Mémoire de fin d’études
En vue de l’obtention du diplôme : Master Académique en Biologie Option : Biochimie et Santé
Thème
Membres de Jury : Présenté par : Président : MEZAHEM Tasaadit BELKAZAI Widad Examinateur : ABBES Arbia DOUZA Amira Encadrant : CHERBAL Asma MABROUK Wafa
Année Universitaire 2016-2017
Numéro d’ordre:……….…..….
ﯾﻠﻛ ـ ﻋ ﺔ ـــــ طﻟا موﻠ ـــ ﻌﯾﺑ ـ ﺣﻟا و ﺔ ــــــ
ةﺎﯾ
ﺳﻗ ــــــ م ﺔﯾوﻠﺧﻟاو ﺔﯾﺋﯾزﺟﻟا ﺎﯾﺟوﻟوﯾﺑﻟا .
Faculté des Sciences de la Nature et de la Vie Département : Biologie Moléculaire et Cellulaire
ﻌﺘﻟا ةرازو ـﻴﻠـ ﻌﻟا ﻢ ـﻟﺎـ ﺒﻟا و ﻲ ـﺤـ ﻠﻌﻟا ﺚ ـﻤـ ﻲ
République Algérienne Démocratique et Populaire Ministère de l’Enseignement Supérieur et de la Recherche
ﺔــــﻌﻣﺎـــﺟ ﻲﺤﯾ ﻦﺑ ﻖﯾﺪﺼﻟا ﺪﻤﺤﻣ
- ـﺠــــﯿــﺟ ــــ
ﻞـ -
Université Mohammed Seddik Ben Yahia –Jijel-
Evaluation de l’effet anti-inflammatoire de l’extrait de Pistacia lentiscus L. de la région de Jijel sur l’œdème
aigu de la patte de rat induit par la carragénine
ii REMERCIEMENTS
Le travail présenté dans ce mémoire a été effectué au sein du laboratoire de Biochimie, Faculté des Sciences de la Nature et de la Vie.
Avant tout, on remercie Dieu le tout puissant, de nous avoir donné la force, la patience et la volonté pour accomplir ce travail.
Il est difficile d'exprimer, en quelques lignes, nos remerciements à l'égard de notre encadreur de mémoire, Mme Charbel Asma, maître-assistante « A » à la Faculté des Sciences de la Nature et de la Vie. En effet, nous avons le privilège d'être encadrées et orientées par elle, d'apprécier ses qualités et ses valeurs. On la remercie pour la confiance qu'elle a placée en nous durant cette période de recherche. Nous lui témoigne notre gratitude pour ses conseils qui nous ont été très utiles et qui nous le seront toujours. Il est, à nos avis, difficile de trouver une aussi bonne directrice de mémoire tant d'un point de vue scientifique que d'un point de vue humain. Son sérieux, sa gentillesse, ses compétences et son savoir nous ont énormément marqués. Ce travail est donc pour nous, l'occasion de lui témoigner, nos profondes gratitudes pour ses aides et sa disponibilité. Puisse-t-elle, enfin, trouver à travers ces quelques lignes, l'expression de notre respectueuse considération et notre profonde admiration pour toutes ses qualités humaines et scientifiques.
On tient à exprimer notre gratitude à Mme Mezahem Tasaadit pour avoir accepté de présider le jury de soutenance.
Nos remerciements s'adressent également à Mme Abbes Arbia de nous avoir honorées en acceptant de faire partie du jury et d'examiner notre travail à travers ses remarques et critiques.
On veut adresser nos remerciements à Monsieur Bouhous Chef de Département de Biologie Moléculaire et Cellulaire pour son soutien.
Nous sommes très reconnaissantes à tous les membres de l’équipe de laboratoire, leur qualités humaine et scientifique ont été indispensables pour mener à bien ce travail commençant par Belkazai Widad, MmeHouria, MelleNassiha, MelleSoumia, Mr. Mokhtar…
Enfin on remercie chaleureusement tous nos enseignants du Département, pour leurs soutiens et formation.
« Belkazai », «Douza » et «Mabrouk»
iii Table des matières
I. Introduction ……...………..…1
II. Etude bibliographique Chapitre 1 : Généralités sur l’inflammation 1. Définition……….…3
2. Etiologie……….…..3
3. Symptômes……….……..3
4. Pathologies de l’inflammation……….……….……..4
5. Cellules et médiateurs de l’inflammation ...………...4
5.1 Les cellules de l’inflammation………..………..…4
5.1.1 Les polynucléaires neutrophiles ………..……….4
5.1.2 Phagocytes mononucléaires ……...………..………4
5.1.3 Les lymphocytes .………...……….……….4
5.1.4 Les mastocytes .……...………...……….……….4
5.1.5 Les basophiles .………...……….……….4
5.1.6 Les cellules endothéliales …...5
5.1.7 Les fibroblastes ...……….……… 5
5.1.8 Les plaquettes ………...………5
5.2 Les médiateurs de l’inflammation ………...………..…5
6. Les types de l’inflammation ………..…..7
6.1 Inflammation aiguë…….………..………..7
6.2 Inflammation chronique ………..…….…..7
7. Les phases de l’inflammation …..………..……..7
7.1 La phase vasculaire (initiation) …..……….…….…..7
7.2 La phase cellulaire (amplification) ………..………..7
7.3 La phase de réparation (résolution)………....8
8. Mécanismes de régulation de la réaction inflammatoire……….……….8
9. Exploration biologique de l’inflammation………..….9
10. Traitement de l’inflammation..……….……….10
10.1 Les anti-inflammatoires non stéroïdiens (AINS) ...………...10
10.2 Les anti-inflammatoires stéroïdiens (AIS).………...………...………..……10
10.3 Les anti-inflammatoires d’origine végétale ………...….…11
Table des matières
iv Chapitre 2 : Pistacia lentiscus L.
1. Habitat, distribution géographiques et culture ………...…….12
2. Description botanique ………..………...………12
3. Taxonomie et classification botanique de Pistacia lentiscus L ..…...……….………13
4. Propriétés biologiques et pharmacologiques ………..13
5. Principaux métabolites secondaires ...……….………15
5.1. Les composés phénoliques ……….……….15
5.1.1. Les acides phénoliques ……….…15
5.1.2. Les flavonoïdes ……….…16
5.1.3. Les tanins condensés …...……….……….…16
6. L’activité anti-inflammatoire des polyphénols….……….……….……..17
III. Matériel et méthodes……….………...….………18
III.1. Matériel………18
III.1.1. Matériel végétal ………..….….…….18
III.1.2. Matériel animal ………..….……...18
III.2. Méthodes………..…….………..18
III.2.1. Préparation de l’extrait hydro-méthanolique ………..………..…..…………18
III.2.1.1.Macération……….……….…...18
III.2.1.1. Evaporation………...18
III.2.2. Le criblage phytochimique de l’extrait hydro-méthanolique …….……….…21
III.2.2.1. Dosage des composés phénoliques totaux ………….………....…..21
III.2.2.2. Dosage des flavonoïdes………...……….………....…22
III.2.2.3. Dosage des flavonols ………...………...23
III.2.3. Etude de l’activité anti-inflammatoire ……….……..…………..24
III.2.3.1. Etude in vivo……….…...………..24
A. Prétraitement par l’extrait ……….….………...24
B. Induction de l’inflammation……….…….………24
C. Mesure de l’œdème……...……….………24
D. Calcul du pourcentage d’inhibition de l’œdème………25
III.2.3.2 Etude in vitro ……….………….………...…25
A. L’inhibition de la dénaturation protéique……….….25
v
B. Stabilisation de la membrane des globules rouges……....……26
a. Préparation de la suspension des globules rouges……..….27
b. Hémolyse induite par la chaleur……….……….……27
C. Action inhibitrice des protéases…………..……….……….…..28
III.2.4. Analyse statistique………..………….………...…………..30
IV. Résultats ……...….………...……….31
IV.1. Rendement d’extraction des composés phénolique…..………...……31
IV.2. Teneur en composés polyphénoliques de l’extrait hydro-méthanolique……..…...31
IV.3. Evaluation de l’activité anti-inflammatoire……….…………..…..….….32
IV.3.1. Evaluation in vivo………...32
IV.3.2. Evaluation in vitro……….…...34
IV.3.2.1. Pourcentage d’inhibition de la dénaturation protéique……….….34
IV.3.2.2. Stabilisation de la membrane des globules rouges.………...35
IV.3.2.3. Activité inhibitrice de la protéase…….………...…….………...37
V. Discussion…….………….……...……….….….39
VI. Conclusion……….……..….44
VII. Références bibliographique ………...…….……….….45 Annexes
Glossaire Résumé
Liste des abréviations
vi Liste des abréviations
AA : Acide arachidonique
A2 : Apoprotéine2
ACTH : Adréno cortico trophine hormone
AINS : Anti-inflammatoire non stéroïdien
AIS : Anti-inflammatoire stéroïdien
AlCl3 : Trichlorure d’aluminium
BSA : Albumine de sérum bovin
CD : Cellule dendritique
CRP : C-réactive protéine
CRF : Corticotropin releasing factor
EA : Asie de l'Est
EAG : Equivalent d'acide gallique
EEC : Equivalent d'épicatéchine
EQ : Equivalent de Quercétine
FAO : Formes activées de l’oxygène
GC : Glucocorticoïde
HCL : Acide chlorhydrique
H3PMo12O40 : Acide phosphornolybdique
H3PW12O40 : Acide phosphotungstique
IFN : Interférongama
LDL : Low-density lipoprotein
IgG : Immunoglbuline G
IL : Interleukine
LTB : Leukotriene B
LTC : Leukotriene C
LTD : Leukotriene D
MEA : Eurasie Méditerranéenne et l'Afrique adjacente
MICI : Maladies inflammatoires chroniques de l’intestin
α-MSH : Alpha-melanophore-stimulating hormon
NaCl : Chlorure de sodium
Na2Co3 : Carbonate de sodium
NO : Oxyde d’azote
vii
PAF : Facteur d’activation des plaquettes
PGE2 : Prostaglandine E2
PGI2 : Prostaglandine I2
PNN : Polynucléaire neutrophile
TGF-β : Transforming growth factor beta
Th : T-helper
THP-1 : Tamm-horsfall protien 1
TIMP : Tissue inhibitor of metalloproteinase
TNFα : Tumor necrosis factorα
UV : Ultra-violet
VS : Vitesse de sédimentation
Les unités couramment utilisées sont citées ci-dessous
C° : Température en degrés Celsius
g : Gramme
h : Heure
Kg : kilogramme
mg : Milligramme
mn : Minute
ml : Millilitre
nm : Nanomètre
μg : Microgramme
μl : Microlitre
V : Volume
Liste des figures
viii Liste des figures
Figure 1 : Recrutement de cellules immunitaires au cours de l’inflammation ... 8
Figure 2 : Description botanique de Pistacia lentiscus L. ... 12
Figure 3 : Aire de répartition de Pistacia lentiscus L. en Méditerranée ... 13
Figure 4 : Structures de base des acides phénoliques ... 15
Figure 5 : Squelette de base des flavonoïdes ... 16
Figure 6 : Structure d’un tannin condensé: polymère de proanthocyanidine ... 16
Figure 7 : Protocole de l’extraction des polyphénols…...………20
Figure 8 : Procédure de dosage des composés phénoliques totaux………..……22
Figure 9 : Procédure de dosage des flavonoïdes totaux………...23
Figure 10 : Procédure de dosage des flavonols………23
Figure 11 : Protocole d’ihnibition de la dénaturaton des protéines………...……..26
Figure 12 : Protocole de préparation de la suspension…….………...27
Figure 13 : Protocole d’inhibitionde l’hémolyse des globules rouges...……….28
Figure 14 : Procédure de l’action inhibitrice des protéases trypsine………...29
Figure 15 : Pourcentage d’inhibition de l’œdème des pattes des rats par l’extrait hydro- méthanolique de feuilles de P. lentiscus L. à différentes concentrations et l’indométacine à dose 10 mg/kg pendant trois heures. ………33
Figure 16: Pourcentage d’inhibition de la dénaturation protéique causée par la chaleur de l’extrait hydro-méthanolique de feuilles de P. lentiscus L. comparé avec l’indométacine à la dose 250 µg/mg……….34
Figure 17 : Inhibition de l’hémolyse des globules rouges par l’extrait hydro-méthanolique de feuilles de P. lentiscus L., de l’indométacine et du blanc à différentes concentrations..……..35
Figure 18 : Pourcentage de la stabilisation de la membrane des globules rouges traités par l’extrait hydro-méthanolique de feuilles de P. lentiscus L. et l’indométacine à différentes concentrations…………...………36
Figure 19 : Activité inhibitrice de la protéase par l’extrait hydro-méthanolique de feuilles de P. lentiscus L., de l’indométacine et du blanc à différentes concentrations. ………...37
Figure 20 : Pourcentage d’inhibition de l’action des protéases par l’extrait hydro-
méthanolique de feuilles de P. lentiscus L. et l’indométacine à différentes concentrations….38
ix Liste des tableaux
Tableau 1 : Les fonctions des principaux médiateurs inflammatoires ... 6 Tableau 2 : Quelques exemples de plantes médicinales à activité anti-inflammatoire ... 11 Tableau 3 : Teneurs en polyphénols, en flavonoïdes et en flavonols de l’extrait hydro-
méthanolique de feuilles de P. lentiscus L. ... 28 Tableau 4 : Effet de l’extrait de P. lentiscus L. sur l’œdème de la patte de rat induit par la carragénine. ... 30
Introduction
1 I. Introduction
L'inflammation est une réponse immunitaire naturelle de l'organisme à diverses agressions qui peuvent être d'origine physiques, chimiques, biologiques ou infectieuses. Son traitement actuel est basé sur les anti-inflammatoires stéroïdiens (glucocorticoïdes) et non stéroïdiens comme l'indométacine. Ces molécules présentent le plus souvent des effets indésirables qui peuvent gêner leur utilisation à long terme (Ndiaye et al., 2006).
Depuis l'antiquité, les plantes médicinales ont joué un rôle essentiel dans la prévention de la santé humaine. Elles continuent de fournir à l'humanité de nouveaux remèdes. Il est donc important d'explorer les plantes médicinales pour leur sécurité, leur qualité, leur toxicité et leur efficacité. Les chercheurs s'intéressent beaucoup à l'étude de ces plantes dans le but d'isoler de nouveaux médicaments naturels et actifs pour la médecine moderne. Ces produits naturels possèdent plusieurs activités biologiques, y compris une activité anti-oxydante et anti-inflammatoire (Nemudzivhadi et Masoko, 2014).
Pistacia lentiscus L. est un arbuste à feuilles persistantes de la famille des Anacardiaceae produisant des baies globuleuses rouge vif (longo et al., 2007). Les infusions de leurs feuilles sont largement utilisées dans la médecine traditionnelle comme un agent astringent, expectorant, cicatrisant et pour le traitement de maladies sévères liées à l'inflammation, telles que les infections de la gorge et les ulcères gastro-intestinaux (Remila et al., 2015).
Nous avons entrepris l’étude des propriétés pharmacologiques de l’extrait hydro-méthanolique de feuilles de Pistacia lentiscus L. pour apporter une base scientifique à l’utilisation traditionnelle de cette plante.
L’objectif de la présente étude est de vérifier si l’utilisation de Pistacia lentiscus L. comme anti- inflammatoire est justifiée, c’est dans ce but qui en évaluant l’effet anti-inflammatoire de l’extrait hydro-méthanolique de feuilles de Pistacia lentiscus L. de la région de Jijel sur l’œdème aiguë de la patte de rat induit par la carragénine.
Le plan de notre travail a été réalisé par la préparation de l’extrait hydro-méthanolique à partir de feuilles de Pistacia lentiscus L. préalablement séchées et broyées pour faire un criblage phytochimique afin de caractériser les principaux groupes chimiques bioactifs par des réactions colorimétriques, une induction de l’inflammation aiguë par l’injection de la carragénine sous l’aponévrose plantaire de la patte postérieure de rat pour l’évaluation de l’effet anti-inflammatoire de l’extrait hydro-méthanolique de Pistacia lentiscus L. in vivo par le calcul du pourcentage
Introduction
2 d’inhibition de l’œdème (% INH) chez les rats traités par rapport aux témoins et in vitro par l’étude de l'inhibition de la dénaturation protéique, la stabilisation de la membrane des globules rouges et l'inhibition de l'action de la protéase.
Synthèse bibliographique
Chapitre 1
Généralité sur l’inflammation
3 1. Définition de l’inflammation
L’inflammation ou la réaction inflammatoire est une réponse normale immédiate et transitoire. Elle se traduit par un ensemble des réactions cellulaires et moléculaires locales et périphériques, déclenchées à partir d’un foyer afin de circonscrire à une agression, une infection ou traumatisme (Raymondjean, 2007). La réaction inflammatoire comprend la production des cytokines qui exercent des actions locales et systémiques, sa contrôle dépend d'un équilibre subtil entre des cytokines pro- et anti inflammatoires (Cynober, 2000).
2. Etiologie
L’inflammation est une réaction de défense de l'organisme à diverses agressions qui peuvent être d'origine physique, chimique, biologique ou infectieuse. Les principaux causes de l’inflammation (Ndiaye et al., 2006) sont :
L’infection par des agents pathogènes : toxines bactériennes, virus, parasites et champignons (Revillard, 2001 ; Rousselet et al., 2005).
Les agents physiques : chaleur, froid, traumatisme et l’irradiation par les rayons UV, X, ou Y (Revillard, 2001 ; Rousselet et al., 2005).
Les agents chimiques et métaboliques: minérales, organiques ou biologiques (Revillard, 2001). Parmi eux, on peut citer le carraghénane (la carragénine) un polysaccharide linéaire sulfaté anionique naturel extrait de certaines algues rouges de la famille Rhodophyceae (Rochas et al., 1989). Le mot "carraghénane" semble provient des habitants du pays de Carraghen, sur la côte sud-irlandaise où les extraits d'algues rouges ont déjà été utilisés pour la nourriture et les médicaments depuis 600 ans (Prajapati et al., 2014). Il existe plusieurs types de polysaccharides de carragénine, les trois les plus répandus sont : iota, kappa et lambda (FAO, 2007). Elles peuvent être utilisées dans les industries alimentaires et les cosmétiques comme des agents gélifiants, stabilisants et épaississants en raison de ses biocompatibilités, biodégradabilité, grande capacité de rétention d'eau et résistance mécanique de ses gels (Prajapati et al., 2014) et plus récemment, elles sont utilisés dans l'industrie pharmaceutique comme excipients dans la pilule et les comprimés (Campo et al., 2009) et pour le test des agents anti-inflammatoires (Zacharopoulos et Phillips, 1997).
3. Symptômes
Il existe des différents symptômes de l’inflammation :
les symptômes locaux (rougeur, chaleur, oedème, douleur).
les symptômes généraux (fièvre, asthénie, anorexie, myalgies, torpeur (Muster, 2005).
Chapitre 1 Généralité sur l’inflammation
4 4. Les pathologies de l’inflammation
L’inflammation fait partie des critères de l’évolutivité de certaines maladies, parmi elles :
La rhumatologie : est une pathologie qui peut donner une inflammation de la membrane synoviale (arthrite), des muscles (myosite), des enthèses et des vaisseaux (vascularites) (Saraux, 2005).
La dermatite de contact : est une affection inflammatoire cutanée due à une hypersensibilité qui dépond des cellules TH1 (Chapel et al., 2004).
L’insuffisance (partielle) surrénalienne : résulte après un traitement stéroïdien de brève durée, elle peut provoquer une crise d’Addison fatale (anorexie, nausée, douleurs abdominales, état fébrile, hypoglycémie, hypotension et état de choc) (Henzen, 2003).
Il existe d’autres pathologies inflammatoires telle que : l’inflammation pulmonaire (Fayon et al., 2007) , les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin (MICI) (Bannwarth et al., 2016), le lupus érythémateux (Saraux, 2005), l’inflammation périnatale (Chhor et al., 2012),.…ect.
5. Cellules et médiateurs de l’inflammation 5.1. Les cellules de l’inflammation
5.1.1. Les polynucléaires neutrophiles (PNN)
Représentent 60 à 75 % des globules blancs totaux (Demareta et al., 2014). Elles sont un des pivots de l’immunité innée et constituent un puissant système de défense de l’homme contre les agents pathogènes (Anne Gougerot-Pocidalo, 2012).
5.1.2. Phagocytes mononucléaires
Sont le groupe le plus important des cellules phagocytaires, leur fonction est de capter les particules, y compris les agents infectieux, de les ingérer et de les détruire (Roitt et al., 2002).
5.1.3. Les lymphocytes
Sont des cellules qui arrivent dans un foyer inflammatoire ou infectieux, ils peuvent libérer des médiateurs qui contrôlent l’apport ultérieur et l’activation des autres cellules. Ils lancent ainsi le processus de l’immunité adaptative (Roitt et al., 2002).
5.1.4. Les mastocytes
Sont des cellules résidentes des tissus, notamment d’interface (Blank et vitte, 2014). Elles jouent un rôle important dans l’homéostasie et la régulation immunitaire (Frenzel et Hermine, 2013).
5.1.5. Les basophiles
Libèrent un grand nombre de médiateurs pro-inflammatoires influençant profondément l’orchestration de l’inflammation (Rostan et al., 2014).
5 5.1.6. Les cellules endothéliales
Sont des cellules aplatis constituées à des organites particuliers qui expriment CD31 (Revillard, 2001).
5.1.7. Les fibroblastes
Sont des cellules cibles à des cytokines secrétés par Th2 (l’IL-4 et l’IL-13) qui induisent leur prolifération et stimulent leur différenciation myofibroblastique (Létuvé, 2013).
5.1.8. Les plaquettes
Sont des cellules auxiliaires importantes dans le déclenchement et le développement de l’inflammation (Revillard, 2001) par la libération des médiateurs de l’inflammation comme la sérotonine lorsqu’elles sont activées au cours de la coagulation ou au contact de complexe antigène- anticorps (Roitt et al., 2002).
5.2. Les médiateurs de l’inflammation (tableau 1)
La libération des médiateurs inflammatoires augmentent la contraction du muscle lisse et le flux sanguin (Lydyard et al., 2002). Ces médiateurs peuvent être des :
Cytokines : Sont des médiateurs de la communication intercellulaire (Rousselet et al., 2005), libérés par les monocytes, les macrophages et les lymphocytes (Henrotin et al., 2001). Ils peuvent être pro-inflammatoires (TNFα, IL-1, IL-8), et anti-inflammatoires (IL-4, IL-10, IL-12, IL-13) (Le Bars, 2002).
Neuropeptides : Régulent la réaction inflammatoire dont la substance P est le principale neuropeptide impliqué dans le remodelage des tissus enflammés, elle stimule la prolifération des kératinocytes, des cellules endothéliales, des fibroblastes et des cellules musculaire lisse (Henrotin et al., 2001).
Médiateurs lipidiques : L’acide arachidonique (AA) est libéré principalement par l’action de la phospholipase A2 et sa transformation enzymatique conduite à la libération des prostanoides par la voie de cyclo-oxygénase, les leucotriènes par la voie de lipo-oxygénase et le PAF par les deux voies (Henrotin et al., 2001). Le PGE2 et leucotriène B4 sont les deux médiateurs lipidiques majeurs (Raymondjean, 2007).
Autre médiateurs de l’inflammation : Plusieurs telle que les fractions du complément, les facteurs de la coagulation, les métallo-protéases et les formes activées de l’oxygène et de l’azote (FAO) (Henrotin et al., 2001).
Chapitre 1 Généralité sur l’inflammation
6 Tableau 1 : Les fonctions des principaux médiateurs inflammatoires (Genetet, 1997 ; Rousselet et al., 2005).
Médiateurs Fonctions
Histamine, bradykinine, C3a, C5a, LTC4, LTD4, PGE2, prostaglandines, facteur XII, facteur kiningénique.
Augmentation de la perméabilité capillaire
Thromboxane A2, leucotriènes C et D, C5a- LTB4.
Vasoconstriction d’aval.
C3a, C5a, histamine, leucotriènes C et D, tromboxane A2, bradykinine.
Contraction des muscles lisses.
IL-1, TNFα, endotoxine, LTB4 Augmentation de l’adhésivité des phagocytes aux cellules endothéliales.
IL-1, C3c Prolifération des cellules souches médullaires.
C5a, LTB4, PAF, IL-8, histamine, laminine, fragments de collagène, facteurs
lymphocytaires, chimiotactiques, thrombine, produits bactériens.
Chimiotactisme cellulaire.
C5a, PAF, IL-8 Réglage des médiateurs lysosomiaux intra
granulaires.
C5a, TNFα, PAF, IL-8, IFN Augmentation de la production des radicaux oxygénés.
C3b, IgG (Fc), IFN, fibronectine Accentuation de la phagocytose.
IL-1, TNFα, TNF Formation de granulome inflammatoire.
PGE2, IL-1, TNFα, IL-6 Fièvre
PGE2, bradykinine Douleur
Destruction (cellules, matrice) Radicaux libres oxygénés, enzymes des lysosomes, NO, cytokines lymphocytaires
7 6. Les types de l’inflammation
6.1. Inflammation aiguë
Une réaction inflammatoire immédiate à un agent agresseur, de courte durée (quelques jours ou semaines), est caractérisée par l’adhérence des plaquettes, de neutrophiles puis les monocytes à l’endothélium (Revillard, 2001). Elle est la réponse typique du système immunitaire inné (Espinosa et chillet, 2006), résidente à la guérison complète de la lésion initiale (Genetet, 1997).
6.2. Inflammation chronique
Est une inflammation aiguë persistante, conduit à la formation de lésions focalisées (Cavaillon, 1993) formées par les cellules endothéliales, les fibroblastes et les macrophages (Révillard, 2001) où la production accrue des médiateurs qui maintient le processus inflammatoire (Genetet, 1997).
7. Les phases de l’inflammation 7.1. La phase vasculaire (initiation)
Elle se caractérise par des modifications importantes de la microcirculation locale (Genetet, 1997), par dilation et augmentation de l’espace intercellulaire (Raymondjean, 2007). Elle se traduit cliniquement par l’apparition des quatre signes cardinaux classiques de l'inflammation aiguë : rougeur, chaleur, œdème, douleur (Rousselet et al., 2005), sous l’effet des radicaux libres de l’oxygène, l’oxyde d’azote (NO) et de nombreux métabolites de l’acide arachidonique (Raymondjean, 2007). Elle comporte trois phénomènes : une congestion active ; déclenchée par un mécanisme nerveux et l'action de médiateurs chimiques, un œdème inflammatoire (l'exsudat) ; résulte d'une augmentation de la pression hydro statique et de la perméabilité de la paroi des petits vaisseaux sous l’effet de médiateurs chimiques, et une diapédèse leucocytaire ; par migration des leucocytes en dehors de la microcirculation et leur accumulation dans le foyer lésionnel (Rousselet et al., 2005).
7.2. La phase cellulaire (amplification)
Elle se caractérise par la formation du granulome inflammatoire (Rousselet et al., 2005).Cette étape implique un recrutement cellulaire, avec un afflux de leucocytes polymorphonucléaires, une activation des cellules résidentes des tissus agressés et une libération de nombreux médiateurs pro- inflammatoire (Barnig, 2016 ; Ravat et al., 2011). Elle dépend largement de la production locale de cytokines possédant une activité chimio-attractante et les chimiokines qui exercent leur activité sur les PNN (IL-8) ou les monocytes-macrophages et les lymphocytes, ce qui rend difficile l’identification des propriétés de chacune in vivo. Ceci explique également la variabilité de la réponse inflammatoire selon le type d’agression (Cynober, 2000).
Chapitre 1 Généralité sur l’inflammation
8 7.3. La phase de réparation (résolution)
La résolution de l’inflammation est un processus actif, qui n’est pas uniquement médié par la décroissance de médiateurs pro-inflammatoires, mais qui dépend également de voies de signalisations précoces et de la production précoce de médiateurs anti-inflammatoires, pro-résolvant et contra-régulateurs (Barnig, 2016) pour réguler les proliférations et biosynthèses cellulaires (Rousselet et al., 2005).
La réparation passe par la constitution d'un nouveau tissu conjonctif appelé bourgeon charnu qui va remplacer les tissus détruits au cours de l'inflammation, puis par la constitution d'une cicatrice ; est la marque définitive laissée par le foyer inflammatoire après la phase de bourgeon charnu. En fin les cellules épithéliales détruites sont remplacées par la prolifération des cellules épithéliales saines situées autour du foyer inflammatoire (Rousselet et al., 2005).
Figure 1 : Recrutement de cellules immunitaires au cours de l’inflammation (De Franco et al., 2009).
8. Mécanismes de régulation de la réaction inflammatoire
Il existe des mécanismes de rétrocontrôle négative pour éviter les risques nocifs de la réponse inflammatoire et limiter les dégâts survenues aux tissus, assurant un retour au silence de la réponse inflammatoire et préparant aussi la phase de réparation des tissus. Les principales sont :
1 : La phase d’initiation
3 : La phase de réparation 2 : La phase
cellulaire
9 - La sécrétion des cytokines anti-inflammatoires :IL10, IL-Ira et TGF-β (antagonistes du récepteur de l’IL-1). L’IL-10 inhibe les mécanismes cellulaires par la production des cytokines inflammatoires. L’IL-Ira bloque l’action de l’IL-1 par la fixation sur les récepteurs de l’IL-1 mais n’induit pas de signal. Le TGF-β bloque l’action des protéases cellulaires en dégradant la matrice extracellulaire et en induisant la réparation et la régénération tissulaires. Il est inhibiteur pour les mastocytes et les lymphocytes T.
- La production d’hormones anti-inflammatoires comme le cortisol et les dérivés de la pro- opiomélanocortine (ACTH, α-MSH).
- La production d’anti-protéases comme certaines protéines de la phase aigüe (α-1 antitrypsines), les inhibiteurs de métallo-protéases (TIMP) et les inhibiteurs de sérine protéases (serpines) (Espinosa et Chillet, 2006).
9. Exploration biologique de l’inflammation
Les marqueurs biologiques de l’inflammation ont un intérêt diagnostique et de suivi évolutif dans les situations graves et/ou urgentes (Emile, 2012). Ils reflètent beaucoup plus les conséquences de l’inflammation (Saraux, 2005). Parmi eux :
La vitesse de sédimentation (VS) : elle mesure par la sédimentation des globules rouges à travers une colonne verticale de 200 mm et d’un diamètre interne de 2,5 mm, placée à température ambiante dans un endroit stable. Après 60 minutes, la distance de migration des globules rouges à travers le plasma est enregistrée en mm par heure, donc, elle mesure de façon indirecte l’élévation des protéines inflammatoires de la phase aiguë induite par un stimulus (Gervaix, 2005).
La C-réactive protéine (CRP) : C’est la première protéine de la phase aiguë de l’inflammation.C’est un marqueur très sensible de l’inflammation systémique. Elle est produite par les hépatocytes en réponse à l’interleukine-6. Sa cinétique est rapide, sa concentration sanguine (ou sérique) augmente à la sixième heure du processus inflammatoire, sa demi-vie plasmatique est de 19 heures (Mattioni et Grateau, 2013). Elle augmente au cours des pathologies inflammatoires, auto-inflammatoires et au cours des infections bactériennes ou virales (Emile, 2012).
La procalcitonine : Polypeptide pro-hormone de calcitonine. Elle s’élève tôt, comme la CRP, selon une cinétique encore plus rapide, excellente pour le diagnostic d’infection bactérienne et un guide pour la prise en charge des patients septiques graves (Emile, 2012).
Le fibrinogène : Il s’élève à la phase tardive de l’inflammation. Il est plutôt utile dans les sepsis graves (Emile, 2012).
Chapitre 1 Généralité sur l’inflammation
10
L’orosomucoïde et l’haptoglobine : Ces deux protéines s’élèvent également à la phase tardive de l’inflammation, mais aussi dans d’autres circonstances : prise d’œstrogènes, syndrome néphrotique (Emile, 2012).
L’électrophorèse des protéines plasmatiques : Elle montre 5 fractions protéiques qui interviennent dans les mécanismes de l’inflammation. Une hypo-albuminémie est présentée lors des syndromes inflammatoires sévères. L’élévation des α-1globulines est observée au début d’un processus inflammatoire, tandis que l’augmentation des α-2 évoque un syndrome inflammatoire constitue (Emile, 2012).
Cytokines : Une production accrue de cytokines pro-inflammatoires (TNFα,IL-1b, l’IL-6, IFNγ,l’IL-8 et anti-inflammatoires (IL-10, IL-1Ra, TGFβ) dans la circulation reflètent davantage la sévérité du processus inflammatoire et son évolution (Adib-Conquy et Cavaillon, 2012).
10. Traitement de l’inflammation
Le terme anti-inflammatoires stéroïdiens (glucocorticoïdes) et non stéroïdiens et connue comme traitement actuel de l’inflammation. Ces molécules bien qu’étant efficaces présentent le plus souvent des effets indésirables qui peuvent gêner leur utilisation au long terme (Rahmani et al., 2016).
10.1. Les anti-inflammatoires non stéroïdiens (AINS)
Constituent une classe médicamenteuse hétérogène du point de vue chimique où l’aspirine est le chef de ces anti-inflammatoires (Pillon, 2014), sont utilisés en médecine ambulatoire pour leur action antalgique et antipyrétiqueet antiagrégant plaquettaire (Pillon, 2014 ; Dirou et Voiriot, 2015).
Leur efficacité comme leurs principaux effets secondaires sont liés à leur mécanisme d’action principal qui est l’inhibition des cyclo-oxygénases, enzymes responsables de la synthèse des prostaglandines (notamment la PGE2 et la PGI2) et du thromboxane à partir de l’acide arachidonique (Orliaguet et al., 2013).
10.2. Les anti-inflammatoires stéroïdiens (AIS)
Constituent une grande famille de médicaments dérivés du cortisol, ont une fonction vitale dans la régulation du tonus des vaisseaux et aussi pour maintenir toute une série de systèmes homéostatiques (Henzen, 2003 ; Dejean et Richard, 2013). Les glucocorticoïdes inhibent l’action de phospholipase A2 responsable à la synthèse des prostaglandines à partir du métabolisme de l’acide arachidonique par la cyclo-oxygénase (Guilpain et Le Jeunne, 2012 ; Orliaguet et al., 2013), comme ils ont une action à la fois cytoplasmique et génomique, ayant pour conséquences une modulation de la transcription et de l’expression des médiateurs (bradykinine, histamine. . .), des cytokines
11 (interleukine 1 et 2, TNF... ) et de divers neuropeptides (CRF, ACTH, bêtaendorphine. . .) (Orliaguet et al., 2013).
10.3. Les anti-inflammatoires d’origine végétale (tableau 2)
Les plantes constituent une source potentielle de molécules naturelles bioactives. Elles sont utilisées particulièrement pour la protection contre la peroxydation lipidique et le traitement des maladies anti-inflammatoires (Bourkhiss et al., 2010).
Voici quelques exemples de plantes médicinales données d’activités anti-inflammatoires sont cités dans le tableau 2.
Tableau 2 : Quelques exemples de plantes médicinales à activité anti-inflammatoire (Amezouar et al., 2013, Charles et al., 2015 ; Rahmani et al., 2016 ; Setty et Sigal, 2005 ; Soro et al., 2016).
Nom scientifique Famille Partie utilisée
Nom commun
Utilisation
Ximenia americana
Olacaceae Ecorce de la tige
Citron de mer
fièvre, inflammation, affections douloureuses
Buchholzia coriacea Engl
Capparidaceae écorces du tronc
kola pimenté
Maladies inflammatoires, fièvre douleurs, infections microbiennes Limoniastrum
feei
Plumbaginacée feuilles infections respiratoires et
intestinales, douleurs gastriques.
infections bactériennes Zingiber
officinale
Zingiberaceae rhizomes Gingers l'inflammation, rhumatisme, vertiges, nausées, vomissements du mal des transports ; de
postopératoire et de la grossesse.
Urtica diocia Urticaceae Feuilles Racines
Ortie Alopécie, eczéma, goutte, rhinite, urticaire, allergie, polyarthrite rhumatoïde, l'hypertrophie bénigne de la prostate Uncaria
tomentosa
Ecorce griffe de chat
arthrite, bursite, lupus, syndrome de fatigue chronique, Troubles de l'estomac et des intestins
Chapitre 2
Pistacia lentiscus L.
12 1. Habitat, distribution géographique et culture
Pistacia lentiscus Linn, communément connu sous le nom « arbre au mastic », fait partie d’une grande famille (Anacardiaceae). Elle constitue plus d'une onze espèces qui sont distribuées dans les écosystèmes basiques méditerranéens (Remila et al., 2015). Cet arbrisseau des sols très arides et très ensoleillés demande une chaleur élevée mais elle peut tolérer une certaine humidité (Lieutaghi, 2004). Elle contribue largement à la constitution du maquis (sols siliceux) mais se développe également dans le milieu calcaire de certaines garrigues. Elle se développe dans des endroits à peuplements denses qui facilite leur exploitation (Lanfranchi et al., 1999).
Cette espèce est largement répandue dans l'Europe méditerranéenne, dans la péninsule ibérique et dans l'ouest à travers le sud de la France (Ansari et al., 2012). Pistacia lentiscus L. est distribuée aussi à partir du bassin méditerranéen vers l'asie centrale (Bozorgi et al., 2013), à proximité de l'Afrique du Nord, les pays du Moyen- Orient (Karimi et al., 2012) et l'Amérique du Nord jusqu’à l'Amérique centrale ( Xie et al., 2014).
En Algérie, P. lentiscus L. se trouve dans diverses régions (Hamiani et al., 2016), elle se développe dans les zones arides. Il est communément dispersé en Algérie sur l'ensemble du littoral (Charef et al., 2008) et très commun dans le tell algérien (Alloun, 2007).
Figure 2 : Aire de répartition de Pistacia lentiscus L. en Méditerranée (Seigue, 1985).
2. Description botanique
Pistacia lentiscus L. (Anacardiaceae) est une plante à fleurs qui pousse en région méditerranéenne (Attoub et al., 2014). C’est un arbre au mastic (Imtiyaz et al., 2013) ou un arbuste avec des plantes mâles et femelles séparées (Ansari et al., 2012), plus petit (1-3m, très rarement arbuste de 4-6m) (Lieutaghi, 2004) avec feuilles persistantes, pinées et petites (4-5 mm de diamètre) (Ansari et al., 2012).
Chapitre 2 Pistacia lentiscus L.
13 Il fleurit en Avril-Juin (Lieutaghi, 2004). Les fleurs sont en petits racèmes, à aisselle des feuilles, à calice pentalobé, à 5 étamines, de couleur rougeâtre.
Le fruit, en octobre-novembre est une drupe globuleuse, peu charnue, de la grosseur d’un pois, d’abord rouge, puis noire à maturité, de 4à5 mm de diamètre (Yahia, 1992).
La gomme de mastic est une exsudation résineuse obtenue par incision des tiges de la plante (Imtiyaz et al., 2013), il a une forte odeur de résine (Ansari et al., 2012).
Figure 3: Description botanique de P. lentiscus L. (Bammou et al., 2015).
3. Taxonomie et classification botanique de Pistacia lentiscus L.
Règne : Plantae
Division : Magnoliophyta Ordre : Sapindales Famille : Anacardiaceae Genre : Pistacia
Espèce : Pistacia lentiscus (Ansari et al., 2012)
Nom botanique : Pistacia lentiscus Linn (Imtiyaz et al., 2013) Synonymes : Arbre au mastic
Noms vernaculaires : Derou, diroua, dhrou, fethies, fadhiss, itk, tikht, tidekst, tadist, tadis, imidek, le fruit : gheddaïn, ghoudhim, ghouhoum (Yahia, 1992 ; Alloun, 2007).
4. Propriétés biologiques et pharmacologiques
Pistacia lentiscus L. a été utilisé en médecine populaire depuis les anciens Grecs (Djerrou, 2014 ; Khiar et al., 2016). Elle a été largement utilisée dans les industries alimentaires, comme dans les produits adhérents, dans les rafraîchissements alcooliques et non-alcooliques, dans les cosmétiques comme ingrédient de remplissage, dans la dentisterie et dans la production de dentifrice (Piccolella et al., 2016).
14 Les fruits : présentent une très forte teneur en anthocyanes, leuco-anthocyanes, tannins totaux, tannins galliques, flavonoïdes, glucosides et amidon alors qu’il ya une présence modérée des mucilages (Arab et al., 2014).
Les fruits donnent une huile végétale comestible qui est traditionnellement utilisé parla population tunisienne dans leur alimentation quotidienne en salades et pâtisseries (Trabelsi et al., 2012). Cette huile grasse de P. lentiscus est utilisée pour ses propriétés anti-hyperlipidémiques pour réduire le cholestérol total, le cholestérol LDL et les triglycérides et localement pour traiter les brûlures, les blessures et les allergies respiratoires (Djerrou, 2014). Elle peut être utilisée utiliser aussi dans le traitement de la gale, des rhumatismes, la protection contre l'intoxication au mercure et dans la fabrication d’anti-diarrhéique (Trabelsi et al., 2012). Les baies de P. lentiscus sont riches en anthocyanines, qui confèrent une capacité antioxydante et induisent l'autophagie, un mécanisme pour améliorer la chimioprévention (Rodrıguez-Pérez et al., 2013).
Les feuilles : présentent une très forte teneur en leuco-anthocyanes, en saponosides, en tannins condensés, en tannins galliques, en coumarines et flavonoïdes (Beghlal et al., 2016 ; Arab et al, 2014),en sénosides et une teneur moyenne en glucosides (Arab et al., 2014 ; Cheurfa et Allem, 2015). Les feuilles sont largement utilisés dans la médecine traditionnelle en tant qu'agent anti- ulcéreux puissant ayant l'action hépato-protectrice et aussi pour le traitement de l'eczéma, de la diarrhée et des infections de la gorge (Rodrıguez-Pérez et al., 2013 ; Bammou et al., 2015 ; Remila et al., 2015 ; Aissi et al., 2016). Les extraits de feuilles riches en phénols totaux, flavonoïdes et tannins, présentent un fort potentiel antioxydant et une forte inhibition des dommages d’H2O2 dans la lignée cellulaire THP-1 (Remila et al., 2015). L’extrait aqueux de feuilles de P. lentiscus L. est une boisson très populaire dans les pays d'Afrique du Nord et devient de plus en plus populaire dans le monde entier à cause de ses propriétés bénéfiques pour la santé (Dahmoune et al., 2014).
L'huile essentielle : est un liquide obtenu par hydro-distillation à aspect limpide de couleur brune foncée, fortement aromatique avec une odeur et saveur très puissantes (Beghlal et al., 2016). La différence dans la composition chimique de l'huile essentielle de P. lentiscus peut être due à la différence de la zone géographique de croissance et de la période de récolte de la plante (Bougherra et al., 2014). Les composés les plus communs habituellement trouvés sont les monoterpènes (α- pinène, α-terpineol, myrcène, limonène, p-cymène et terpinen-4-ol) et les sesquiterpènes (β- caryophyllene, δ-cadinène, germacrène D) (Bachrouch et al., 2010 ; Bougherra et al., 2014 ; Aissi et al., 2016).
Chapitre 2 Pistacia lentiscus L.
15 L’huile essentielle de P. lentiscus L. est souvent utilisée comme remède pour traiter les brûlures et les maux de dos (Beghlal et al., 2016), comme elle présente des activités antimicrobiennes, antifongiques (Trabelsi et al., 2012; Djerrou, 2014), antimutagènes (Rodrıguez-Pérez et al., 2013;
Piccolella et al., 2016), antioxydantes, anti-inflammatoires, anti-athérogènes (Djerrou, 2014), une forte activité contre la Klebsiella pneumoniae (Rauf et al., 2017) et une bonne activité insecticide (Bougherra et al., 2014).
La résine : Le composant le plus important de Pistacia lentiscus L. qui a été analysé par GC et GC- MS pour obtenir l'α-pinène, le β-pinène, le limonène, le terpène-4-ol et le terpénéol (Ansari et al., 2012). La résine ou la gomme de mastic est employée comme masticatoire (chewing-gum) (Alloun, 2007). Elle est utilisée pour la prise en charge de l'inconfort abdominal, des maux d'estomac, de la dyspepsie et de l'ulcère peptique (Djerrou, 2014 ; Rauf et al., 2017), comme elle est présentée des propriétés anti-inflammatoires et antioxydantes chez les patients atteints de la maladie de Crohn (Rodrıguez-Pérez et al., 2013) et l'activité antibactérienne contre Helicobacter pylori qui provoque une inflammation gastrique (Rauf et al., 2017).
5. Principaux métabolites secondaires 5.1. Les composés phénoliques
Les composés phénoliques sont des principaux métabolites secondaires biologiquement actifs des plantes ayant une activité anti-oxydante, anti-inflammatoire et antimicrobienne. Ils sont distribués partout dans le règne végétale (Zillich et al., 2015). Ils sont caractérisés par la présence d’un cycle aromatique portant des groupements hydroxyles libres ou engagés avec des glucides. Parmi eux : les acides phénoliques, les flavonoïdes et les tanins condensés (Tapiero et al., 2002).
5.1.1. Les acides phénoliques
Les acides phénoliques sont des dérivés des acides cinnamique (acide caféique) et benzoïque (acide gallique). Ainsi ce sont des composés qui possèdent au moins une fonction carboxyle et un hydroxyle phénolique (Shilpi et al., 2010).
Acide benzoïque Acide cinnamique Figure 4 : Structures de base des acides phénoliques (Shilpi et al., 2010).
16 5.1.2. Les flavonoïdes
Les flavonoïdes (du latin flavus, jaune) sont des substances généralement colorées très répandues chez les végétaux ; on les trouve dissoutes dans les vacuoles à l’état d’hétérosides ou comme constituants de plastes particuliers ; les chromoplastes (Guignard, 2000). Les flavonoïdes sont des dérivés benzo-γ-pyran (Skerget et al., 2004). Leur structure de base est celle d’un diphénylpropane à 15 atomes de carbone (C6-C3 -C6), constitué de deux noyaux aromatiques (A et B), reliés par un hétérocycle oxygéné (C) (Stalikas, 2007).
Il existe six sous-classes de flavonoïdes, y compris les anthocyanes, les flavonols, les flavanols, les flavanones, les flavones et les isoflavones (Guignard, 2000).
Figure 5 : Squelette de base des flavonoïdes (Ghedira, 2005).
5.1.3. Les tanins condensés
Les tanins condensés sont des oligomères et des polymères des unités de flavan-3-nol, de catéchine ou épicatéchine (Romani, 2006). Ils se rencontrent chez l’ensemble des végétaux, des fougères aux plantes à fleurs. Ils ne s’hydrolysent pas contrairement aux tanins hydrolysables, mais ils forment à l’ébullition des composés insolubles appelés phlobaphènes ou rouges de tanin (Guignard, 2000).
Figure 6 : Structure d’un tannin condensé : polymère de pro-anthocyanidine (Guignard, 2000).
Chapitre 2 Pistacia lentiscus L.
17 6. L’activité anti-inflammatoire des polyphénols
In vitro, plusieurs flavonoïdes sont capables de modifier le métabolisme de l’acide arachidonique en bloquant l’action des cyclo-oxygénases (COX) et lipo-oxygénases (LO) à des concentrations relativement élevées. À faibles concentrations, c’est la lipo-oxygénase qui est inhibée préférentiellement (Ghedira, 2005), ceci conduit à une inhibition de la synthèse des eicosanoїdes, aussi ils provoquent l’inhibition de la peroxydation non enzymatique des acides gras poly-insaturés nécessaires pour l’activation de ces oxygénases ce qui provoque un effet anti-inflammatoire (Formica et Regelson, 1995).
Certains travaux suggèrent qu’ils posséderaient une bonne activité anti-inflammatoire sans des effets indésirables de type ulcérogène (Ghedira, 2005).
Matériel et méthodes
Matériel et méthodes
18 III : Matériel et méthodes
III.1. Matériel
III.1.1. Matériel végétal
Les feuilles de P. lentiscus L. ont été collectées en mois de Mars 2017 dans la région d’El M’Zaïr, wilaya de Jijel. Puis, elles ont été séchées à l’abri de la lumière et stockées à température ambiante dans un endroit sec jusqu'à l'utilisation.
III.1.2. Matériel animal
L’expérience a été réalisée sur un effectif de 15 rats mal adultes de souche Wistar fournis par l’animalerie de l’institut pasteur, de poids compris entre 270 et 290 g. Les rats ont été répartis selon le poids en 5 lots homogènes de 3 dans des cages en plastique un mois de la nourriture standard (croquettes) et l’eau. Ces rats ont été acclimatés pendant un mois à une température ambiante avec un cycle naturel de lumière et obscurité avant l’expérimentation.
III.2. Méthodes
III.2.1. Préparation de l’extrait hydro-méthanolique
Selon Awika et al. (2005), les feuilles séchées à l'air ont été broyées à l'aide d'un broyeur électrique de marque Retsch type GM 200 pour obtenir une fine poudre. Le criblage a été réalisé avec un tamis dont le diamètre des points de suture est de 100 µm, la poudre de la plante a été conservée ensuite dans un flacon opaque afin d'éviter l'oxydation de leurs composants.
L’extraction des composés phénoliques à partir de la poudre des feuilles de la plante a été réalisée par une méthode solide-liquide selon la procédure d’Owen et Johns (1999) légèrement modifiée.
Elle est réalisée en deux étapes : III.2.1.1. Macération
La macération est une opération qui consiste à laisser la poudre du matériel végétal en contact prolongé avec un solvant pour en extraire les principes actifs. C’est une extraction qui se fait à température ambiante. 100 g de la poudre de la plante a été effectuée à température ambiante pendant 72 h dans 1000 ml de l'eau-méthanol 80/20 (v / v) à un rapport solide / liquide de 1/10 (p / v) sous agitation continue par un agitateur magnétique.
III.2.1.2. Evaporation
L'extrait hydro-méthanolique ou le macérât a été filtré par le papier wattman et donné une solution vertes foncée due à la chlorophylle (Chevoleau et al., 1992) . Ensuite, cette solution a été concentré à 40 °C dans un évaporateur rotatif de type Rotavapor ® 300 (Naczk et Shahidi, 2006).
