HAL Id: tel-01941709
https://tel.archives-ouvertes.fr/tel-01941709
Submitted on 2 Dec 2018HAL is a multi-disciplinary open access archive for the deposit and dissemination of sci-entific research documents, whether they are pub-lished or not. The documents may come from teaching and research institutions in France or abroad, or from public or private research centers.
L’archive ouverte pluridisciplinaire HAL, est destinée au dépôt et à la diffusion de documents scientifiques de niveau recherche, publiés ou non, émanant des établissements d’enseignement et de recherche français ou étrangers, des laboratoires publics ou privés.
Maladie d’Alzheimer et polyphénols : effet des tanins sur
la phosphorylation de la protéine Tau
Charlotte Fleau
To cite this version:
Charlotte Fleau. Maladie d’Alzheimer et polyphénols : effet des tanins sur la phosphorylation de la protéine Tau. Chimie organique. Université de Bordeaux, 2017. Français. �NNT : 2017BORD0776�. �tel-01941709�
1
THÈSE PRÉSENTÉE POUR OBTENIR LE GRADE DE
DOCTEUR DE
L’UNIVERSITÉ DE BORDEAUX
ÉCOLE DOCTORALE DES SCIENCES CHIMIQUES SPÉCIALITÉ : CHIMIE ORGANIQUE
Par Charlotte FLEAU
MALADIE D’ALZHEIMER ET POLYPHENOLS :
Effet des tanins sur la phosphorylation de la protéine Tau.
Sous la direction de : Magali SZLOSEK
Soutenue le 1er Décembre 2017
Membres du jury :
M. MERILLON, Jean-Michel Professeur, Université de Bordeaux Président
Mme ENJALBAL, Christine Professeur, Université de Montpellier Rapporteur
Mme GRIMAUD, Laurence Directrice de Recherche, ENS (Paris) Rapporteur
Mme LANDRIEU, Isabelle Directrice de Recherche, Université de Lille Examinateur
2
Remerciements
Je tiens d’abord à remercier Christine Enjalbal, Professeur à l’Université de Montpellier, et Laurence Grimaud, Directrice de recherches à l’Ecole Normale Supérieure de Paris, d’évaluer mon manuscrit de thèse. Je remercie également Patrick Toullec, Professeur à l’Université de Bordeaux d’avoir accepté de présider mon jury de thèse. Je souhaite également remercier Jean-Michel Merillon, Professeur à l’Université de Bordeaux, et Isabelle Landrieu, Directrice de Recherche à l’Université de Lille, d’avoir accepté de faire partie des membres de mon jury de thèse.
Je tiens particulièrement à remercier Magali Szlosek, ma directrice de Thèse, pour m’avoir accordé sa confiance sur ce beau projet, et ce depuis la Licence. Cela fait désormais 8 ans que je connais Magali puisque c’est elle qui m’a donné mes premiers cours de Chimie à l’Université de Bordeaux. Ses cours m’ont vraiment donné goût à la Chimie et aux Sciences du vivant et je l’en remercie car c’est avec des enseignants de cette qualité que l’envie d’apprendre nous envahit ! Pendant la thèse son enseignement m’a encore été profitable et ses qualités de directrice m’ont vraiment permis de m’épanouir pleinement pendant ces trois années ! Merci encore et mon souhait maintenant est qu’elle trouve quelqu’un pour faire continuer de vivre ce projet.
Je remercie également le Professeur Eric Fouquet, Directeur de l’ISM, pour m’avoir accueillie au sein de l’équipe CSH ! Pendant ces trois ans il m’a fait part de ses connaissances et de ses conseils. Tout comme Magali je le connais depuis mes premiers pas à l’Université et c’était un vrai plaisir de suivre ses cours. Toujours très joyeux c’était vraiment agréable de travailler avec Eric.
Lors de ma thèse, j’ai passé une semaine à Lille dans le laboratoire d’Isabelle Landrieu et je l’en remercie. Elle m’a apporté de nouvelles connaissances en RMN et en synthèse de Protéines en prenant vraiment le temps de tout bien m’expliquer. Travailler pendant ces quelques jours avec Isabelle était vraiment une belle expérience et je la remercie grandement de m’avoir accueillie aussi chaleureusement. Merci aussi pour l’aide à la rédaction de notre publication, on y est presque !
3
En parlant de RMN, je remercie Isabelle Pianet qui a dirigé ma thèse la première année. Même si cela fût bref c’était une très bonne expérience qui m’a permis d’acquérir de nouvelles connaissances et compétences avec cet outil indispensable pour nous chimistes ! Je remercie Murielle Berlande, la maman du labo et technicienne en chef du groupe CSH de toujours être là pour nous les petits thésards ! Je tiens particulièrement à la remercier pour les synthèses peptidiques, cela n’a pas toujours été facile et il y en a un qui nous a résisté mais elle n’a jamais baissé les bras ! Elle est super notre Mumu !! Ils ont vraiment de la chance les prochains étudiants.
Je tiens également à remercier les différents permanents de l’équipe, Patrick Toullec, Philippe Hermange et Frédéric Cantagrel. Toujours plein d’idées et un partage immense de connaissances, on a beaucoup de chance de les avoir ! Là aussi la bonne humeur partagée permet de travailler dans de très bonnes conditions. Une équipe CSH en Or avec laquelle on a beaucoup partagé autour des barbecues annuels !
Je remercie Cybille et Yannick, responsables du plateau RMN de m’avoir laissé utiliser les spectros quand j’en avais besoin et ce de manière très arrangeante ! Mais aussi pour leurs conseils et connaissances en RMN. A Cybille, que j’ai rencontré pendant mon stage de Licence quand elle était doctorante dans l’équipe, gardes cette super bonne humeur que tu nous partages tous les jours ! Et merci de m’aider pour la suite, maintenant la RMN n’a plus de secrets pour toi !
Je remercie également le service masse du Cesamo, Claire et Patricia, pour m’avoir caractérisé mes produits et pour m’avoir laissé le MALDI pour mes nombreux tests ! C’était très agréable de travailler avec elles !
Bien entendu, le Cesamo c’est aussi sa directrice, Christelle. Je tiens particulièrement à la remercier car c’est grâce à elle que j’ai acquéri de nouvelles compétences en masse. Très patiente, elle m’a partagé plein de connaissances et cela vaut un gros Merci ! Il en faut aussi un pour toute la mise au point du procédé de suivi car cela n’a pas été toujours simple, mais elle a toujours trouvé des solutions !
Je remercie également les artistes de notre laboratoire, les doctorants avec qui j’ai partagé un peu de temps, pour certains se sont devenus de vrais amis ! Tout d’abord Thomas, qui a été avec moi dès que je suis arrivée, sa bonne humeur a toujours été très plaisante au labo et je le remercie de m’avoir bien accueillie au début de ma thèse. Je te souhaite le meilleur avec ta
4
petite famille ! Ensuite, Marion arrivée au cours de ma deuxième année, un peu de girl power dans ce labo de garçons ! Et enfin Julien et Nicolas arrivés sur ma dernière année, bien trop tard je trouve ! On a bien rigolé ! Je remercie aussi les membres de l’équipe du Pr Yannick Landais, Jonathan, Vincent, Anthony, Chahinez et Lisa pour la bonne humeur au quotidien ! J’ai également une pensée pour mes stagiaires ! Les masters : Paloma, il lui en a fallu du courage pour la mise au point de la chloration, Alexia et Marine qui ont tout donné pour la click. Les licences : Hervé, Prisca et Maxime qui ont fait beaucoup de start mat, pas toujours facile, c’est ça être un chimiste !! Merci à eux.
Un grand merci à ma famille, mes parents et mes sœurs qui ont toujours été là pour moi et qui ont accepté mes choix. Merci pour votre soutien, je vous aime ! Un grand merci aussi à ma belle-famille adorée qui eux aussi font preuve d’un grand soutien dans cette épreuve.
Merci aussi à mes amis particulièrement à Morgane, toujours d’un grand soutien et avec qui je partage des grands moments de complicité depuis le collège. Je remercie aussi ma petite Pops avec qui j’ai partagé le Master ici à Bordeaux, ma miss potin en tout genre et son super mari, Bastien. Merci à ma Hélène que je ne vois pas souvent mais avec qui je suis toujours aussi proche. Je remercie aussi ma petite Mathilde avec qui on partage beaucoup depuis le collège ! Merci aussi à tous les autres !
Enfin, le dernier mot revient à mon Alexis, membre de notre groupe et avec qui je partage de merveilleux moments depuis plus d’un an. Merci d’être là pour moi pour cette dernière épreuve, merci d’être là à mes côtés tous les jours, merci d’embellir mes journées… Il y en à beaucoup d’autres dire mais tu sais l’essentiel. Ce n’est que le début d’une belle histoire !
5
Table des matières
Abréviations ... 7 Introduction Générale ... 11 Bibliographie ... 15 I. La Maladie d’Alzheimer ... 16 1) Généralités ... 16 2) La protéine Tau ... 20 a) Structure et rôles ... 20
b) Les modifications post traductionnelles ... 23
II. Les polyphénols ... 39
1) Généralités ... 39
a) Classification des polyphénols ... 39
b) Structure des procyanidines ... 42
c) Les polyphénols et la santé ... 44
2) Les polyphénols et la MA : données initiales ... 47
a) Les Polyphénols et les plaques amyloïdes ... 48
b) Les Polyphénols et la Protéine Tau ... 50
3) Interactions polyphénols-Tau : Informations moléculaires ... 52
a) Origine de l’étude ... 52
b) Procyanidines et Protéine Tau... 54
Résultats ... 59
I. Synthèses des Polyphénols ... 60
1) Synthèses de dimères de type C4-C8 ... 60
a) Stratégie de Synthèse ... 60
b) Synthèse des monomères fonctionnalisés ... 62
2) Synthèse d’un dimère de type C4-C6 ... 78
a) Tests de reproductibilité de la synthèse du B6 selon Suzuki ... 80
b) Mise au point de la synthèse du B6... 84
II. Etudes d’interactions peptides/polyphénols par RMN ... 105
1) Généralités ... 105
2) Interactions Polyphénols et P1P2 ... 109
a) Caractérisation de P1P2 ... 109
6
3) Interactions Polyphénols et Tau intégrale ... 124
a) Biosynthèse de la protéine Tau marquée à l’azote 15 ... 125
b) Tests d’interactions ... 129
III. Etudes de la phosphorylation des peptides modèles par Spectrométrie de Masse .. 134
1) Choix des enzymes ... 135
2) Mise au point de la phosphorylation sur les peptides P1 et P2 ... 138
3) Détermination du site de phosphorylation ... 152
4) Inhibition de la phosphorylation ... 156
5) Mise au point de la phosphorylation sur P1P2 ... 161
IV. Etudes du passage des polyphénols à travers la BHE ... 165
1) Généralités ... 165
2) Les modèles de BHE ... 166
3) Polyphénols et TEP ... 172
a) Chimie « click » et polyphénols ... 178
b) Silylation directe des polyphénols en position 8 ... 187
Conclusions et Perspectives ... 193
Experimental Section ... 197
Annexes ... 243
7
Abréviations
A : Amyloïde AB : Alcool Butargylique ACN : ACétoNitrile
ADN : Acide DésoxyriboNucléique ADP : Adénosine DiPhosphate
AFM : Microscopie à Force Atomique AP : Alcool Propargylique
APP : Amyloid Precursor Protein
ARNm : Acide RiboNucléique messager ATP : Adénosine TriPhosphate
BHE : Barrière Hémato-Encéphalique °C : degré Celsius
CDK5 : Cyclin-Dependent Kinase 5 CE : Cellules Endothéliales
CHIP : Carboxyterminus of Hsc 70 Interacting Protein CK : Caséine Kinase
CMC : Concentration Micellaire Critique COSY : COrrelation SpectroscopY d : day DCC : DiCyclohexylCarbodiimide DCM : DiChloroMéthane DDQ : DichloroDicyanoQuinone DIC : DIisopropylCarbodiimide DIEA : DIEthylAmine
8 DIPEA : DIisoPropylEthylAmine
DMAP : DiMéthylAminoPyridine DMF : DiMéthylFormamide
DNF : Dégénérescences NeuroFibrillaires DOSY : Diffusion Order SpectroscopY
DYRK1A : Dual specificity tyrosine-phosphorylation-Regulated Kinase 1A ECG : EpiCatéchine Gallate
EDCI : 1-Ethyl-3-(3-Diméthylaminopropyl)CarbodIimide EGCG : EpiGalloCatéchine Gallate
EtOAc : Ethyl Aetate EtOH : Ethanol éq : équivalents
ERO : Espèces Réactives de l’Oxygène eV : électron-Volts
FDA : Food and Drug Administration FDG : FluoroDésoxyGlucose
g : grammes
GlcNAc : N-ActétylGlucosamine GSK3 : Glycogène Synthase Kinase 3 GTP : Guanosine TriPhosphate h : heures
HBTU : (2-(1H-Benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-TétramethylUronium Hexafluorophosphate HHDP : acide Hexa-Hydroxy-DiPhénique
HMBC : Heteronuclear Multible Bond Correlation HPLC : High Performance Liquid Chromatography HSP : Heat Shock Protein
9 Hz : Hertz
IC50 : Concentration Inhibitrice médiane
j : jours K : Kelvin kDa : kiloDalton L : Litres LC : Liquid Chromatography M : mol. L-1 MA : Maladie d’Alzheimer
MAP : Microtubule-Associated Proteins
MAP kinases : Mitogen-Activated Protein kinases MARK : Microtubule Affinity-Regulating Kinases MEB : Microscopie Electronique à Balayage mn : minutes
MS : Spectrométrie de Masse MW : Micro-ondes
NBS : N-BromoSuccinimide NCS : N-ChloroSuccinimide NOE : Nuclear Overhauser Effect
NOESY : Nuclear Overhauser Effect SpectroscopY OGA : O-GlcNAcase
OGT : O-GlcNAc transferase p : page
PDPK : Proline-Directed Protein Kinases PEG : PolyEthylèneGlycol
pH : potentiel Hydrogène
10 PHF : Paired of Helical Filaments
pI : point Isoélectrique PK : Phosphorylase Kinase PP2A : Protéine Phosphatase 2A PRP : Protéine Riche en Prolines pTau : Tau phosphorylée
PTC : PhénylisoThioCyanate PTH : PhénylThioHydantoïne
RMN : Résonnance Magnétique Nucléaire rt : room temperature
STD : Saturation Transfer Difference SF : Straight Filaments
t : temps
T : Température
ta : température ambiante tR : temps de Rétention
TEP : Tomographie par Emissions de Positons term : terminal
TFA : acide TriFluoroAcétique THF : TétraHydroFurane TMS : TriMéthylSilyle
TOCSY : TOtal Correlation SpectroscopY TPK : Tyrosine Protein Kinases
TTBK: Tau-TuBulin Kinases UDP : Uridine DiPhosphate W : Watts
11
12
La maladie d’Alzheimer (MA) est une maladie neurodégénérative caractérisée par une perte neuronale et par l’accumulation d’agrégats de protéines dans certaines régions du cerveau.[1] Ces physiopathologies entraînent une altération des capacités cognitives, comme la perte de la mémoire, du langage, du raisonnement ou encore de l’orientation dans le temps ou dans l’espace.[2] L’extension de la maladie provoque un déclin progressif de l’autonomie du patient. Les premiers neurones atteints dans la MA sont ceux situés dans l’hippocampe, zone responsable de la mémoire, c’est pour cela que cette maladie est la forme la plus connue de démence dont le premier facteur de risque est l’âge. En effet, 5% de la population est affectée à partir de 65 ans et 20% à partir de 80 ans. A l’heure actuelle, 30 millions de personnes souffrent de cette maladie et des études montrent que l’on devrait atteindre 100 millions d’ici 2050.[3] Malgré de nombreuses recherches visant à caractériser la MA et à développer d’éventuelles thérapies depuis plusieurs années, il n’existe à ce jour aucun traitement contre cette maladie qui est la 4ème cause de décès dans le monde. A ce jour, la MA ne peut être
confirmée sans ambiguïté qu’après le décès du patient, alors que les premières lésions cérébrales apparaissent 10 à 15 ans avant l’apparition des symptômes ou manifestations cliniques.[4]
C’est pour ces différentes raisons qu’il est à ce jour essentiel de trouver des outils permettant la détection de la maladie d’Alzheimer de manière plus précoce ce qui devrait permettre à la fois de la prévenir de manière plus efficace ainsi que de trouver finalement une thérapie. La pathogenèse de la maladie reste encore assez floue à ce jour. Toutefois, il a été montré que deux protéines, la amyloïde et la protéine Tau, seraient à l’origine de la MA. Dans le cas de la protéine Tau, une hyper phosphorylation de celle-ci serait à l’origine de la désorganisation des neurones et d’une dégénérescence dite neuro-fibrillaire qui entrainerait, à terme, la mort des neurones. L’origine de l’hyper phosphorylation n’est pas clairement élucidée à ce jour, mais un déséquilibre entre l’activité des kinases, enzymes responsables de la phosphorylation, et des phosphatases, enzymes responsables de la déphosphorylation, en serait une des causes.[5]
Les polyphénols sont connus comme étant des substances à activités biologiques diverses telles que antibiotique, antivirale, anticancéreuse, antidiabétique et ils se sont de plus avérés être des neuroprotecteurs.[6] Certaines études montrent que les polyphénols pourraient être des inhibiteurs de l’agrégation de la protéine Tau, responsable de la formation de la dégénérescence neuro-fibrillaire.[7] Des travaux antérieurs, effectués au sein de l’équipe, ont
13
montré que les flavanols sont capables d’interagir avec des fragments de la protéine Tau et plus particulièrement avec des fragments issus de la région riche en proline qui est fortement impliquée dans l’hyper phosphorylation de Tau.[8]
Suite à ces résultats obtenus dans la littérature et au laboratoire, il a été envisagé de poursuivre ces travaux de manière à corréler les résultats initiaux d’affinités polyphénols/Tau et leurs capacités d’inhibitions de la phosphorylation via l’utilisation de peptides modèles issus de la région riche en proline. En parallèle de ces travaux, il a été initié une étude sur la possibilité de synthétiser des dérivés fluorés des flavanols ayant manifestés les meilleures affinités en vue d’accéder ultérieurement à des radiotraceurs pour l’imagerie TEP. Dans l’optique de diversifier les structures des polyphénols testés, il a été également mis au point une voie d’accès efficace pour l’obtention du dimère B6, à jonction C4-C6.
Dans une première partie bibliographie vont être décrites les généralités sur la MA ainsi que sur la protéine Tau, en décrivant de manière précise le processus de phosphorylation. La bibliographie permettra également d’introduire les polyphénols puis de voir comment ils sont d’ores et déjà utilisés dans le cas des différentes physiopathologies de la MA. Dans une seconde partie seront présentés les résultats obtenus au cours de ces travaux de thèse en explicitant tout d’abord les synthèses des différents dimères et notamment du B6. Ensuite, les résultats des études RMN sur les peptides ainsi que sur la protéine Tau seront présentés. Un troisième point présentera les tests d’inhibition de la phosphorylation suivis par spectrométrie de masse et enfin l’étude sur le passage des polyphénols à travers la BHE sera explicitée.
15
16
I. La Maladie d’Alzheimer
1) Généralités
La maladie d’Alzheimer, décrite pour la première fois par Aloïs Alzheimer en 1906, est une dégénérescence des neurones qui débute au niveau de l’hippocampe et s’étend au reste du cerveau. Celle-ci implique une détérioration de la mémoire et est caractérisée par une neuro-dégénérescence progressive en raison d’importantes atrophies neuronales avec perte concomitante de synapses dans différentes régions du cerveau, conduisant à terme à une atrophie cérébrale généralisée.[4] La physiopathologie de la maladie est à ce jour encore au cœur de nombreuses études de par sa complexité et de par les nombreux facteurs impliqués. En effet, de nombreux dérèglements biologiques vont être à l’origine de la maladie dont le stress oxydatif lié à un disfonctionnement mitochondrial[9], la neuro inflammation engendrée par une activation de la réponse des cellules gliales[9] ou encore la diminution parfois massive de neurotransmetteurs. L’étude du cerveau de patients atteints de la MA, a montré deux types de lésions caractéristiques : les plaques amyloïdes et les dégénérescences neurofibrillaires.
Les plaques amyloïdes, également appelées plaques séniles, sont composées d’un petit
peptide de 4kDa, le amyloïde (A).[10] Ce peptide est généré physiologiquement à partir d’une glycoprotéine membranaire, l’APP (amyloid precursor protein) localisée principalement autour des synapses et dont le rôle est crucial pour la plasticité neuronale et pour la formation des synapses.[11] Dans un neurone sain cette protéine va être clivée par deux enzymes, l’ et la sécrétases, conduisant à la forme soluble de l’APP (sAPP) ayant un rôle important dans la neuroprotection.[12] Certaines mutations de l’APP, des facteurs environnementaux, le stress oxydatif ou encore un dysfonctionnement de l’appareil de Golgi vont être à l’origine de la formation de peptides toxiques.[13] En effet, un double clivage de la protéine est réalisé par la sécrétase et par la sécrétase conduisant à la formation de deux peptides amyloïdogéniques Ade 40 et 42 acides aminés, le peptide A42 se trouvant être la forme la plus toxique.[14],[15] Dans le cas de la MA, les peptides Avont s’agréger dans le milieu extracellulaire et ce dépôt serait à l’origine de la « cascade amyloïde » décrite pour la première fois par Hardy et Higgins en 1992(Fig. 1).[16] Selon certaines hypothèses, ce dépôt engendrerait l’activation de certaines enzymes, comme la GSK3 (kinases) à l’origine de l’hyper phosphorylation de Tau puis de son agrégation conduisant à la perte neuronale et à la démence.[17]
17
Figure 1 : La cascade amyloide.
Les dégénérescences neurofibrillaires sont localisées à l’intérieur de la cellule neuronale et
sont composées de protéines Tau hyper phosphorylées. Tau est principalement localisée dans les neurones et appartient à la famille des protéines liées aux microtubules (MAP : Microtubule-Associated Proteins). Le rôle de la protéine est de permettre la polymérisation ainsi que la stabilisation des microtubules. La phosphorylation de Tau est un processus régulé du stade fœtal à l’adulte permettant d’accroître l’affinité de la protéine pour les microtubules et concerne notamment les résidus sérines et thréonines. L’hyper phosphorylation de Tau est un phénomène observé chez les patients atteint de la MA et la cause principale serait un déséquilibre entre l’activité des kinases et des phosphatases.[12] Ce dysfonctionnement enzymatique est à l’origine de la baisse d’affinité de Tau pour les microtubules et, une fois décrochée des microtubules, la protéine va s’agréger sous formes de filaments appelés PHF (Paired of Helical Filaments) formant les DNF (Dégénérescences NeuroFibrillaires).[18] Cette cascade d’évènements affecte les fonctions cellulaires normales des neurones comme le maintien de la morphologie cellulaire, la transmission synaptique et le transport axonal conduisant à terme à la mort du neurone (Fig. 2).
Plaques amyloides et réponses inflamatoires Membrane Cellulaire Secrétases et Agrégation Mort du neurone Domaine A A40 A42 N C APP Hyper Phosphoryation De Tau Agrégation de Tau Milieu extracellulaire Milieu intracellulaire
18
Figure 2 : Représentation de la dégénérescence neurofibrillaire.
A ce jour, la cause exacte de l’apparition de la maladie reste encore inconnue. Il peut toutefois être noté que des facteurs environnementaux (stress oxydatif, commotion cérébrale, médicaments…) ou des facteurs biologiques (génétique, réponse inflammatoire anormale…) peuvent promouvoir la MA.[19],[20] En effet, malgré d’intenses recherches et de conséquents progrès dans la compréhension du mécanisme moléculaire exact de la maladie, on ne peut encore définir de manière complète son origine. A ce jour, d’importantes avancées ont été faites pour comprendre les processus moléculaires et biologiques régissant la formation de la cascade amyloïde et l’hyperphosphorylation de la protéine Tau. Toutefois, malgré des découvertes majeures sur ces physiopathologies caractéristiques, il n’existe à ce jour aucun traitement contre la maladie d’Alzheimer et 11 molécules testées sur ces dernières années ont échoué lors des tests pré-cliniques.[9] Pendant de nombreuses années la recherche s’est focalisée sur l’inhibition de la formation des plaques séniles afin de perturber la cascade amyloïde. En 2012 deux anticorps capables de cibler les peptides A, le Bapineuzumab et le Solanezumab, ont échoué en phase III des essais cliniques.[21],[22] La cause de cet échec serait liée à l’action dirigée vers une étape trop tardive dans le processus amyloïde ou dans le ciblage unique du peptide A qui ne suffirait pas à stopper le processus neurodégénératif.[4] En effet, des études ont montré qu’un lien existait entre la formation d’agrégats de peptides A et la toxicité de la protéine Tau et qu’il est donc crucial de cibler également l’agrégation
19
de la protéine Tau pour empêcher le déclin cognitif.[7] De plus, de nombreuses recherches démontrent que la formation des dégénérescences neurofibrillaires serait la cause principale de la MA, de par leur absence dans un cerveau sain, associée à leur localisation intracellulaire et de par le fait que leur densité seraient directement corrélée au stade de la démence.[23] C’est pour ces raisons que de nombreuses équipes essayent, depuis quelques années, de trouver des inhibiteurs d’agrégation de la Protéine Tau.
20
2) La protéine Tau
La protéine Tau a été découverte dans les années 70 dans le cadre de l’étude de la formation des microtubules.[24] Tau est une protéine hydrophile appartenant à la famille des protéines associées aux microtubules (MAPs). Elle est principalement retrouvée dans les neurones et plus particulièrement dans les axones et dans les dendrites.[25] Toutefois, Tau peut être trouvée à l’état de traces dans certaines cellules non neuronales.[1]
a) Structure et rôles
Le gène codant pour la protéine Tau est situé sur le chromosome 17 en position 17q21 et, à l’issue de l’épissage alternatif, l’ARNm conduit à la formation de 6 isoformes dans le cerveau humain (Fig. 3).[26] Ils sont composés de 352 à 441 acides aminés et leurs poids moléculaires respectifs se situent entre 45 et 65kDa. Ces isoformes diffèrent par la présence de trois ou quatre séquences de répétitions (R1-R4 composés de 31 ou 32 résidus) dans la région C-terminale de la protéine et par l’absence ou par la présence de 1 ou 2 inserts (29 ou 58 acides aminés) dans la région N-terminale.[27] Par la présence ou l’absence de certaines régions, les isoformes de Tau vont avoir des rôles physiologiques différents. De plus, ces isoformes sont exprimés de manières différentes au cours du développement. Par exemple, l’isoforme composé de 3 séquences de répétitions et n’ayant pas d’inserts dans la région N-terminale est le seul existant au stade fœtal. Toutefois, les 6 isoformes sont exprimés à l’âge adulte.[28]
Figure 3 : Représentation des 6 isoformes de Tau. Fœtale Adulte 352 381 383 410 412 441 1 1 1 1 1 1 R1 R2 R3 R4
21
Quel que soit l’isoforme, la protéine Tau peut être divisée en deux larges domaines : le domaine de liaison aux microtubules et le domaine de projection (Fig. 4).
MAEPRQEFEV10 MEDHAGTYGL20 GDRKDQGGYT30 MHQDQEGDT40 AGLKESPLQT50 PTEDGSEEPG60 SETSDAKSTP70 TAEDVTAPLV80 DEGAPGKQAA90 AQPHTEIPEG100 TTAEEAGIGD110 TPSLEDEAAG120 HVTQARMVSQ130 SKDGTGSDDK140 KAKGADGKTK150 IATPRGAAPP160 GQKGQANATR170 IPAKTPPAPK180 TPPSSGEPPK190 SGDRSGYSSP200 GSPGTPGSRS210 RTPSLPTPPT220 REPKKVAVVR230 TPPKSPSSAK240
SRLQTAPVPM250 PDLKNVKSKI260 GSTENLKHQP270 GGGK VQIINK280 KLDLSNVQSK290 CGSKDNIKHV300
PGGGS VQIVY310 KPVDLSKVTS320 KCGSLGNIHH330 KPGGGQV EVK340 SEKLDFKDRV350 QSKIGSLDNI360
THVPGGGNKK370 IETHKLTFRE380 NAKAKTDHGA390 EIVYKSPVVS400 GDTSPRHLSN410 VSSTGSIDMV420
DSPQLATLAD430 EVSASLAKQG440 L
Figure 4 : Représentation de la Protéine Tau et séquence de l’isoforme 441.
Diverses études ont montré que cette protéine est complètement désorganisée ce qui va la rendre particulièrement flexible.[24] Tau est un dipôle composé de deux domaines dont les charges sont opposées comme le traduisent les points isoélectriques du domaine N-term : pI = 3.8, de la Région Riche en Prolines (RRP) pI = 11.4 et du domaine C-term 10.8.
1. Domaine de projection
Le domaine de projection se caractérise par l’absence ou la présence de deux inserts (E2 et E3). Ces inserts, composés de 29 acides aminés, ont la particularité d’être fortement acide et ils sont suivis par une région basique composée majoritairement de prolines (RRP). Le domaine de projection se situe à la surface du microtubule ce qui lui confère la propriété d’interagir avec des éléments du cytosquelette et avec la membrane plasmique. Ces interactions sont possibles car la protéine Tau est liée à des filaments d’actine et de spectrine (protéines composant le cytosquelette) ce qui permet une connexion entre les microtubules et des éléments du cytosquelette comme les neurofilaments (fibres permettant le soutien du neurone).[4] Cela a également un impact sur la flexibilité des microtubules. Il a aussi été
441 RRP
1
Domaine de projection Domaine de liaisons
E3 R4 E2 R1 R2 RRP R1 R2 R3 E2 E3 R3 R4
22
démontré que ce domaine permet de contrôler l’espacement entre les microtubules ce qui influe donc sur le diamètre des axones. Ces résultats montrent l’importance de cette région N-terminale dans la stabilisation et l’organisation des axones. Rappelons que l’axone a un rôle primordial dans le bon fonctionnement du neurone car celui-ci permet notamment le transport de certaines molécules, d’organelles, de neurofilaments ou encore de vésicules.[29] Des études montrent que la protéine Tau a également un rôle dans la transduction de signal neuronal. Dans ce cas c’est la région riche en proline qui serait impliquée. En effet, cette région interagirait avec certaines enzymes et plus particulièrement des kinases comme la Fyn (protéine ciblant des tyrosines) appartenant à la famille des Src-kinases.[1] Cette interaction entraine une modification de la forme des neurones en agissant sur l’actine présente au niveau du cytosquelette.
2. Domaine de liaison.
La protéine Tau se lie aux microtubules par le biais des séquences de répétition situées dans la partie C-terminale. Les isoformes de Tau peuvent posséder 3 ou 4 séquences de répétition qui sont composées de 18 résidus hautement conservés et sont séparées par 13 ou 14 résidus. Par le biais de ces séquences de répétition, la protéine Tau est capable de se lier aux microtubules, ce qui a pour effet de les stabiliser. Cette stabilisation est cruciale car les microtubules permettent une conservation de la morphologie cellulaire, notamment au niveau des axones, ce qui a un effet direct sur le transport de molécules ou d’organelles entre les neurones. Il a été démontré que les isoformes possédant 4 séquences de répétition ont une affinité plus importante pour les microtubules. Il est important de notifier que cette affinité Tau/Microtubule est régulée via des modifications post-traductionnelles telle que, en particulier, la phosphorylation, ce qui sera détaillé dans la seconde partie de ce chapitre. Ce domaine permet aussi la polymérisation des microtubules via les régions entre les séquences de répétition et plus spécifiquement la région située entre R1 et R2. Il a également été démontré que le domaine C-terminal avait un rôle dans la régulation de la phosphorylation de Tau. En effet, les positions 224 à 236 sont capables d’interagir à la fois avec les microtubules et avec la protéine phosphatase 2A (PP2A), une protéine capable de déphosphoryler Tau.[30] De ce fait, il existe une compétition directe entre les microtubules et la phosphatase ce qui va avoir un impact direct sur l’état de phosphorylation de la protéine. Il est possible d’imaginer qu’un déséquilibre au niveau de cette compétition peut entraîner des tauopathies.
23
Pour résumer, la protéine Tau est essentielle au bon fonctionnement des neurones, de par sa faculté à se lier aux microtubules, influençant ainsi la stabilité de ces derniers et régulée par des modifications post-traductionnelles, et de par sa capacité à interagir avec le milieu extracellulaire.
b) Les modifications post traductionnelles
Après la traduction, permettant la transformation de l’ARNm en protéine, Tau va subir diverses modifications qui vont permettre de moduler les charges de la protéine ainsi que ses différents rôles. La phosphorylation, la glycosylation sont les phénomènes les plus décrits dans la littérature mais il a été mentionné à ce jour également l’ubiquitylation, l’oxydation, la nitration, la déamidation et la glycation.[26]
1. La glycosylation
La O-Glycosylation des protéines nucléocytoplasmiques fut découverte par l’équipe de Hart en 1984 et diffère de la O-Glycosylation des membranes ainsi que de celles des protéines extracellulaires.[31] La O-Glycosylation est une des modifications post traductionnelle la plus abondante et la plus dynamique de la protéine Tau. Celle-ci est caractérisée par l’addition d’un groupement N-actétylglucosamine sur les sérines et les thréonines (O-GlcNAc) à proximité de résidus prolines.[32],[33] Ce processus est régulé dans les cellules par deux enzymes : la O-GlcNAc transferase (OGT) permettant le transfert du groupement N-actetylglucosamine et par la O-GlcNAcase (OGA) qui catalyse le départ de ce groupement (Fig. 5). Cette modification post traductionnelle va avoir différents rôles au sein de la cellule comme la régulation de la transcription, l’activation cellulaire, la régulation du cycle cellulaire et va permettre l’assemblage de complexes multi-protéiques.[34] Depuis une dizaine d’années, des équipes de recherche travaillent sur un lien existant entre la O-GlcNAcylation et la phosphorylation car il s’avère que la phosphorylation de certains résidus spécifiques est régulée par l’ajout du groupement O-GlcNAc.[35] L’équipe de Lefebvre est la première à avoir démontré ce lien entre ces deux phénomènes en provoquant l’hyperphosphorylation de Tau qui à conduit une diminution de l’incorporation du groupement O-GlcNAc.[36]
Dans le cas de la MA, les facteurs étiologiques à l’origine de la maladie sont encore étudiés. Toutefois, il a été démontré que certains facteurs métaboliques sont fortement liés à certaines lésions de la maladie.[37]En effet, avec l’âge le métabolisme du cerveau va être perturbé et la
24
première conséquence va être une baisse importante du taux de Glucose dans le cerveau affectant directement la O-GlcNAcylation et se traduisant par une chute de sites O-GlcNAc et par une augmentation de la phosphorylation de ces sites.[38],[39] En effet, des études de spectrométrie de masse ont démontré que les sites O-GlcNAc sont également des sites hyperphosphorylés (T123, S208, S238, S400, S409, S412 et S413).[35] Cela implique donc que la O-GlcNAcylation inhiberait le processus de phosphorylation empêchant donc la formation des DNF.
Figure 5 : O-GlcNAcylation et maladie d’Alzheimer. Avec UDP : Uridine Diphosphate.
A ce jour, le lien entre la O-GlyNAcylation et la maladie d’Alzheimer est toujours en cours d’étude. Afin de mieux comprendre le lien entre ce phénomène et la neurodégénérescence il est indispensable de connaitre plus précisément la relation entre les sites de Tau impliqués dans le phénomène et les effets sur les neurones. Dans tous les cas, les enzymes responsables de cette modification post traductionnelle apparaissent comme des cibles prometteuses pour
25
prévenir la MA. En effet, inhiber l’OGA pourrait permettre une augmentation de la O-GlcNAcylation et ainsi réduirait la phosphorylation conduisant à terme à une neuroprotection.
2. La phosphorylation
Depuis les années 80, Tau est définie comme une phosphoprotéine et la phosphorylation de cette dernière est au cœur de nombreuses recherches, notamment dans le cas des tauopathies. Cette modification post traductionnelle de Tau est la plus importante puisque 85 sites sont potentiellement phosphorylables dans le cas de l’isoforme le plus long. Parmi ces sites, 3 types de résidus peuvent être phosphorylés, dont 45 sérines, 35 thréonines et 5 Tyrosines.[40],[41] Afin de mieux comprendre le rôle de la phosphorylation physiologique et physiopathologique de nombreuses équipes ont cherché à identifier les différents sites de phosphorylation. L’équipe de Hanger et coll. a ainsi démontré que 9 sites sont phosphorylés dans le cas d’un neurone sain. Pour arriver à ce résultat, la protéine phosphorylée issue d’un cerveau sain a été étudiée par spectrométrie de masse (MS) en utilisant une technique de fragmentation de type MS/MS. Les résidus phosphorylés dans le cas d’un neurone sain sont les suivants : S46, S199, T181, S202, T231, S404 et deux parmi S412, S413 et T414.[40] La technique de masse n’a pas permis de détecter la thréonine 231 car ce résidu est localisé dans une séquence de 18 acides aminés dont l’analyse par MS/MS fut impossible. Toutefois l’étude de Morishima-Kawashima en 1995 avait permis de localiser ce site par le biais d’une autre technique utilisant le séquençage de peptides modifiés par l’éthanethiol.[42] Ce processus physiologique est régulé par un équilibre entre les activités de 2 enzymes, les kinases et les phosphatases. Les kinases vont permettre le transfert d’un groupement phosphate sur un alcool à partir d’une molécule d’ATP et les phosphatases vont déphosphoryler les protéines par élimination du groupement phosphate à partir d’une molécule d’eau (Fig. 6).La balance entre kinases et phosphatases est un processus qui va être régulé depuis le développement du stade fœtal jusqu’à l’adulte. En effet, au stade fœtal l’isoforme 352 va être davantage phosphorylé que dans le cas des isoformes plus long, cela va être essentiellement dû à l’activation des phosphatases au cours du développement. La phosphorylation est un processus important qui va moduler les propriétés de la protéine notamment l’affinité de Tau pour les microtubules grâce à une parfaite balance entre les activités enzymatiques décrites précédemment.
26
Figure 6 : Phosphorylation de la protéine Tau.
Un déséquilibre entre l’activité des kinases et des phosphatases serait à l’origine de la maladie d’Alzheimer mais il n’a pas été tranché entre une suractivité des kinases ou une diminution de l’activité des phosphatases.[43] Or, il a été démontré dans de nombreuses études que l’état de phosphorylation de Tau influence la stabilité des microtubules par une diminution de l’affinité du domaine de liaisons de Tau envers ces derniers.[44] Dans le cas de la MA 45 résidus vont être phosphorylés conduisant à une protéine Tau dite hyperphosphorylée.[45] La conséquence directe de l’hyperphosphorylation va être la neutralisation de la protéine Tau dans les régions à proximité du domaine de liaisons aux microtubules. Ce changement d’état de charge de la protéine va ainsi influencer l’affinité de Tau pour les microtubules et également compenser le caractère répulsif de Tau ce qui va donc induire son agrégation sous forme de filaments neurotoxiques.[46] En effet, c’est en 1963 que les équipes de Kidd et Terry ont analysé les DNF à l’aide de la microscopie électronique ce qui leurs ont permis de découvrir que ceux-ci étaient composés de filaments.[47] Deux types de morphologies sont décrits pour ses filaments, les PHF et les SF (Straight Filaments). Dans le cas de la MA, Tau va principalement être présente sous la forme de PHF qui vont être constitués de 2 filaments de Tau enroulés l’un autour de l’autre formant ainsi une hélice. Les PHF ont une largeur variant entre 10-20nm et une demi-périodicité de 80 nm. Les SF sont des espèces minoritaires constituants les DNF et sont composés d’un seul filament de Tau. Le diamètre des SF est estimé à environ 10nm.[46] L’étude de la formation des DNF a été menée par diverses équipes dans le but de pouvoir inhiber cette agrégation de filaments à différentes étapes du processus de formation. Les DNF vont se former après 2 étapes clés, la première étant la phosphorylation de Tau provoquant
27
son détachement des microtubules ce qui a pour conséquence l’obtention de Tau « libre » dans le milieu intracellulaire. La seconde étape est l’association de protéines Tau au niveau de leurs domaines de répétitions conduisant à un assemblage protéique adoptant une conformation de type feuillet qui est essentielle pour son agrégation. La dernière étape est l’assemblage des filaments en PHF conduisant à leurs agrégations formant ainsi les DNF (Fig.
7).[48]
Figure 7 : Les étapes de la formation des DNF et les conséquences sur les neurones. Avec
TA : Transport Axonal et MT : Microtubules.
Les conséquences de la formation de ces DNF vont être multiples sur les neurones et vont apparaitre à différents stades. Tout d’abord, l’hyper phosphorylation de Tau dans les domaines de répétitions vont causer le désassemblage des microtubules conduisant à un transport axonal réduit. En effet, la compétition entre Tau et les Kinésines n’existant plus, le transport d’organelles tout au long des microtubules est dérégulé. De plus, dans un neurone sain la protéine est également présente dans le noyau et son rôle est de maintenir l’intégrité de l’ADN génomique ainsi que de l’ARN cytoplasmique et de l’ARN nucléaire. La protéine Tau pathologique ne peut plus entrer dans le noyau ce qui conduit à des dommages sur l’ADN.[49] Enfin, les oligomères toxiques de Tau formés après la phosphorylation vont se propager dans les dendrites ce qui va avoir plusieurs conséquences comme la perte des épines dendritiques et des dysfonctionnements synaptiques conduisant notamment au blocage de la neurotransmission synaptique.[50] Cette cascade d’évènements conduit à terme à la neurodégénérescence et à la mort du neurone (Fig. 7).
28
A ce jour, différentes thérapies sont envisagées pour éviter la neurodégénération en ciblant différentes étapes conduisant à l’effet neurotoxique de la protéine Tau. La première stratégie serait de diminuer la production de Tau en limitant son expression. Pour cela, la synthèse d’inhibiteurs de la transcription semble être une piste thérapeutique intéressante. Supprimer l’hyperphosphorylation de Tau en inhibant des kinases ou en activant des phosphatases est au cœur de nombreuses recherches. Des molécules ciblant l’agrégation de Tau ont été testées lors d’essais précliniques dont un dérivé du bleu de méthylène, le LMTX. Ce composé a eu des effets bénéfiques sur des individus présentant de légers troubles pathologiques en phase II et les essais en phase III sont en cours. Enfin, la mort cellulaire pourrait également être évitée en synthétisant des stabilisateurs de microtubules. Un petit peptide (NAPVSIPQ), le NAP, a été testé en phase II et III mais n’a malheureusement pas montré d’effets bénéfiques.
L’inhibition des kinases est une des stratégies au cœur des études et semble être adaptée sachant qu’il a été montré que le dysfonctionnement synaptique et la perturbation du transport axonal précèdent la formation des DNF. De plus, l’équipe de Llinas a démontré dans une récente étude que les effets toxiques de Tau sur les fonctions synaptiques impliqueraient des enzymes telles que la GSK3 et la Cdk5.[50] Il semble donc nécessaire de s’intéresser aux différents sites de fixations et à ce qu’ils impliquent dans la maladie ainsi qu’aux différentes kinases.
• Les sites de phosphorylation
Plusieurs techniques de séquençages protéiques ont permis de déterminer les sites de phosphorylation de la protéine Tau :
- La spectrométrie de masse par l’utilisation de technique de fragmentation de type MS/MS permet de recouvrir 90% des sites.
- La dégradation d’Edman qui consiste à cliver l’aminoacide terminal avec du phénylisothiocyanate (PITC) conduisant à un dérivé phénylthiohydantoïne (PTH)- aminoacide analysable par chromatographie ou par électrophorèse.
- L’utilisation d’anticorps phospho-spécifiques pouvant reconnaitre des groupes de résidus spécifiques de la protéine appelés épitopes.
Dans le cas de la MA, 45 résidus sont phosphorylés ce qui correspond à plus de la moitié des sites potentiels de phosphorylation. La majorité de ces sites de phosphorylation sont localisés dans la région riche en proline et dans l’extrémité du domaine C-terminal. En effet, 27 sites sont recensés dans le domaine de projection dont 20 dans la RRP et 14 dans le domaine
C-29
terminal (Fig. 8).[3] Les 4 derniers sites sont localisés dans les domaines R1, R2 et R4 dont 2 sont phosphorylés dans des régions identiques (motif de type KXGS, avec X=I pour R1 et R4).[24]
Figure 8 : Les sites de phosphorylation de Tau.
Le degré de phosphorylation de la protéine n’est pas le seul facteur déterminant de la gravité de la maladie. En effet, les phosphorylations spécifiques de certains résidus vont entrainer différents effets pathologiques. De nombreuses recherches utilisant la pseudo phosphorylation ont permis de démontrer les liens existants entre les effets de la phosphorylation de sites spécifiques et la MA. Le but de cette expérience est de mimer la phosphorylation en remplaçant un résidu potentiellement phosphorylable par un résidu négativement chargé.
Dans le domaine de liaisons aux microtubules et plus particulièrement dans les domaines de répétitions, est retrouvé un motif conservé de type KXGS. Des recherches ont démontré que remplacer les sérines de ces motifs (S262, S293, S324 et S356) par des acides aspartiques ou glutamiques induit des changements de configuration de Tau ayant un effet direct sur l’affinité de la protéine pour les microtubules et sur la stabilisation du cytosquelette.[43] Or, dans les tissus du cerveau de patients atteints de la MA la phosphorylation des motifs KXGS est présente sur 2 sites, la sérine 262 et la sérine 356.[51] De nombreuses recherches ont démontré que la phosphorylation de S262 a un rôle important dans la désassociation de Tau des microtubules et dans la perturbation du transport axonal. Toutefois, l’équipe de Grantham a récemment démontré que malgré ces effets sur les neurones, la seule phosphorylation de ce site n’est pas suffisante pour induire un déficit de la mémoire.[52] La phosphorylation des sérines 262 et 356 aurait également un effet inhibiteur sur certains complexes protéiques
E2 E3 RRP R1 R2 R3 R4 Y18 S46 S68 T69 T71 S113 T123 T153 T175 T181 S184 S185 S191 S416 T427 S435 Y197 S198 S199 S202 T205 S208 S210 T212 S214 T414 T217 T231 S235 S237 S238 S258 S262 S289 S356 Y394 S396 S400 T403 S404 S409 S412 S413 S422 S433 441 1
30
comme le complexe CHIP-HSP90 empêchant la dégradation de Tau. Les HSP (heat shock protein) permettent le repliement de protéines altérées suite à un stress, mais lorsque le repliement est trop complexe, les HSP forment un complexe avec les CHIP (Carboxyterminus of Hsc 70 Interacting Protein) qui permet de dégrader ces protéines.
A l’extrémité du domaine C-terminal, la phosphorylation de certains résidus va avoir pour effet d’accélérer la formation des PHF et des SF. L’équipe de Binder a montré qu’en remplaçant la S396 et la S404 par des acides Glutamiques la vitesse de formation des filaments était accélérée.[53] En 2004, l’équipe de Holzer a confirmé que la phosphorylation de ces sites induisait la formation de filaments et a également démontré que le seul remplacement de la sérine 422 avait le même effet. Contrairement aux S396 et S404, la Sérine 422 phosphorylée est très abondante dans les filaments extraits des tissus de cerveaux affectés par la MA.[54]
Dans la région riche en Proline, plusieurs sites ont été décrits comme étant des sites majeurs de phosphorylation de par leurs présences dans les cerveaux atteints de la MA et de par leurs rôles dans différents processus pathologiques. Dans les conditions physiologiques, la phosphorylation de la T231 est cruciale car elle permet la reconnaissance du résidu P232 par la peptidyl-prolyl cis/trans isomérase (Pin 1). La Pin 1 est une enzyme catalysant l’isomérisation des prolines de cis à trans dans un neurone sain ce qui permet de promouvoir l’assemblage des microtubules et ce qui permet également l’approche de la phosphatase PP2A qui va déphosphoryler ce site.[55] Cette cascade d’évènement est nécessaire pour la stabilisation des microtubules et dans le cas d’un neurone atteint de la MA la T231 n’est plus déphosphorylée, l’isomère cis de la proline étant alors majoritaire. Cette conformation de la protéine favorise la dissociation de Tau des microtubules et favorise également l’approche d’autres kinases qui vont phosphoryler d’autres sites.[24],[49] Comme dans le cas de la T231, la phosphorylation de la S202 et de la T205 induisent des changements conformationnels de la protéine atténuant l’affinité de Tau pour les Microtubules. De plus, la phosphorylation de ces 3 sites initie la phosphorylation d’autres sites comme la T212 par la kinase DYRK1A (Dual specificity tyrosine-phosphorylation-Regulated Kinase 1A).[43] Enfin, l’équipe de Mandelkow a montré que la S214 phosphorylée est présente dans les PHF et que sa phophorylation in
vitro entraine un détachement de Tau des microtubules dont la conséquence est la
déstabilisation du cytosquelette.[3],[56]
La phosphoryaltion des différents sites ne se fait pas en même temps et la formation de résidus phosphorylés va entrainer une cascade de phosphorylation. C’est ce que l’équipe de Leclerc a démontré en remplaçant les résidus phoshorylables par des résidus apolaires.
31
Prenons l’exemple de la sérine 262 remplacée par une alanine. La phosphorylation de la T217 passe de 47.5% (quand la S262 est phosphorylée) à 15.7% tandis que la phosphorylation de la T231 et de la S235 augmente. Cette expérience a été effectuée sur différents résidus et les résultats obtenus sont résumés sur la figure ci-dessous (Fig. 9).[45]
Figure 9 : Représentation des épitopes de Tau et cascade de phosphorylations.
Cette étude démontre l’importance de la phosphorylation de l’épitope AT8 (Antibody Tau 8) dans la balance de la phosphorylation de Tau sur chaque domaine. Il serait donc intéressant de rétablir le niveau de phosphorylation dans ce domaine pour diminuer la progression de la maladie. E3 E2 RRP R1 R2 R31 R4 S262 AT8 (S199/S202/T205) AT180 (T231/S235) T217 PHF 1 (S396/S404) S422 pS262 AT8 T217 AT180 AT180 S422 PHF 1
32
• Les Kinases
Les kinases sont des enzymes faisant partie de la famille des transférases catalysant des réactions de phosphorylation en transférant des phosphates à des substrats spécifiques à partir d’ATP ou de GTP (Guanosine TriPhosphate). Les Kinases font partie de la même superfamille protéique ce qui implique que leurs sites actifs et que leurs noyaux catalytiques sont constitués de résidus hautement conservés. De ce fait, le mécanisme catalytique sera le même pour les kinases où le site catalytique va permettre la fixation de l’ATP et du substrat. Une fois les 2 molécules positionnées correctement dans le site catalytique, le transfert du groupement phosphate sur un résidu de type sérine, thréonine ou tyrosine va avoir lieu pour donner la protéine phosphorylée et de l’ADP. Les kinases phosphorylant la protéine Tau se divisent en trois familles : les kinases dirigées par les prolines dites PDPK (Proline-Directed Protein Kinases), les kinases non dirigées par les prolines appelées non-PDPK et les kinases ciblant les tyrosines nommées TPK (Tyrosine Protein Kinases).
Les PDPK sont des kinases qui vont cibler des résidus sérine et thréonine situés devant une
Proline (S/TP).
La Glycogène Synthase Kinase 3 (GSK3) existe sous deux isoformes etprésentant 85%
d’homologie de séquence. A ce jour, une centaine de substrats ont été répertoriés comme étant phosphorylés par cette enzyme, contre une dizaine pour les autres kinases, ce qui explique ses nombreuses actions dans différents processus cellulaires.[57] Son premier rôle est la métabolisation du glycogène mais il a également été démontré que cette enzyme est impliquée dans la prolifération cellulaire, dans les fonctions neuronales, dans l’oncogenèse, dans les voies de réponses immunitaires et dans l’apoptose.[43] Dans le cas de la MA, l’expression de la GSK3 va augmenter dans l’hippocampe et l’enzyme va être retrouvée de manière abondante dans les DNF ce qui montre son implication dans la formation de ces neurodégénérescences.[58] En 2000, l’équipe de Reynolds a identifié 9 sites phosphorylés par la GSK3sur les 15 motifs S/TP phosphorylés dans le cas de la MA en utilisant la spectrométrie de masse avec une source de type Nanoelectrospray (T175, T181, S202, T212, T217, T231, S235, S396 et S404).[59] Or, de plus récentes études indiquent que 42 sites peuvent être phosphorylés par la GSK3 et 29 le sont dans le cas de la MA.[43] Or, nous pouvons dénombrer que 17 motifs S/TP ce qui s’explique, par le fait, que cette kinase non seulement phosphoryle les résidus S/TP mais également des sérines ou des thréonines dont le
33
motif est S/TX (avec X pouvant représenter n’importe quel résidu hormis une proline). En effet, la GSK3 peut phosphoryler quelques résidus sans amorçage (motif S/TP), c’est-à-dire sans que certains résidus du substrat ne soient phosphorylés en amont par d’autres kinases ce qui permet une meilleure affinité entre kinases et Tau. Dans le cas des motifs de types S/TX, la phosphorylation par la GSK3, et plus particulièrement de l’isoforme va être catalysée par d’autres kinases comme la PKA (Protein Kinase cAMP-dependent), la PKB (Protein Kinase B) ou la PKC (Protein Kinase C). Afin que la phosphorylation soit efficace il faut que le résidu qui va être phosphorylé par la GSK3 et celui qui a été phosphorylé par une autre kinase soient espacés de 3-4 résidus (motif de type S/T-X-X-X-XpS/pT). Plusieurs études démontrent que la GSK3est impliquée dans la MA. En effet, la suractivité de cette kinase est non seulement impliquée dans le processus d’hyperphosphorylation mais aussi dans l’augmentation de la production des A ce qui va avoir des influences sur les réponses inflammatoires, sur la diminution de la synthèse d’acétylcholine et enfin sur l’apoptose.[43],[58]
La kinase dépendante des cyclines 5 (CDK5) est une enzyme inactive qui, de ce fait,
s’associe avec des co-activateurs (p39/p35, étant des protéines virales exprimées respectivement au stade fœtal et adulte ou avec p29/p25 étant des fragments de p39 et p35). L’activité de CDK5 est spécifiquement exprimée dans les neurones où celle-ci va avoir pour rôles le développement du système nerveux central, la régulation de la dynamique du cytosquelette, la régulation du transport axonal et des fonctions synaptiques. Des essais in
vitro ont montré que le complexe CDK5/p25 phosphoryle 11 sites qui sont tous retrouvés
dans le cas de la MA. L’inhibition de de cette enzyme réduit, sur des souris, la formation des DNF ce qui montre que cette kinase est directement impliquée dans l’accumulation de ces DNF. De plus, la phosphorylation de Tau par la CDK5 favoriserait l’affinité entre Tau et la GSK3ce qui implique une phosphorylation excessive. Enfin, cette kinase a également un effet sur la toxicité des peptides Aet va également promouvoir l’apoptose neuronal.
Les MAP kinases (Mitogen-Activated Protein kinases), forment une famille de 6 kinases
comprenant la p38, les Erk1/2 et les JNK1/2/3. Ces kinases sont impliquées dans différents stades du développement cellulaire comme la mitose, l’apoptose ou encore la différenciation cellulaire. La p38 est impliquée dans l’apoptose induite par un stress oxydatif ou chimique et est activée après la déstabilisation du cytosquelette. In vitro, la p38 phosphoryle 21 sites dont 15 sont présents dans le cas de la MA ce qui va être corrélé à des réponses inflammatoires responsables de la pathologie. De plus, cette kinase est retrouvée dans les DNF. Les Erk1/2 vont réguler la division cellulaire, la différenciation, la prolifération et l’apoptose. Ces kinases
34
phosphorylent 16 sites in vitro et 15 sont phosphorylés in vivo. Comme la p38, les JNK1/2/3 sont impliquées dans l’apoptose et vont être détectées dans les agrégats de Tau. Dans ce cas, 12 sites sont phosphorylés in vitro et in vivo. La sur-activation de ces enzymes va être associée à une hausse de l’activité des sécrétases conduisant à l’accumulation des A
Les non-PDPK sont les kinases qui vont phosphoryler les motifs de type S/TX et cette
famille est composée de 10 kinases comprenant les TTBK1/2 (Tau-Tubulin Kinases), les CK1/1/1/2 (Casein Kinases), les DYRK1A/2, les MARK (Microtubule Affinity-Regulating Kinases), la PK (Phosphorylase Kinase), la PKA, la PKB/Akt, la PKC, la PKN et la CaMKII (Ca2+/calModulin-dependant protein Kinase II). Nous traiterons dans cette partie les 2 enzymes qui sont le plus impliquées dans le processus de phosphorylation.
Les Caséines Kinases existent sous 10 isoformes (CK1et CK2’) dont 4
sont impliquées dans le cas de la MA (CK1). Le rôle physiologique de ces kinases est la régulation des dynamiques des microtubules ainsi que de l’apoptose. In vitro, ces enzymes catalysent la phosphorylation de 46 sites dont 25 sont retrouvés dans les cerveaux de patients malades. Il a été démontré que la production de peptide A est liée à l’activité de la Caséine Kinase 1 et que les oligomères de A altèrent l’activité de la CK2. De plus, l’étude des tissus nerveux montrent que la CK1 est co-localisée avec les DNF.
La Protéine Kinase A est une enzyme dont l’activité dépend de la concentration en AMP
(Adénosine Mono Phosphate) cyclique dans la cellule. Le rôle de cette enzyme est de réguler le métabolisme de différentes biomolécules comme le glycogène et les lipides. Dans le cas de la MA, cette protéine cible 17 résidus et 25 sont phosphorylés in vitro. Cette enzyme est une cible thérapeutique intéressante car elle permet l’amorçage de la phosphorylation par la GSK3.
Les TPK sont les kinases phosphorylant les tyrosines. Dans le cas de la protéine Tau, 5
tyrosines peuvent être phosphorylées : Y18, Y29, Y197, Y310 et Y394. Dans le cas de la MA, 3 de ces 5 résidus sont phosphorylés par ces kinases qui se divisent en 2 familles : les SFK (famille des Src kinase) et la kinase c-Abl. Les SFK phosphorylent la Y18 ce qui est lié à des processus de neuro-inflammation et la c-Abl phosphoryle les Y18 et Y394 et il a été suggéré que ces phosphorylations facilitent l’approche d’autres kinases.
35
• Les inhibiteurs de Kinases
Depuis plusieurs années de nombreuses équipes s’intéressent à ces enzymes qui, dans le cas de la MA, vont entrainer l’agrégation de Tau sous formes de DNF neurotoxiques. Moduler la phosphorylation serait donc une voie prometteuse pour le développement d’une thérapie et pour cela le développement d’inhibiteurs de kinases est au cœur de nombreuses recherches. Toutefois, plusieurs paramètres vont devoir être pris en compte dans le développement de ces composés. En effet, il ne pas faut négliger le fait que les kinases font partie d’une des super familles les plus vastes du protéome et que ces enzymes sont impliquées dans diverses voies métaboliques et processus cellulaires.[60] De plus, le nombre de substrats par kinase est relativement élevé. Il faut donc avoir accès à des inhibiteurs sélectifs des kinases et des substrats directement impliqués dans la MA.
La GSK3 phosphoryle 70% de la protéine Tau dans le cas de la maladie et est retrouvée de manière importante dans les DNF, c’est pour cette raison que les inhibiteurs présentés vont être principalement axés sur cette kinase.
En 1996, l’équipe de Klein et Melton ont montré la capacité du Lithium (Li+) à inhiber la
GSK3. Ce cation monovalent agit par compétition avec le Magnésium (Mg2+) nécessaire pour la réaction de phosphorylation.[43] Toutefois, ce composé présente une faible activité inhibitrice (IC50 = 2mM) et aucun changement sur les performances cognitives des patients
n’ont été observés. De plus, le Lithium n’est pas sélectif de la GSK3 et s’avère être neurotoxique puisqu’il altère la concentration en neurotransmetteurs.[61] La synthèse de petites molécules plus sélectives et ayant de plus fortes activités inhibitrices a été développée.
Il existe trois types d’inhibiteurs de kinases : les inhibiteurs compétitifs de l’ATP, les inhibiteurs non compétitifs de l’ATP et les inhibiteurs compétitifs du substrat.
Le développement d’inhibiteurs compétitifs de l’ATP consiste à synthétiser de petites molécules capables d’interagir avec le domaine de fixation de l’ATP de la kinase. Pour cela l’étude de cette région de l’enzyme est indispensable et pour mieux comprendre les interactions mises en jeu l’effet d’un dérivé du 7-azaindole va être explicité. En 2016, l’équipe de Hong à travers une étude de FBDD (Fragment-Based Drug Discovery) a mis en avant les interactions entre le domaine de fixation de l’ATP et 1.[62] Il semble que les liaisons hydrogène pouvant se former entre le squelette des résidus Asp133 et Val135 et les inhibiteurs sont primordiales dans la fixation (Fig. 10).[43],[62] Ainsi, 1 présente pour GSK3 une IC50 de l’ordre du M (IC50 = 1.45M). De plus, perturber le pont salin entre la Lys85 et
36
phosphate. Des dérivés du composé 1 ont permis d’accroître l’activité inhibitrice (IC50 de
l’ordre du nM) grâce à des études de relation structure-activité mais la sélectivité envers d’autres kinases et les effets que ces molécules peuvent avoir sur d’autres processus cellulaires n’ont pas encore été rapportés.[62]
Figure 10 : Interaction entre le domaine de fixation de l’ATP et 1.
La famille des Paullones regroupe plusieurs composés qui sont connus comme étant des inhibiteurs de kinases, en particulier l’Alsterpaullone 2 qui permet d’inhiber la phosphorylation de Tau in vivo par GSK3 (IC50 de l’ordre du nM). Les études in silico
permettent de déterminer que les interactions préférentielles s’établissent par le biais de 2 liaisons hydrogène entre la Val135 et 2 puis une liaison H entre la Lys85 et le groupement nitro. L’intérêt de ce composé est double car il permettrait aussi l’inhibition de la CDK5/p25 (Fig. 11).
La famille des thiazoles est également au cœur des études depuis le développement par Astra Zeneca du composé 3 (AR-A014418). Cette urée permet non seulement l’inhibition de la phosphorylation de Tau de manière efficace (IC50 = 104±27nM) mais elle est aussi spécifique
à GSK3puisque des essais sur 26 autres kinases n’ont rien donné (Fig. 11). Dans les cellules, ce composé inhibe la phosphorylation de la Ser396 et a un impact positif sur la neurotoxicité des A.[60],[61]
Les inhibiteurs non compétitifs de l’ATP permettent également des interactions Ligand-Domaine de fixation de l’ATP mais dans ce cas la fixation de l’inhibiteur peut se faire même
37
si le substrat (ATP) est lié à l’enzyme. En 2002 les Thiadiazolidinones (TDZD) 4 et 5 sont les premières molécules décrites comme des inhibiteurs non compétitif de l’ATP avec des IC50 de
2 à 1.1M respectivement. Ces molécules ont permis la diminution de la phosphorylation sur des cellules neuronales et sont sélectives de plusieurs kinases d’intérêt comme la PKA et la CK2. Un dérivé, le Tideglusib 6, a atteint les phases II des essais cliniques (Fig. 11).
La cétone 7 est la première molécule qui permet une inhibition irréversible de la GSK3 (Fig.
11). L’inactivation de la kinase se fait par le biais de la création d’une liaison covalente
carbone soufre entre 7 et la Cys199.
Enfin, il est possible d’inhiber l’activité enzymatique par compétition avec le substrat ce qui est le cas de la Manzamine A 8 (Fig. 11). Ce produit naturel retrouvé dans les éponges marines du Pacifique permet l’inhibition de GSK3et de CDK5 (IC50 de 10 et 15M) ce qui
permet de réduire l’hyper phosphorylation de Tau dans certaines lignées cellulaires.
Figure 11 : Les Inhibiteurs de GSK3.
Compétitif ATP Compétitif Substrat Non-Compétitif ATP 000
38
Comme nous pouvons le voir, plusieurs inhibiteurs de kinases ont été développés au cours des dernières années, la majorité d’entre eux étant encore en phase de découverte et une minorité étant en phase clinique. De plus des tests secondaires sur ces inhibiteurs sont encore faits afin d’étudier les effets indirects de ces molécules sur les kinases. Toutefois, il est à ce jour nécessaire de synthétiser des molécules ayant cette capacité d’inhiber les processus enzymatiques à l’origine des DNF mais ces composés doivent également inhiber l’activité amyloïdogénique à l’origine des plaques séniles. La seconde partie de cette étude bibliographique va porter sur les polyphénols qui semblent être des composés prometteurs pour inhiber ces deux processus conduisant à la MA.
