à la streptavidine (Strepatavidin Sepharose HP, Amersham Biosciences). Le mélange du produit PCR avec les billes se fait sur plaque 96 puits. Tous les puits de la plaque sont aspirés à l’aide du Vacuum Prep Tool (Biotage). Les produits sont d’abord lavés à l’éthanol 70% ensuite avec une solution nettoyante. Après dénaturation des brins grâce à l’utilisation d’une solution de NaOH dénaturante, seuls les brins biotinilés couplés aux billes restent sur les filtres. Les brins biotinilés sont resuspendus dans une solution tampon en présence de l’amorce de séquence puis suit une étape d’hybridation à 80°C.

2.2.3.3 La réaction de pyroséquence

Les réactions de séquence ont été réalisées sur le pyroséquenceur PSQ 96MA Systems (Biotage) grâce à l’utilisation du kit « Pyro Gold Reagents PSQ 96 MA » (Biotage) qui comprend les enzymes, les substrats et les nucléotides nécessaires à la réaction. Les amorces ont été obtenues chez Sigma-Aldrich. Les séquences des amorces de séquence utilisées sont reprises dans l’Annexe 3.

-Séquence (5’-3’) des amorces de séquence utilisées pour l’analyse du marqueur D1Rat1 : D1Rat1.pyro (CCTCAAATATTGGAAGATTA).

-Séquence (5’-3’) des amorces de séquence utilisées pour l’analyse du marqueur D5Rat190 : D5Rat190.pyro (CCACAGTTTGACAGGAAA).

Les données ont été analysées avec le logiciel : Pyro Q-CpG software (Biotage).

3. Caractérisation phénotypique

3.1 Génération des lignées congéniques, sous-congéniques et de la lignée double- congénique

Des femelles SPRD-Cu3 on été croisées avec des mâles WKY/E56 afin de produire la

génération F1. Les mâles F1 ont ensuite été croisés en retour avec des femelles SPRD-Cu3 (production de la génération N2). Pour chacune des lignées congéniques, nous avons sélectionné les animaux hétérozygotes au locus d’intérêt avant de les croiser à nouveau avec des rats SPRD-Cu3 (9 croisements en retour ont été effectués). A chaque génération à partir de la génération N2, nous avons génotypé les animaux par PCR au niveau des marqueurs microsatellites polymorphes entre les deux lignées parentales localisés dans le locus d’intérêt.

La liste des marqueurs utilisés est reprise dans la Table 16. Les animaux de la génération N9 ont été accouplés (accouplement frère –sœur) et leurs descendants ont été génotypés et sélectionnés pour l’homozygotie WKY/E56 au locus différentiel. Lorsque les lignées congéniques ont été établies, les animaux ont été génotypés au niveau d’une série de marqueurs situés dans les autres QTLs identifiés et il a été vérifié qu’ils présentaient ces marqueurs à l’état homozygote SPRD-Cu3. La liste de ces marqueurs est reprise dans la Table 17.

Il existe une lignée congénique pour laquelle nous avons généré des lignées sous- congéniques, pour ce faire nous avons sélectionné à partir de la génération N7 (animaux issus du sixième croisement en retour) les animaux possédant uniquement les marqueurs contenus dans une des deux sous-régions du QTL Mcstm1 à l’état hétérozygote, respectivement C5.A bordée pas les marqueurs D5Mgh2 (17.5 Mb) et D5Rat82 (45.8 Mb) et C5.B bordée par les marqueurs D5Rat230 (82.8 Mb) et D5Rat39 (153 Mb). Chacune des lignées sous-congéniques a ensuite été obtenue par croisement des animaux de la génération N9 entre eux et sélection des animaux possédant l’homozygotie dans la région d’intérêt.

Enfin, la lignée double congénique a été générée par croisement entre rats des deux lignées d’intérêt afin de produire la génération F1. Les animaux F1 ont ensuite été croisés entre eux pour produire la génération F2. A partir de la génération F2, les animaux ont été génotypés au niveau des marqueurs des deux régions d’intérêt. Les animaux présentant le plus grand nombre de marqueurs à l’état homozygote WKY/E56 ont été retenus pour parents de la génération suivante. Les rats double congéniques (homozygotes pour tous les marqueurs internes aux deux régions) ont été obtenus à la génération F4.

3.2 Génotypage

L'ADN génomique a été isolé à partir de morceaux de queue de rats âgés d’environ 25

jours en utilisant l'une de méthodes décrites ci-dessus. Les réactions de PCR des marqueurs

microsatellites ont été effectuées et analysées comme décrites précédemment.

Table 17 : Liste des marqueurs microsatellites polymorphes (entre SPRD-Cu3 et WKY/E56) utilisés lors de la vérification de l’homozygotie SPRD-Cu3 des animaux congéniques au niveau des QTLs ne définissant pas la lignée en question.

Chromosome RNO

Marqueurs microsatellites

RNO1 D1Rat15, D1Rat260, D1Rat177, D1Rat338, D1Rat114, D1Rat324, D1Rat306, D1Rat81, RNO2 D2Rat4, D2Mit29, D2Rat6, D2Got14

RNO5 D5Rat138, D5Rat26, D5Rat39 RNO9 D9Rat41, D9Rat139, D9Rat158

RNO10 D10Rat47, D10Rat116, D10Rat19, D10Rat97 RNO18 D18Rat55, D18Rat89, D18Wox16

3.3 Carcinogenèse et phénotypes

Pour chaque lignée, un panel de rats femelles a été traité au DMBA à l’âge de 54 à 56 jours selon le protocole décrit précédemment. Les femelles traitées ont été palpées de manière hebdomadaire pendant 19 semaines après traitement. La date d’apparition de la première tumeur a été répertoriée pour chaque animal. Ces données ont permis de calculer la latence tumorale de chaque animal. Chaque semaine, le nombre de tumeurs formées par animal a été compté (taille minimum détectable est 2 X 2 mm) ce qui nous a permis de calculer la multiplicité tumorale pour chaque animal. La multiplicité tumorale a été définie comme le nombre de tumeurs formées par animal, 19 semaines après traitement (semaine à laquelle les animaux ont été euthanasiés au CO2). Tout au long de l’expérience, le diamètre de chacune d’elles a été mesuré et répertorié. Ces données ont permis de calculer la vitesse de croissance tumorale de chaque tumeur. La vitesse de croissance tumorale a été définie comme le changement moyen du diamètre tumoral par semaine calculé sur les 3 à 4 premières semaines de développement. La tumeur présentant la vitesse de croissance la plus rapide chez chaque animal a été sélectionnée pour calculer la vitesse de croissance moyenne des tumeurs les plus rapides dans une lignée (aussi appelée agressivité tumorale). Pour la lignée SPRD-Cu3, nous avons également calculé la vitesse de croissance moyenne des tumeurs les plus lentes en sélectionnant dans ce cas, chez chaque animal, la tumeur présentant la vitesse de croissance moyenne la plus basse.

3.4 Analyse statistique

Les analyses statistiques des données phénotypiques ont été effectuées grâce à

l’utilisation du logiciel SigmaStat 3.0 (Systat Software, Erkrath, RFA). Les données sont

exprimées en terme de moyenne ± l’erreur standard (SE). Les groupes de populations ont été

comparés en utilisant la fonction « Pairwise Comparison » du logiciel. Cette fonction permet

de soumettre des populations présentant une distribution normale à un test t, si l’une des (ou les deux) populations de données ne présente pas une distribution normale, ce logiciel effectue un test de la somme des rangs de Mann-Whitney.

3.5 Contributions

La génération et la caractérisation des lignées congéniques ont été réalisées en collaboration avec D. Stieber. La participation au génotypage de G. Piessevaux a débuté au environ des générations N5 de la réalisation des lignées congéniques. Le travail de génotypage a alors été partagé avec D. Stieber et M. Rivière jusqu’à l’obtention des lignées congéniques. Le phénotypage des lignées C5.Mcstm1, C9.Mcstl1 et C18.Mcstm2 a été réalisé en travail d’équipe par D. Stieber et G. Piessevaux. Par la suite, le phénotypage des lignées C1p.Mcstm3, C1q.tel et C10.Mcsta1 a été réalisé par G. Piessevaux avec l’aide de P. Van Vooren. Le génotypage et la réalisation des lignées sous congéniques de RNO5 ont constitué un travail d’équipe avec D. Stieber jusqu’à la moitié de leur réalisation. Ensuite, le travail a été dirigé et réalisé par G. Piessevaux avec l’aide de M. Rivière, jusqu’à l’obtention des lignées sous congéniques. La réalisation et le phénotypage de la lignée double congénique ont été dirigés et réalisés par G. Piessevaux avec l’aide de M. Rivière et P. Van Vooren.

4. Analyse des taux d’expression de gènes

4.1 Extraction d'ARN total

L'extraction d'ARN total de tissu mammaire a été effectuée grâce à l’utilisation de la solution Tripure de Roche (Cat. Num. 1667165). L’utilisation de la solution TriPure permet de préserver l'intégrité des molécules d'ARN et d'ADN dans l'échantillon en dénaturant les nucléases endogènes pendant l’étape de lyse. L’ajout de chloroforme permet d’obtenir une solution triphasée (une phase aqueuse contenant l'ARN, une interphase et une phase organique contenant l'ADN et les protéines).

Protocole

- Après avoir euthanasié l’animal, prélever le tissu mammaire de manière standard et placer dans 3 ml de Tripure.

- Homogénéiser la solution à l’aide d’un rotor UltraTurraw T25 (Labortechnik).

- Incuber l’échantillon 5 minutes à température ambiante afin de garantir une dissociation complète des complexes nucléoprotéiques

- Ajouter 0,2 ml de chloroforme pour chaque 1ml de TriPure et vortexer.

- Incuber à température ambiante pendant 15 minutes

- Centrifuger pendant 15 minutes à 12000 x g à 4°C afin d'obtenir trois phases

- Transférer la phase supérieure (incolore) dans un nouveau tube et précipiter l'ARN de celle ci en y ajoutant 0,5ml d'isopropanol pour chaque ml de Tripure

- Inverser le tube plusieurs fois afin d'obtenir un mélange homogène et incuber à température ambiante pendant 10 minutes

- Centrifuger à 12000 x g à 4°C pendant 15 minutes et éliminer le surnageant - Laver le culot deux fois à l'éthanol 75%

- Sécher le culot sous vide pendant 5 à 10 minutes

- Resuspendre le culot dans 30 à 100 µl d’une solution 1mM Sodium Citrate, pH 6,4, RNAse free : « The RNA Storage Solution » (Ambion Cat. Num. 7001)

4.2 Analyse de la qualité d'ARN

Etant donné l’omniprésence des RNases et l’instabilité des molécules d’ARN, la qualité et la concentration de chaque échantillon d’ARN extrait ont été déterminées. Les contrôles de qualité ont été effectués par électrophorèse sur mini gel d’agarose. Le degré d’intégrité de l’ARN présent dans un échantillon a ainsi pu être évalué. La concentration des échantillons en ARN a été déterminée grâce à l’utilisation d’un spectrophotomètre (NanoDrop ND-1000 UV-Vis).

Figure 19 : Electrophorèse sur gel d’agarose pour quatre échantillons d’ARN.

4.3 RT-PCR quantitative

La méthode de PCR quantitative permet d'étudier les taux relatif d’expression de gène dans un échantillon de tissu par quantification du nombre de copies d’ADNc de la séquence cible présente dans l’échantillon de tissu. Cette technique nécessite la rétrotranscription de l’ARN en ADNc.

4.3.1 Reverse Transcription

La rétrotranscription (RT) de l’ARN en ADNc, qui précède qRT-PCR a été effectuée

grâce à l’utilisation du Kit Superscript

III d'Invitrogen (Cat. Num. 11734-050). Ce kit utilise

une transcriptase inverse virale, celle-ci permet d’effectuer les réactions RT à partir d'ARN total. L’ADNc utilisé lors de l’étude de gènes candidats a été généré à partir d'ARN extrait de tissu mammaire selon la méthode décrite précédemment.

Protocole

La réaction est effectuée dans un volume de 20µl : - 1 µg RNA total

- 10 µl 2X RT reaction Mix - 2 µl Enzyme Superscript III - X µl d’eau DEPC

- Mélanger et incuber la préparation à 25°C pendant 10 minutes - Incuber à 42°C pendant 50 minutes

- Incuber à 85°C pendant 5 min et garder sur glace

- Ajouter 1U de RNAse H d'E.coli et incuber à 37°C pendant 20 minutes pour débarrasser l’échantillon des molécules d’ARN restantes.

4.3.2 qRT PCR par la méthode du TaqMan

Les quantités relatives d’ADNc dans les différents échantillons ont été estimées en appliquant la technique du TaqMan

. Celle-ci est basée sur la méthode de calcul des ∆∆Ct.

Le Ct est défini comme le nombre de cycles d’amplification par PCR quantitative du gène nécessaire pour atteindre un certain seuil de quantité du gène, celui-ci est fixé arbitrairement.

La valeur Ct est inversement proportionnelle au nombre de copies de la séquence cible en présence dans l’échantillon. Pour obtenir une valeur relative du taux d’expression du gène d’intérêt dans un échantillon donné par rapport à un échantillon de référence, la quantité du gène cible est d’abord normalisée par rapport à un gène de référence : une valeur ∆Ct est obtenue pour chaque échantillon dont un échantillon défini comme référence (calibreur).

Ensuite, pour chaque échantillon, la valeur du ∆Ct est comparée à la valeur du ∆Ct obtenue pour l’échantillon calibreur : une valeur de ∆∆Ct est ainsi obtenue. Dans chaque échantillon, l’expression relative (RE) du gène cible par rapport à l’échantillon de référence est donnée par la formule RE =

.

Les réactions de qRT PCR ont été réalisées grâce à l’utilisation du kit Platinum

Quantitative PCR SuperMix-UDG d'Invitrogen (Cat. Num. 11734-050) et d’une solution

commerciale de sondes et d'amorces spécifiques de Applied Biosystems (AOD, Assay On

Demand) pour chaque gène étudié.

Protocole

- Placer dans chaque puit d’une plaque de PCR 96 puits (Part No.: 4306737, Applied Biosystems) : 25 µl PCR SuperMix-UDG (2X)

1 µl Rox Reference Dye (50X) 4 µl ADNc issue de la réaction RT 2,5 µl AOD (20X)

17,5 µl H2O

- Homogénéiser la solution et centrifuger la plaque, placer celle-ci dans la machine de qRT-PCR (« 7300 Real Time PCR System » de Applied Biosystems.

- Pour chaque réaction nous avons eu recours au programme suivant

 50°C pendant 2 minutes

 95°C pendant 2 minutes

 50 cycles de : 95°C pendant 15 secondes 60°C pendant 45 secondes

Pour chaque échantillon de tissu mammaire, toutes les réactions ont été effectuées en

triple et un minimum de trois échantillons indépendants de tissu mammaire a été analysé pour

chaque lignée. La B2-microglobuline (Assay No. 00560865_m1 basé sur RefSeq

NM_012512) a constitué le gène de référence pour toutes les analyses qRt PCR effectuées

dans le présent travail. Les analyses statistiques des données ont été effectuées grâce à

l’utilisation du logiciel SigmaStat 3.0 (Systat Software, Erkrath, RFA). Les données sont

exprimées en terme de RE ± l’erreur standard (SE). Les groupes de populations RE ont été

comparés en utilisant la fonction « Pairwise Comparison » du logiciel qui permet d’effectuer

un test de la somme des rangs de Mann-Whitney.