Eimeria tenella et Eimeria acervulina : une stimulation antigénique in vitro des cellules provenant de poulets immuns induit le transfert adoptif de la protection contre les coccidioses aviaires

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Eimeria tenella et Eimeria acervulina : une stimulation

antigénique in vitro des cellules provenant de poulets

immuns induit le transfert adoptif de la protection

contre les coccidioses aviaires

A Rhalem, H Sahibi, M Kazanji, François Laurent, B Berrag, P Péry

To cite this version:

Article de recherche

Eimeria tenella

et

Eimeria

acervulina :

une

stimulation

_antigénique

in

vitro des

cellules

provenant

de

_poulets

immuns

induit le

transfert

_adoptif

de la

_protection

contre

les coccidioses aviaires

A Rhalem

1

H

Sahibi

1

_M

_Kazanji

_{F Laurent}

B

_Berrag

_{P Péry}

₂

Institut

agronomique

et vétérinaire Hassan-il

_{(IAV), Département}

de

parasitologie

et maladies

parasitaires,

BP 6202 Rabat-Instituts, Rabat, Maroc;

2_{Centre de recherches de}

Jouy-en-Josas,

Unité de

_virologie

et

_immunologie

moléculaires,

domaine de Vilvert, 78350

Jouy-en-Josas,

France

(Reçu

le 20 novembre 1992;

accepté

le 18

_{juin 1993)}

Résumé ― Le transfert de 5 x 10! cellules ou 108cellules de rates de

poulets

immuns contre E te-nella stimulées pendant au moins 12 h in vitro par des

antigènes

totaux

d’oocystes

de la coccidie leur confère une

_protection

contre une _{infection ultérieure par le}

_parasite.

Au

_jour

7

_après

l’infection

par 20

000 oocystes, le nombre

_d’oocystes

récoltés dans les caeca est de

_{(1,33 t 1,10)}

x 106chez

les receveurs de 5 x 107 cellules immunes restimulées

pendant

20 h alors

qu’elle

est de

(4,64

±

2,85)

x 106chez les receveurs de cellules normales stimulées _(soit 85% de

_protection).

Lors

d’expé-riences de transfert de cellules de _poulets immuns contre E tenella ou contre E acervulina, une

asy-métrie a été mise en évidence dans la

protection

croisée obtenue, les cellules de

poulets

immuns

contre E acervulina transférant une

_protection

contre une _{infection par E acervulina}

_(78%),

mais aussi contre une infection par E tenella

(68%)

alors que des cellules de

poulets

immuns contre E

te-nella ne transfèrent une

_protection

notable

(70%)

que contre l’infection

homologue. L’antigène

homo-logue

permet

toujours

la meilleure stimulation, mais des

_antigènes

de surface communs aux deux coccidies

_purifiés

à

_partir

de

_sporozoïtes

d’E tenella à l’aide

_{d’anticorps}

de la bile anti-E acervulina

sont

_capables

de stimuler les 2 types de cellules sans en

_changer

les

_{propriétés.}

transfert

_adoptif

/ cellules immunes 1 stimulation in vitro 1 coccidies 1

_protection

croisée

Summary ―

Eimeria tenella and Eimeria acervulina: induction of

adoptive

transfer of protec-tion

_against

avian cocciodiosis

_by

in vitro

_antigenic

stimulation of cblls from immune

chick-ens. The transfer of 5 x 10! or 108

spleen

cells from E tenella-infected chickens to

_virgin

animals

af-ter 12-20-h in vitro stimulation with whole

_{sporozoite homogenates}

confers

_significant

_protection

to

*

recipients.

The _oocyst contents of ceca on d

7 post-infection

with 20 000 E tenella _oocysts were

_(1.33

Í

_1.10)

x 106in chickens which received 5 x 107immune cells after 20-h in vitro stimulation and

(4.64

Í

_2.85)

x 106in chickens

_receiving

5 x 107stimulated cells from normal chickens

_{(85% protection).}

).

Adoptive

transfer

_{by spleen}

cells revealed an

asymetric cross-protection

between E tenella and E acervulina.

Spleen

cells from E tenella immune chickens

_{protected only against}

a

_subsequent

infec-tion with the same

_parasite,

while

_spleen

cells from E acervulina immune chickens

protected against

infection with E acervulina

_(78%)

but also

_against

infection with E tenella

(68%

protection).

The

com-mon

_{antigen permits}

better stimulation, but common surface

_{sporozoite antigens purified}

from E

te-nella

sporozoites

via anti-E acervulina

biliary

antibodies are

_capable

of

_stimulating

both types of cells

without, however,

changing

their properties.

adoptive

transferlimmune celllin vitro

stimulationlcoccidialcross-protection

INTRODUCTION

Les coccidioses aviaires sont

_provoquées

par des

protozoaires, parasites

du tube

di-gestif,

appartenant

à différentes

_espèces

du genre Eimeria

(Reid, 1975).

L’immunité

spécifique acquise

se manifeste par une

réduction de l’effet

_{pathogène (mortalité,}

lésions,

mauvais indices de conversion de

l’aliment, perte

de

_gain

de

_poids

selon les

espèces

de coccidies

_envisagées)

et une diminution de la

_production

_d’oocystes

lors de réinfections. Cette diminution de l’effet

pathogène

variable selon

_{l’immunogénicité}

des

_{espèces peut}

devenir

_complète

_après

plusieurs

infections. Les mécanismes ef-fecteurs de la

_protection

_{induite par} l’infec-tion ou _par l’administration d’extraits de pa-rasites ne sont connus _{que de}

_façon

très

incomplète (Rose,

1987).

Les

_anticorps

produits

au niveau local

_(IgA)

semblent

jouer

un rôle

_important

dans la neutralisa-tion des

_{sporozoites (Davies}

et

Porter,

1979 ;

Trees et

al,

1989),

mais un certain nombre d’études récentes

_suggèrent

forte-ment l’intervention d’une

_composition

cellu-laire dans la résistance

_(Lillehoj,

1987 ;

Rose,

1987),

une

_protection

contre des

coccidies chez le

_poulet

_ayant

été obtenue par

injection

de

_lymphokines

_{sécrétées par} des

_lymphocytes

T

_(Lillehoj

et

_al,

_1989).

Aucune étude de transfert de la

protection

utilisant des cellules immunes stimulées n’a

_cependant

été

_rapportée

chez la

vo-laille. Les

_{expériences présentées}

dans

cet article démontrent

_qu’un

transfert

adop-tif de la

_{protection peut}

_{être induit par} une stimulation in vitro des cellules de

_poulets

immuns _par des

_antigènes

de

_{sporozoïtes,}

stade

_parasitaire

connu pour avoir des pro-téines vaccinantes

(Danforth,

1983 ;

Mur-ray

et al, 1986 ;

Rhalem

et al,

1989a).

Les interactions croisées ont été

_également

étudiées entre E tenella et E acervulina.

MATÉRIEL

ET

MÉTHODES

Parasites

Le

cycle

des

_parasites

E tenella

(souche

de

l’In-stitut

agronomique

et vétérinaire, Hassan-11, Rabat,

Maroc)

et E acervulina

_(souche

PAPa

46,

Nouzilly, France)

a été entretenu au

labora-toire par infection de

poulets

Hybro (Euribrid,

Pays-Bas).

La

_purification

des _oocystes,

l’excys-tation des

sporozoïtes

et leur

_purification

ont été effectuées selon des techniques courantes

(Bontemps

et Yvoré,

1974).

Préparation

des

_antigènes

Des

sporozoïtes

fraîchement

excystés

d’E tenel-la ont été

soniqués

dans un milieu contenant du

tampon Tris-HCI 10 mM

pH

7,4 additionné de NaCI 0,15 M, de Triton X-100 1% et de

ob-tenu

_{après centrifugation}

et contenant les

anti-gènes

solubilisés a _{été traité par} 4 fois son

vo-lume de méthanol pour enlever le

_détergent.

Le

culot de

centrifugation (1 500

g, 15

_min)

a été

repris dans de l’eau distillée,

dialysé

et conservé

à -20°C

_(Ag

_brut). D’autres

_sporozoïtes

ont été

agités

pendant 15 min à 37°C dans le tampon

ci-dessus additionné de

_dodecyl

sulfate de

so-dium

(0,5%),

de

déoxycholate

de sodium

(0,5%)

et d’EDTA

(acide éthylène

diamine tetra

acéti-que) (1 mM). Les sporozoïtes encore intacts

(80%)

ont _{été retirés par}

_{centrifugation}

et les

an-tigènes

de surface contenus dans le _surnageant

(Rhalem

et al,

1989a)

ont _{été traités par} la mé-thode d’Henderson

_{et al (1979)}

_{pour éliminer} les

détergents.

Ces

_antigènes

ont ensuite été

con-servés à -20°C

(Ag

de

surface).

Les

_protéines

contenues dans les 2 _types de

préparations antigéniques

ont été dosées par la

technique

de Bradford

(1976)

en utilisant une

gamme de sérumalbumine bovine pour

réfé-rence.

Purification

_{d’antigènes}

de surface communs à E tenella _par des

_anticorps

dirigés

contre des

_antigènes

d’E acervulina

Le contenu de la vésicule biliaire a été

_récupéré

chez des

_poulets

sacrifiés du

_jour

7 au

_jour

11 1

de leur troisième infection par E acervulina

(2,4

x 104_oocystes à

chaque infection).

Les échan-tillons contenant des

anticorps

ont été traités par du sulfate d’ammonium à 45% de saturation

et les

anticorps récupérés

dans le

précipité.

La

préparation

de l’immunoadsorbant et les

_étapes

de

purification

des

antigènes

de surface d’E

te-nella ont été réalisées selon des

_techniques

dé-crites

_(Rhalem

et al,

1993).

Stimulation

_antigénique

et transfert des cellules immunes

Les cellules de rates de

_poulets

immuns ont été

prélevées

le 9e

jour après

la 2einfection sur des

poulets

infectés à 2

reprises,

à 4 semaines

d’in-tervalle, avec un nombre

_identique

_d’oocystes

d’E tenella

₍₃

x

₁₀

₄

₎

ou d’E acervulina

(2,5

x

10

4

).

Les cellules _provenant d’animaux infectés

par la même

espèce

de coccidie ont été

mélan-gées

et mises en culture

pendant

des temps

va-riables

(tableau 1)

en absence ou en

_présence

d’Ag

brut

(50

!g pour 10!

cellules). Après

la cul-ture, les cellules ont été lavées et

comptées

puis

injectées

à des

_{poulets vierges}

selon un

procédé

déjà

décrit

_(Rhalem

et al,

1989b).

Infections

Les

poulets

receveurs

_âgés

de 4 semaines

(6

à

chaque fois)

ont été infectés dans tous les cas

par 2 x 10° _oocystes, 6 h

_après

le transfert de cellules.

Tests

_statistiques

Les données

_{(nombre d’oocystes présents}

dans

les caeca au

_jour

7 _{après infection par E tenella} et dans l’intestin au _jour 6

_après

infection par E

acervulina)

ont été traitées par un test t de

Stu-dent.

Pourcentage

de

_protection

Le pourcentage de

_protection

a été calculé à

partir

des résultats

_précédents

_par la formule :

(Rose,

Mockett,

1983).

RÉSULTATS

Transfert de l’immunité par des cellules de rates de

_poulets

immuns stimulées in vitro

_(tableaux

1 et

_II)

L’effet

_protecteur

des cellules

_provenant

de

le nombre de cellules transférées et le

temps

de stimulation in vitro.

Quelque

10! cellules d’animaux immuns

sont

_incapables

d’induire une réduction du

nombre

_{d’oocystes puisque}

leur nombre

dans les caeca au

_jour

7

_après

l’infection ne _{diffère pas, même}

_après

20 h de stimu-lation in

vitro,

du nombre

_d’oocystes

retrou-vés chez les

_poulets

_ayant

_{reçu des}

cel-lules d’animaux normaux.

Lorsque

le nombre de cellules

transfé-rées est de 5 x

_10!,

le nombre

_d’oocystes

au

_jour

7

_{post-infection}

est voisin de celui obtenu

_après

le transfert du même nombre de cellules

_provenant

de

_poulets

normaux pour des durées d’incubation inférieures ou

_égales

à 4 h. Il n’en est

_plus

de même

après

12 ou 20 h de stimulation in vitro

puisque

les nombres

_d’oocystes

chutent de

_façon

_importante

chez les receveurs de cellules d’animaux

immuns,

alors

_qu’ils

res-tent constants chez les receveurs de cel-lules d’animaux normaux

_{(différences}

si-gnificatives

P <_

_0,05).

Ces chiffres

correspondent

à des

_protections

de 48 à 69%

_après

12 et 20 h de stimulation.

Une même diminution est

_reproduite

lorsque

108 cellules sont transférées. Les

pourcentages

de

_{protection atteignent}

alors 62%

_{(12 h)}

et 85%

_{(20 h).}

Pour la

Protection croisée entre E tenella et E acervulina

_{(tableau III)}

Le transfert de 5 x

10!

cellules

_provenant

de

_poulets

immuns contre E tenella stimu-lées _par des

_antigènes

de la même

_espèce

de coccidie ou des

_antigènes

d’E acervuli-na entraîne une réduction similaire du nombre

_d’oocystes

_{émis par les} receveurs

après

l’infection _par E tenella _par

_rapport

à celui

_qui

est émis _{par des}

_poulets

infectés pour la

première

fois. Cela

_correspond

à des

_protections

de 70 et 66%. Par

contre,

ce même transfert est sans effet sur une infection par E acervulina

(protections

res-pectives

de 5 et

_20%).

Les cellules

_provenant

d’animaux

im-muns contre E acervulina sont _par contre

capables

de transférer une

_protection

contre une infection _par E

acervulina,

mais aussi contre une _{infection par E tenella.} Avec ces

_cellules,

_{l’antigène homologue}

se révèle _{meilleur stimulant que}

_{l’antigène}

hé-térologue.

En

effet,

les résultats montrent

que contre _{l’infection par} E

_tenella,

on ob-tient 68% de

_protection

_{lorsque l’Ag}

total d’E acervulina est utilisé in

vitro,

mais

seu-lement 28% de

_{protection lorsque l’Ag}

total d’E tenella est utilisé

_pendant

la stimula-tion. Ces 2 chiffres deviennent

respective-ment 78 et _{51% pour} la

_protection

obtenue à la suite d’une infection _{par E acervulina.}

Pourvoir stimulant des

_antigènes

de surface communs

_purifiés

Les

_antigènes

de surface de

_sporozoïtes

d’E tenella

_purifiés

_par

_{immunoadsorption}

sur des

_anticorps

anti-E acervulina ont un

pouvoir

stimulant se

_rapprochant

de celui du

_sporozoïte

en ce

_qui

concerne les cel-lules

provenant

de

_poulets

immuns contre

E acervulina transférées à des receveurs subissant une infection par E tenella

_(69%

de

_protection)

ou _par E acervulina

_(89%

de

protection).

Ils ont _{aussi conservé la}

capa-cité de stimuler les cellules

_provenant

de

poulets

immuns contre _{E tenella pour}

transférer la

_protection

à des receveurs in-fectés _{par E tenella}

_(72%

de

_protection)

mais ne

_permettent

_{pas d’améliorer la} pro-tection que confèrent les cellules

après

infection des receveurs _{par E} acer-vulina

_(protection

de

_18%).

DISCUSSION

Des cellules

_{lymphoïdes (rate}

ou

_ganglions

mésentériques)

d’animaux immuns

(Oi-seaux ou

_Mammifères)

sont

_capables

de conférer à des animaux neufs une

protec-tion contre leur coccidiose

_après

transfert

(revue

dans

_Rose,

_1987).

Ces transferts

ont

_permis

de démontrer que l’immunité

protectrice

anticoccidienne avait une base cellulaire. Le travail

_présenté

dans cet

article est en accord avec ces résultats.

Cependant,

il

_apporte

3 données nou-velles.

Comme dans le cas du modèle

parasi-taire

_{Nippostrongylus}

brasiliensis chez la souris

_(Rhalem

et

al,

1988),

une stimula-tion in vitro des cellules immunes par des

antigènes

solubles

_spécifiques

_permet

de diminuer le nombre de cellules néces-saires pour en obtenir un résultat

_positif.

Ainsi le nombre

_d’oocystes

d’E tenella

pré-sents dans les caeca au

_jour

7

_après

l’in-fection

_d’épreuve

baisse de

_(3,81

±

_2,73)

x

10

6

chez des receveurs de

10

8

cellules d’animaux immuns non stimulées à

_(0,59

±

0,41)

x

1 O

6

_lorsque

les cellules ont été sti-mulées in vitro

_pendant

20 h à l’aide des

antigènes

solubles

_d’oocystes

_sporulés

du

parasite

(protection

de

_85%).

Le nombre de cellules transférées doit

_cependant

être

supérieur

ou

_égal

à 10! et une stimulation de 12 h est nécessaire. Ce

_temps

de sti-mulation est ici

_{plus long}

_que celui

_qui

était

requis

pour le transfert d’une

protection

contre le nématode intestinal

Nippostron-gylus

brasiliensis

_{(4 h).}

Des cellules d’ani-maux non immuns stimulées ou non ne confèrent pas la

protection,

ce

_qui

_prouve la

_{spécificité}

de la réaction.

Le transfert a donc été réalisé avec suc-cès pour 2 coccidioses de la

_{poule :}

la coc-cidiose caecale à E tenella et la coccidiose intestinale à E acervulina.

Les cellules de rate de

_plusieurs

_poules

immunes ont été

_mélangées

lors de la mise en culture et

_{réinjectées}

à des pou-lets neufs sans

_qu’il

soit tenu

_compte

des

dans les heures

_qui

suivent ce transfert. On

_peut

dès lors

_{imaginer qu’un}

certain nombre de cellules immunes sont attirées localement

_(peut-être

_par

_{l’inflammation)}

et y délivrent leurs effecteurs en inhibant le

développement

du

_parasite,

les animaux étant sacrifiés avant _{que des réactions à}

l’encontre des cellules

_lymphoïdes

ne

por-tant _{pas les mêmes}

_antigènes

d’histocom-patibilité n’apparaissent.

Alors que l’immunité anticoccidienne obtenue à la suite d’une infection est

spéci-fique d’espèce (Rose, 1987)

et que des

phénomènes

de diminution de l’immunité

dirigée

contre une

_espèce

_{donnée par} infection ultérieure des

_poulets

à l’aide

d’une autre

_espèce

ont été notés

(Yvoré

et

al,

1986),

nous montrons _{ici que des}

cellules immunes stimulées

spécifique-ment in vitro

_peuvent

induire une

protec-tion contre une infection

_pratiquée

avec une autre

_espèce

de coccidie. Les

résul-tats obtenus ne sont pas

symétriques :

des cellules de

_poulets

immuns contre E tenel-la stimulées in vitro confèrent une

protec-tion de 70% contre une infection ultérieure par le même

parasite,

mais ne confèrent aucune

_protection

contre une _{infection par} E acervulina. Au

contraire,

les cellules de

poulets

immuns contre E acervulina stimu-lées

_{spécifiquement}

in

vitro,

transfèrent une

_{protection importante}

non seulement

contre une infection ultérieure

_homologue

(78%),

mais aussi contre une infection ul-térieure par E tenella

(68%).

Une stimula-tion in vitro de ces _{cellules par des}

anti-gènes

totaux d’E tenella leur confère le

pouvoir

de transférer une

_{protection qui}

reste bonne contre E acervulina

_(51%)

mais devient médiocre contre E tenella

(28%).

Lillehoj (1987)

avait montré _que ces cel-lules de

_poulets

immuns contre E tenella étaient stimulées in vitro _par

_{l’antigène}

ho-mologue

mais ne

_répondaient

_que

faible-ment contre des

_antigènes

d’E acervulina.

Par contre, Prowse

₍₁₉₉₁₎

a _{démontré que} des cellules de

_poulets

immuns contre E tenella

_{synthétisaient}

de l’interféron gamma à la suite d’une stimulation in vitro par des

antigènes

d’E tenella alors que les cellules de

_poulets

immuns contre E acer-vulina

_{réagissaient}

aussi bien avec des

an-tigènes

d’E acervulina

_qu’avec

des

anti-gènes

d’E tenella. Ces résultats se

rapprochent

de ceux

_qui

ont été obtenus ici en démontrant l’absence de

_symétrie

du transfert.

La

_purification

à l’aide des

_anticorps

re-cueillis dans la bile d’animaux immuns

contre E acervulina

_{d’antigènes}

de surface des

_sporozoïtes

d’E tenella communs aux

2

_{parasites (13}

_protéines,

Rhalem et

al,

1993),

si elle

_permet

de réaffirmer l’efficaci-té du

transfert,

ne

_change

_pas son carac-tère

_{dissymétrique.}

Les cellules immunes contre E tenella

_protègent

contre une

in-fection

homologue (72%)

mais ne

protè-gent

que très

partiellement

contre une in-fection _{par E acervulina}

_(18%).

Au

contraire,

si la

_{protection homologue}

obte-nue _{par transfert des cellules immunes}

contre _{E acervulina stimulées in vitro par}

les

antigènes

de surface

_purifiés

_des

spo-rozoïtes d’E tenella est totale

_lorsque

l’in-fection ultérieure est effectuée avec E

acervulina

_(89%),

elle est

_importante

lors-que cette infection est

_pratiquée

avec E

te-nella

_(69%).

Une telle

_rupture

de la

_{spécificité}

d’es-pèce

a été mise en évidence lors d’essais de vaccination de

poulets

par des

anti-gènes

recombinants,

l’antigène

recombi-nant GX3262

_provenant

d’E tenella indui-sant une

_protection

contre E tenella mais aussi contre E acervulina

(Bhogal

et

al,

1989).

La

_{spécificité d’espèce}

de coccidies

(Rose,

1987)

n’est donc pas absolue. Le transfert de cellules d’animaux im-muns à des animaux neufs

_peut

être

ex-ploité

dans l’avenir dans deux directions

méca-nismes de la

_protection

contre les deux coccidioses

_(séparation

de

cellules,

traite-ment _{par des}

_anticorps

monoclonaux anti-cellules ou

_{anticytokines, comparaison}

avec des transferts de cellules hôtes

com-patibles)

et sélection

_{d’antigènes}

potentiel-lement vaccinants d’autre

_part.

REMERCIEMENTS

Nous remercions M P Yvore

_{(INRA, Pathologie}

aviaire et

_{parasitaire, Nouzilly) qui}

nous a fourni des souches de coccidies et M C Carrat

(INRA, Virologie

et

_{immunologie moléculaires)}

pour l’analyse

statistique.

Ce travail a bénéficié

de l’aide matérielle de la Fondation

Internatio-nale pour la Science dans le cadre du _Projet B/1747-1.

RÉFÉRENCES

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StraLsberg

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A

_rapid

and sensitive method for the

quantitation

of

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of

protein utilizing

the

_principle

of

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binding.

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Danforth HD

₍₁₉₈₃₎

Use of monoclonal antibo-dies directed

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Lillehoj

HS,

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(1989)

Eimeria tenella and E acervulina

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secreted

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an avian T cell

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