la mobilité ionique

Agrégation de molécules biologiques : apports de la mobilité ionique

Fabien Chirot

Laboratoire des Sciences Analytiques UMR 5180 Université Lyon1 – CNRS

&

LASIM

UMR 5579 Université Lyon1 – CNRS

Collaboration: Francis Canon, Pascale Sarni-Manchado Laboratoire pour l’œnologie, INRA Montpellier

Contexte

- Agrégation des molécules biologiques:

parfois indésirable (Alzheimer, …)

- Mise en évidence et caractérisation:

En solution = diffusion, SAXS, RMN, mesures de viscosité, etc…

maison ne connaît pas la stoechimétrie des complexes

En phase gaz = spectro. de masse + spectro. d’action, mobilité ionique, échange H/D

maison n’est pas dans les conditions physiologiques

néanmoins on a des techniques d’ionisation qui préservent la conformation -Dans cet exposé: mobilité ionique+ spectro. de masse pour étudier un processus d’agrégation:

Le collage de tanins sur une protéine salivaire

=> formation d’agrégats non covalents

Mobilité ionique: Principe

E

p_gaz

L

détecteur m/z

identique

E

p_gaz

L

détecteur m/z

identique

Mobilité ionique: Principe

p_gaz

L

détecteur m/z

identique

temps

signal

• Diffusion à vitesse constante → séparation d’isomères E

K

v   K = Mobilité Ionique

Mobilité ionique: Principe

E

p_gaz

L

temps

signal

• Diffusion à vitesse constante → séparation d’isomères E

K

v   K = Mobilité Ionique

E p L E

K L v L

t_D  /  ^1  _{coll 0}

• Temps de diffusion relié à la section efficace de collision ion/gaz

détecteur

• Comparaison avec des structures d’essai calculées → détermination de la conformation

Mobilité ionique: Principe

p_He ≈ 10 Torr 1 m

piège RF cylindrique haute-pression

tube de mobilité

Dispositif expérimental

funnels

hexapole

quadrupole cellule

TOF

détecteurs

Couplage Mobilité Ionique – Spectrométrie de Masse

source electrospray

Mesure de m/z en fonction du Temps de diffusion

Traitement des résultats

Carte 2d m/z vs temps de diffusion (exemple d’une protéine: lysozyme)

40 60 80 100 120

drift time (ms)

projection

8+

18+

Traitement des résultats

Carte 2d m/z vs temps de diffusion (exemple d’une protéine: lysozyme)

40 60 80 100 120

drift time (ms)

E p L E

K L v L

t_D  /  ^1  _{coll 0}

projection

Mesure de distributions de sections efficaces en fonction de m/z

2000 2500 3000 3500

Collision cross-section (Ų)

8+

18+

8+

18+

Contexte: Astringence et Agrégation

-Astringence des vins (et autres aliments)

=> Présence de polyphénols (tanins) - interaction tanin/protéines salivaires

=> agrégation

= mécanisme de défense contre les tanins indigestes - Processus d’agrégation?

- protéines salivaires = astructurées (riches en proline)=> étude structurale difficile

- complexes => multiples stoechiométries: en solution mélange de différentes espèces

Études en solution

-RMN

=> interactions entre tanins (empilement de cycles aromatiques)

=> Interactions tanins/protéines pas de site spécifique identifié mais il semble que le motif …-Pro-Pro-… soit favorable

Baxter et coll. Biochemistry (1997).

Études en solution

- Diffusion, SAXS, etc…

=> agrégation avec l’addition de tanins

Pas de tanin

Concentration en tanins

Taille moyenne mesurée

Charlton et coll. J. Agric. Food Chem (2002).

Jöbstl et coll. Biomacromolecules (2004).

complexes protéine/tanin

dimères

protéine/tanin colloïde

insoluble

But des manips de mobilité ionique

- étude en phase gaz => connaître précisément la stoechiométrie des complexes

- évolution de la conformation lors de la complexation

- premiers stades du processus d’agrégation?

Modèle étudié

IB5 (a 6923.70, b 6642.63 and c 6360.39 Da)

[IB5a]⁷⁺

[IB5a]⁹⁺

[IB5a]⁸⁺

[IB5a]⁶⁺

[IB5b]⁷⁺

[IB5b]⁶⁺

[IB5b]⁸⁺

[IB5b]⁹⁺

[IB5c]⁷⁺

[IB5c]⁸⁺

[IB5c]⁶⁺

[IB5c]⁹⁺

Plusieurs isoformes:

Protéine: IB5

Epigallocatechin gallate (Mw 458)

Tanin: EGCG

Résultats expérimentaux - IB5/EGCG

1000 1200 1400 1600

m/z [IB5a]⁷⁺

[IB5a+9EgCG]⁷⁺

[IB5a+EgCG]⁷⁺

0 1000 2000

0 1000 2000 0 1000 2000 0 1000 2000

4n 7n 10n

0n 15n

[M+T

+6H]

[M+T

+7H]

[M+T

+8H]

[M+T

+9H]

Collision cross-section (Ų) n=15

n=10

n=5

n=0

Résultats expérimentaux - IB5/EGCG

0 500 1000 1500 2000 15

14

0 1 2 3

Number of tannins

13 12 11 10 9 8 7 6 5 4

Résultats expérimentaux - IB5/EGCG

0 500 1000 1500 2000 15

14

0 1 2 3

Number of tannins

13 12 11 10 9 8 7 6 5 4

- Section efficace relativement élevée

(en accord avec une conformation dépliée)

Résultats expérimentaux - IB5/EGCG

0 500 1000 1500 2000 15

14

0 1 2 3

Number of tannins

13 12 11 10 9 8 7 6 5 4

- Section efficace relativement élevée

(en accord avec une conformation dépliée) -Lente augmentation de la section efficace avec le nombre de tanins

- Apparition de conformations compactes pour des degrés de complexation élevés

Résultats expérimentaux - IB5/EGCG

0 500 1000 1500 2000 15

14

0 1 2 3

Number of tannins

13 12 11 10 9 8 7 6 5 4

6923 Da 13793Da

- Section efficace relativement élevée

(en accord avec une conformation dépliée) -Lente augmentation de la section efficace avec le nombre de tanins

- Apparition de conformations compactes pour des degrés de complexation élevés

Résultats expérimentaux - IB5/EGCG

0 500 1000 1500 2000 15

14

0 1 2 3

Number of tannins

13 12 11 10 9 8 7 6 5 4

6923 Da 13793Da

- Section efficace relativement élevée

(en accord avec une conformation dépliée) -Lente augmentation de la section efficace avec le nombre de tanins

- Apparition de conformations compactes pour des degrés de complexation élevés

Résultats expérimentaux - IB5/EGCG

Modèle « gros grains grossier»:

- 1 acide aminé = 1 grain - 1 tanin = 1 grain

Interactions Lenhardt-Jones - attractive tanin/acide aminé

- attractive ou répulsive entre les tanins

=> tester l’effet de l’agrégation de monomère ou de polymères sur la conformation

Recherche conformationnelle:

Replica-Exchange Monte-Carlo avec un biais sur le rayon de gyration

=> guider l’exploration vers les résultats expérimentaux

Modélisation - IB5/EGCG

6 Tanins 13 Tanins 14 stacked Tanins

8 stacked Tanins

Modélisation - IB5/EGCG

0 500 1000 1500 2000 15

14

0 1 2 3

Number of tannins

13 12 11 10 9 8 7 6 5 4

Collage de tanins empilés Collage de tanins uniques

 Repliement autour des tanins

= compatible avec une structure compacte

Dépliement pour pouvoir fixer des tanins

= incompatible avec une structure compacte

Agrégats de tanins

Epigallocatechin gallate (Mw 458)

Forme des agrégats en solution (ici jusqu’à 14 tanins)

Tanin: EGCG

500 1000 1500 2000 2500 3000 3500

0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0

signal (arb.)

m/z

2+

1+

0 500 1000 1500 2000 15

14

0 1 2 3

Number of tannins

13 12 11 10 9 8 7 6 5 4

Résultats expérimentaux - IB5/EGCG

Discussion « avec les mains » - IB5/EGCG

- 8 sites potentiels de fixation

=> collage possible de 8 EGCG, puis il faut coller des dimères (voire plus…)

Conclusion

-Évolution de la conformation d’agrégats protéine/tanins dans les premiers stades de l’agrégation

- d’abord augmentation de la section efficace si le nombre de tanins augmente - Puis apparition de conformations plus compactes à partir de 8-9 tanins

- Explication possible = 2 régimes:

1. Collage de tanins seuls jusqu’à saturation des possibilités de complexation

2. Collage d’agrégats de tanins

complexes protéine/tanin

Remerciements

Laboratoire pour l’œnologie, Montpellier:

Francis Canon, Pascale Sarni-Manchado LASIM:

Ph. Dugourd R. Antoine Doctorants:

- R. Ballivian - F. Albrieux

LSA:

J. Lemoine