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34 2. Etude de la fonction et de la régulation de Stat3 dans les cellules de la crête neurale
Nos résultats ont montré que le facteur de transcription Stat3 est essentiel pour les fonctions de Hairy2 indépendantes de sa capacité de liaison à l’ADN dans la CN. Afin de mieux comprendre les mécanismes contrôlant la prolifération des cellules de la CN, nous avons étudié la fonction et la régulation du gène Stat3 dans la CN. Stat3 est un facteur de transcription ubiquitaire de la famille Stat. Les protéines de cette famille sont présentes sous forme inactives dans le cytoplasme et sont activées par phosphorylation en réponse à des signaux extracellulaires. La phosphorylation de Stat3 au niveau de la Tyr705 induit sa dimérisation et sa translocation dans le noyau où celui-ci peut activer l’expression de ses gènes cibles (Levy and Darnell, 2002). De manière intéressante, de nombreuses recherches ont montré que Stat3 joue un rôle dans le contrôle de la prolifération et la maintenance des cellules souches embryonnaire à l’état indifférencié (Bromberg, 2001; Niwa et al., 1998).
Dans notre travail sur Stat3, nous pouvons distinguer cinq parties. Dans un premier temps, nous avons étudié le rôle de Stat3 au cours de la formation de la CN. Nous avons d’abord mis en évidence que la protéine Stat3 endogène est bien phosphorylée et activée lors des étapes précoces de la formation de la CN. Ensuite, nous avons montré, par des expériences de gain et de perte de fonction, que Stat3 joue un rôle crucial dans la survie, la prolifération et l’expression des gènes de la CN et de la bordure de la plaque neurale. Nos données suggèrent également que la phosphorylation au niveau de la Tyr705 de Stat3 est nécessaire à l’activité de Stat3 dans la CN.
Dans un deuxième temps, nous nous sommes intéressés à la régulation de l’activité de Stat3. Nos résultats ont montré que la voie de signalisation FGF par l’intermédiaire du récepteur FGFR4 phosphoryle Stat3 dans l’ectoderme. Des expériences de localisation subcellulaire et de gène rapporteur luciférase ont montré que Stat3 entre dans le noyau et active ses gènes cibles après stimulation par FGF/FGFR4, confirmant que Stat3 était bien activé par cette voie de signalisation. De plus, nous avons montré que Stat3 interagissait spécifiquement avec la partie intracellulaire de FGFR4 mais pas avec celle des autres FGFRs.
Enfin, nos données indiquent que Stat3 est requis en aval de FGFR4 in vivo dans les embryons pour la prolifération et la formation de la CN.
Dans un troisième temps, nous avons étudié les interactions entre les facteurs de transcription Stat3 et Hairy2. Des expériences de co-immunoprécipitation ont d’abord révélé que Hairy2 interagit spécifiquement avec Stat3 et la partie intracellulaire de FGFR4, formant
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35 ainsi un complexe ternaire. L’analyse de mutants de délétions de Hairy2 indique que le domaine Orange de Hairy2 est requis pour la liaison à Stat3 tandis que le domaine N-terminal de Hairy2 est nécessaire pour l’interaction avec la partie intracellulaire de FGFR4. Des expériences de localisation subcellulaire avec des protéines fusionnées à la GFP ont montré que Stat3 et Hairy2 co-localisent partiellement à la membrane cellulaire. Ensuite, nos résultats ont démontré que Hairy2, similairement à FGF/FGFR4, augmente la phosphorylation, la localisation nucléaire et la capacité de Stat3 d’activer ses gènes cibles. Des expériences de sur- et sous-expression ont également indiqué que Hairy2 et Stat3 coopèrent dans la formation de la CN in vivo, dans l’embryon, et in vitro, dans un système d’explants de calottes animales.
Ces résultats démontrent que Hairy2 est un régulateur positif de l’activité de Stat3.
Dans une quatrième partie, nous nous sommes intéressés aux interactions entre les facteurs Stat3 et Id3, étant donné que nous avons précédemment mis en évidence qu’Id3 se lie à Hairy2 et bloque son activité. Nos résulats ont montré qu’Id3 diminue la phosphorylation, la localisation nucléaire et la capacité de Stat3 d’activer ses gènes cibles. De manière intéressante, nous avons montré qu’Id3 interagit physiquement avec Stat3 et que Hairy2 et Id3 compètent pour se lier à Stat3. Nos résultats ont également montré qu’Id3 lie spécifiquement la partie intracellulaire de FGFR4 et qu’il empêche la formation du complexe entre Stat3 et FGFR4. De plus, par des expériences de gain et perte de fonction, nous avons aussi montré qu’Id3 module négativement l’activité de Stat3 dans la CN in vivo et in vitro. Ces résultats démontrent qu’Id3, contrairement à Hairy2, régule donc négativement l’activité de Stat3.
Dans la dernière partie de ce travail, nous avons d’abord étudié les effets de la surexpression de différentes doses de Stat3 sur l’expression des gènes Hairy2 et Id3 in vivo dans l’embryon et in vitro dans un système d’explant. Nos résultats ont montré que Stat3 contrôle la transcription des gènes Hairy2 et Id3 de manière opposée et dose dépendante, Hairy2 étant activé à faible dose et Id3 à forte dose de Stat3. Ensuite, Nos résultats indiquent également que Stat3 régule de manière dose dépendante la prolifération et la différenciation des cellules de la CN. Nous avons observé, par des expériences similaires, qu’une faible activité de Stat3 stimule la prolifération cellulaire et l’expression des gènes spécifiques de la CN tandis qu’une forte activité de Stat3 ralentit le cycle cellulaire et inhibe l’expression des gènes de la CN et maintient les cellules de l’ectoderme dans un état non spécifié et indifférencié.
De l’ensemble de ces résultats, nous concluons que Stat3 auto-régule sa propre activité en aval de la voie de signalisation FGF. Cette auto-régulation s’effectue indirectement via Hairy2 et Id3 qui, respectivement, forment une boucle de rétro-contrôle positive et négative.
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36 Nous proposons que, en aval des FGFs, la régulation séquentielle de l’activité de Stat3 par le rétro-contrôle positif de Hairy2 et négatif d’Id3, est important pour la coordination de la progression du cycle cellulaire et de la spécification de la CN.
Ces résultats ont été repris dans l’article : Self-regulation of Stat3 activity coordinates cell cycle progression and neural crest specification, publié dans le journal EMBO J.
