In vitro, plusieurs flavonoïdes sont capables de modifier le métabolisme de l’acide arachidonique en bloquant l’action des cyclo-oxygénases (COX) et lipo-oxygénases (LO) à des concentrations relativement élevées. À faibles concentrations, c’est la lipo-oxygénase qui est inhibée préférentiellement (Ghedira, 2005), ceci conduit à une inhibition de la synthèse des eicosanoїdes,
aussi ils provoquent l’inhibition de la peroxydation non enzymatique des acides gras poly-insaturés nécessaires pour l’activation de ces oxygénases ce qui provoque un effet anti-inflammatoire (Formica et Regelson, 1995).
Certains travaux suggèrent qu’ils posséderaient une bonne activité anti-inflammatoire sans des effets indésirables de type ulcérogène (Ghedira, 2005).
Matériel et méthodes
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III : Matériel et méthodes III.1. Matériel
III.1.1. Matériel végétal
Les feuilles de P. lentiscus L. ont été collectées en mois de Mars 2017 dans la région d’El M’Zaïr, wilaya de Jijel. Puis, elles ont été séchées à l’abri de la lumière et stockées à température ambiante dans un endroit sec jusqu'à l'utilisation.
III.1.2. Matériel animal
L’expérience a été réalisée sur un effectif de 15 rats mal adultes de souche Wistar fournis par l’animalerie de l’institut pasteur, de poids compris entre 270 et 290 g. Les rats ont été répartis selon le poids en 5 lots homogènes de 3 dans des cages en plastique un mois de la nourriture standard (croquettes) et l’eau. Ces rats ont été acclimatés pendant un mois à une température ambiante avec un cycle naturel de lumière et obscurité avant l’expérimentation.
III.2. Méthodes
III.2.1. Préparation de l’extrait hydro-méthanolique
Selon Awika et al. (2005), les feuilles séchées à l'air ont été broyées à l'aide d'un broyeur électrique de marque Retsch type GM 200 pour obtenir une fine poudre. Le criblage a été réalisé avec un tamis dont le diamètre des points de suture est de 100 µm, la poudre de la plante a été conservée ensuite dans un flacon opaque afin d'éviter l'oxydation de leurs composants.
L’extraction des composés phénoliques à partir de la poudre des feuilles de la plante a été réalisée par une méthode solide-liquide selon la procédure d’Owen et Johns (1999) légèrement modifiée. Elle est réalisée en deux étapes :
III.2.1.1. Macération
La macération est une opération qui consiste à laisser la poudre du matériel végétal en contact prolongé avec un solvant pour en extraire les principes actifs. C’est une extraction qui se fait à température ambiante. 100 g de la poudre de la plante a été effectuée à température ambiante pendant 72 h dans 1000 ml de l'eau-méthanol 80/20 (v / v) à un rapport solide / liquide de 1/10 (p / v) sous agitation continue par un agitateur magnétique.
III.2.1.2. Evaporation
L'extrait hydro-méthanolique ou le macérât a été filtré par le papier wattman et donné une solution vertes foncée due à la chlorophylle (Chevoleau et al., 1992) . Ensuite, cette solution a été concentré à 40 °C dans un évaporateur rotatif de type Rotavapor ® 300 (Naczk et Shahidi, 2006).
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Après l’évaporation, l’extrait est introduit dans une étuve de type Memmert à 40 °C jusqu’à la stabilisation de son poids pour donner le poids de l’extrait brut.
Le rendement d'extraction a été calculé selon Stanojevic et al. (2009) par le rapport entre le poids de l’extrait après l’évaporation du solvant (g) et le poids de la prise d’essai (g) en poudre. Il est exprimé en pourcentage selon la formule suivante :
Où : Pf : poids de l’extrait après l’évaporation du solvant (g) P° : poids de la prise d’essai (g)
L’extrait séché a été conservé dans un petit cristallisoir sec et stérile à l’obscurité au réfrigérateur pour les tests pharmacologiques.
Le protocole de l’extraction des polyphénols est schématisé sur la figure 7.
Pf Rendement d’extraction (g/100 g de poudre) = ―× 100 P°
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III.2.2. Le criblage phytochimique de l’extrait hydro-méthanolique
Le criblage phytochimique de l’extrait hydro-méthanolique se fait par des réactions colorimétriques dans le but d’évaluer qualitativement et quantitativement le contenu en composés phénoliques de l’extrait de feuilles de P. lentiscus L.
Trois protocoles ont été suivis afin de doser les teneurs en composés phénolique totaux, flavonoïdes totaux et flavonols.
III.2.2.1. Dosage des composés phénoliques totaux
La méthode de Folin-Ciocalteu est l’une des méthodes adaptées dans la plupart des travaux concernant les antioxydants naturels, elle est considérée comme étant la meilleure méthode pour la quantification des polyphénols totaux (Spignon et al., 2007). Le principe de cette méthode repose sur la capacité d’un phénol à réduire le réactif Folin-Ciocalteu de couleur jaune constitué des acides phosphotungstique (H3PW12O40) et phosphornolybdique (H3PMo12O40) en milieu alcalin en un mélange de tungstène et de molybdène de couleur bleue. La coloration bleu produite est proportionnelle à la quantité de polyphénols présents dans l’extrait analysé (Ribérau-gayon et al., 1982).
Le dosage des composés phénoliques totaux a été déterminé par la méthode de Folin-Ciocalteu selon la procédure d’Othman et al. (2007), avec quelques modifications.
Un aliquote de 0,2 ml de l'extrait à 250 µg/ml ou solution standard a été mélangée avec 1,5 ml de réactif de Folin-Ciocalteu (1/10). Après 5 mn à température ambiante et à l’obscurité, 1,5 ml d'une solution de Na2Co3 à 7,5% ont été ajoutée au mélange. Ensuite, ce dernier a été incubé dans l'obscurité à température ambiante pendant 90 mn. L'absorbance contre un blanc a été mesurée à 750 nm. La teneur moyenne en polyphénols totaux est exprimée en mg équivalent d'acide gallique par g d’extrait brut (mg EAG/ g). Les analyses ont été effectuées 4 fois et la valeur moyenne a été calculée. Le mode opératoire est schématisé sur la figure 8.
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Figure 8 : Procédure de dosage des composés phénoliques totaux (Othman et al., 2007). III.2.2.2. Dosage des flavonoïdes
Les flavonoïdes constituent la classe la plus abondante des polyphénols dans la nature (Kumaran et Karunakaran, 2007). Le principe de leur dosage repose sur la propriété de ces composés à chélater les ions d’aluminium. En présence du chlorure d’aluminium (AlCl3), le complexe flavonoïdes-Al peut se former entre les atomes d’oxygène portés par les carbones 4 et 5 des flavonoïdes. La couleur jaune ainsi obtenue est proportionnelle à la quantité de flavonoïdes dans l’extrait (Ribérau-Gayon, 1968; Berset, 2006).
La teneur en flavonoïdes a été déterminée par spectrophotométrie selon la méthode de Djeridane et al. (2006) avec quelques modifications. Un aliquote de 1,5 ml de l'extrait à 2 mg/ml ou solution standard a été mélangée avec 1,5 ml d'AlCl3 à 2%. 30 minutes plus tard, l'absorbance contre un blanc a été déterminée à 430 nm en utilisant le spectrophotomètre de marque SPECORD® 50 PLUS. Les résultats ont été exprimés en mg équivalent de quercétine par g d'extrait brut (mg EQ/g). Les analyses ont été effectuées 4 fois et la valeur moyenne a été calculée. Le protocole est présenté dans la figure 9.
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Figure 9 : Procédure de dosage des flavonoïdes totaux (Djeridane et al., 2006). III.2.2.3. Dosage des flavonols
La teneur en flavonols a été déterminée par la méthode colorimétrique modifiée décrite par Abdel-Hameed (2009). 1 ml d’extrait à 2 mg/ml a été mélangé avec 1 ml d'AlCl3 à 2% et 3 ml d'une solution d'acétate de sodium à 5% ont été ajoutés. Le mélange a été incubé pendant 30 min à température ambiante et à l’obscurité. L'absorbance a été lue à 440 nm en utilisant le spectrophotomètre (SPECORD® 50 PLUS). Les résultats ont été exprimés en mg équivalent de quercétine par gramme d’extrait brut (mg EQ/ g). Le mode opératoire est schématisé sur la figure 10.
Figure 10 : Procédure de dosage des flavonols (Abdel-Hameed, 2009). 1,5 ml d’extrait (2 mg/ml) 1,5 ml d’AlCl3 à 2% Incubation pendant 30 mn à température ambiante et à l’obscurité Lecture à 430 nm
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III.2.3. Etude de l’activité anti-inflammatoire
Afin d’évaluer l’activité anti-inflammatoire du traitement par l’extrait hydro-méthanolique de feuilles de P. lentiscus L., deux méthodes d’études ont été utilisés :
III.2.3.1. Etude in vivo