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32 1. Etude de la fonction et des propriétés biochimiques de Hairy2 dans les cellules de la crête neurale
Le laboratoire d’Embryologie Moléculaire étudie les mécanismes moléculaires contrôlant la mise en place du système nerveux durant l’embryogenèse chez les vertébrés. Précédemment, le laboratoire s’est intéressé à la famille des gènes Hairy and Enhancer of Split, bien connue pour être des gènes cibles de la voie Notch et plus particulièrement aux gènes HRT1 (Taelman et al., 2004) et Hes2 (Solter et al., 2006). Le gène Hairy2 code pour un facteur de transcription bHLH-O de cette famille et a été identifié comme partenaire protéique de HRT1.
Hairy2 est exprimé précocement de manière régionalisée dans l’embryon au niveau du plancher du tube neural et de la bordure de la plaque neurale incluant les progéniteurs des cellules de la CN (Tsuji et al., 2003). Nous avons donc entrepris de caractériser le rôle, le mode d’action et les mécanismes contrôlant l’expression de Hairy2.
Premièrement, nous avons mis en évidence par des expériences de gain et perte de fonction que Hairy2 est régulé dans la CN par les voies de signalisation FGF, Wnt et BMP mais de manière surprenante, pas par la voie Notch. Nous avons également montré par des expériences d’épistasie que Hairy2 est essentiel pour la formation de la CN en aval de la voie FGF. Ensuite, nous avons étudié sa fonction par des sur- et sous-expression. Pour ce faire, nous avons utilisé un vecteur d’expression de Hairy2 permettant un contrôle temporel de l’activité de la protéine et des morpholinos oligos pour réaliser des gains et perte de fonction, respectivement. Nos résultats indiquent que Hairy2 est essentiel pour la survie, la prolifération et la formation de la CN. Nos expériences de surexpression suggèrent également que Hairy2 maintient les cellules dans un état indifférencié en réprimant l’expression précoce des gènes spécifiques de la CN. Plus tardivement, aux stades têtard, la surexpression de Hairy2 augmente l’expression de GFAP, un marqueur des cellules gliales, alors que les autres dérivés de la CN sont toujours réprimés. De plus, nous avons montré que Hairy2 régule négativement la transcription d’Id3, un autre gène impliqué dans la prolifération des cellules de la CN (Light et al., 2005; Kee and Bronner-Fraser, 2005). Nos données ont montré que, in vivo et in vitro, Hairy2 réprime Id3 via l’inhibition de BMP4 de manière dépendante à sa capacité de liaison à l’ADN. De manière surprenante, nous avons montré que Hairy2, contrairement à d’autres protéines Hes/Hairy, interagit physiquement avec Id3 et que ce dernier bloque l’activité de la protéine Hairy2 par séquestration. Une analyse de mutants de délétion a montré que le domaine Orange de Hairy2 et le domaine HLH de Id3 sont requis
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33 pour cette interaction. Enfin, des expériences d’épistasie ont montré qu’Id3 est requis en aval de Hairy2 pour la formation et la prolifération des cellules de la CN.
Deuxièmement, la comparaison de mutants de Hairy2, avec la protéine sauvage, nous a permis de démontrer que Hairy2 fonctionne selon deux mécanismes distincts, de manière dépendante ou indépendante de sa capacité de liaison à l’ADN. Nos données indiquent que la capacité de Hairy2 à promouvoir la survie et la maintenance des cellules progénitrices de la CN dans un état non spécifié et indifférencié nécessite la liaison à l’ADN tandis que la capacité de Hairy2 à stimuler la prolifération cellulaire et l’expression des gènes spécifiques des cellules de la CN ne nécessite pas de liaison à l’ADN. Nos résultats ont également révélé que Hairy2 augmente la transcription du ligand du récepteur Notch, Delta1. Cette activation de Delta1 requiert le domaine N-terminal qui est spécifique à Hairy2. De plus, nous avons montré que Delta1 est requis en aval de Hairy2 uniquement pour ses fonctions indépendantes de sa capacité de liaison à l’ADN (augmentation de la prolifération et des gènes spécifiques des cellules de la CN) mais pas pour ses fonctions dépendante de sa capacité de liaison à l’ADN (survie et maintenance des cellules dans un état indifférencié). Finalement, nos données indiquent que le facteur de transcription Stat3, connu pour activer directement Delta1 en se liant sur son promoteur (Yoshimatsu et al., 2006), est requis pour l’activation de Delta1 par Hairy2 et que ces deux facteurs coopèrent pour activer la transcription de Delta1.
Ces résultats ont été repris dans deux articles : Hairy2-Id3 interactions play an essential role in Xenopus neural crest progenitor specification et Hairy2 functions through both DNA-binding and non DNA-binding mechanisms at the neural plate border in Xenopus, publiés tous les deux dans le journal Developmental Biology.
