Chapitre III : Matériel et méthodes.

Chapitre III : Matériel et méthodes.

Chapitre III : Matériel et méthodes.

III.1. Milieux de cultures, souches bactériennes et solutions tampons.

Milieu 284 (Schlegel et al., 1961)

Ce milieu de culture est un milieu minimum qui a la particularité de peu complexer les métaux, du fait de sa teneur réduite en phosphates. La source de carbone ajoutée au milieu est métabolisable par C. metallidurans, il s’agit de gluconate ou d’azélate à une concentration de 0.2 %. Les milieux solides sont préparés avec 2% d’agar. Les différentes concentrations en cuivre sont obtenues par dilution d’une solution stock de nitrate de cuivre à 100 mM ou 1M.

Par litre d’eau distillée :

Composé Prise

Tris/ HCl 6.06 g

NaCl 4.68 g

KCl 1.49 g

NH

Cl 1.07 g

Na

SO4 0.43 g

MgCl

.6H

O 0.2 g

CaCl

.2H

O 0.03 g

Na

HPO

.2H

O 4 ml d’une solution 1% (p/v) Fe(III)NH

Citrate 10 ml d’une sol. à 0.48 g/l

Complément SL-7 1 ml

La solution est mise à pH 7 au moyen d’HCl concentré.

Complément SL-7, par litre d’eau distillée :

Composé Prise

25% HCl 1.3 ml

ZnSO

.7H

O 144 mg

MnCl

.4H

O 100 mg

H

BO

62 mg

CoCl

.6H

O 190 mg

CuCl

.2H

O 17 mg

NiCl

.6H

O 24 mg

NaMoO

.2H

O 36 mg

Chapitre III : Matériel et méthodes.

Milieu Schatz.

Ce milieu de culture est un milieu minimum susceptible de complexer les métaux. La vitesse de croissance de C. metallidurans sur ce milieu est plus rapide que sur le milieu 284 A.

Schlegel. La source de carbone ajoutée au milieu est métabolisable par C. metallidurans il s’agit de gluconate ou d’azélate à une concentration de 0.2 %. Les milieux solides sont préparés à 2% d’agar. Par litre d’eau distillée :

Composé Prise

KH

PO

1 g

NH

NO

1 g

MgSO

.7H

O 0.2 g

FeSO

.7H

O 1 ml d’une solution 1%

CaCl

.2H

O 1 ml d’une solution 1%

La solution est mise à pH 7 au moyen d’une solution de NaOH 40%.

Milieu 853 (Mergeay et al. 1985; Schlegel et al. 1961).

Le milieu 853 est un milieu riche utilisé pour la croissance de C. metallidurans et de E. coli.

Les milieux solides sont préparés à 1,5 % d’agar (p/v). Ce milieu étant riche en phosphates ajoutés, il ne convient pas à l’étude de la résistance aux métaux car ils se complexent et précipitent dans celui-ci, et ce dès des concentrations en métaux de l’ordre du mM. Par litre d'eau distillée :

Composé Prise

Tryptone (ou biotrypicase) 10g

Extrait de levure 5g

NaCl 5g

D+ Glucose 1g

K

HPO

0.7g

Milieu 869 (Bertani et al. 1951) et 869:10 (cette étude).

Le milieu 869 est un milieu riche qui est cependant parfois utilisé (dilué dix fois) pour étudier des phénotypes vis-à-vis des métaux lourds, car contrairement au milieu 853, il n’y a pas de phosphates ajoutés. Il est utilisé aussi bien pour la croissance de C. metallidurans que E. coli.

Les milieux solides sont préparés à 1.5% d’agar. Par litre d’eau distillée :

Composé Prise

Tryptone 10 g

Extrait de levure 5 g

NaCl 5 g

D+ Glucose 1 g

CaCl

.2H

O 0.345 g

Amener la solution à pH 7 au moyen de NaOH 40%.

Le milieu 869 :10 consiste en la dilution du milieu 869 d’un facteur dix.

Chapitre III : Matériel et méthodes.

Milieux SOB et SOC.

Ces milieux interviennent dans la préparation de cellules électrocompétentes et après la transformation des cellules électroporées.

Pour le milieu SOB, par litre d’eau distillée :

Composé Prise

Bacto-tryptone 20 g

Extrait de levure 5 g

NaCl 0.584 g

KCl 0.186 g

La solution est mise à pH 7 au moyen de NaOH 40%.

Solution stock de Mg(II) 2 M, par 100 ml d’eau distillée :

Composé Prise

MgCl

.6H

O 20.33 g

MgSO

.7H

O 24.65 g

Solution stock de glucose 2 M, par 100 ml d’eau distillée :

Composé Prise

glucose 36.04 g

Stériliser cette solution par filtration.

Pour le milieu SOC, pour préparer 100 ml de milieu :

Composé Prise

Sol. stock Mg

2M 1 ml

Sol. stock glucose 2M 1 ml

Milieu SOB 98 ml

Tampon RD.

Le tampon RD (Merck) est utilisé pour laver et diluer les bactéries pour les expériences de cytométrie de flux. Il sert également à préparer les solutions extemporanées de fluorochromes utilisées en cytométrie de flux. Le milieu est stérilisé par chaleur humide et conservé à 4°C pour une durée maximale de 1 mois.

Par litre d'eau distillée :

Composé Quantité

Peptone 1 g

Chlorure de sodium 8,5 g

Chapitre III : Matériel et méthodes.

Tampon Tris HCL.

Le tampon Tris HCL est préparé au moyen de Tris-(hydroxyméthyl)aminométhane, toutes les solution tampon sont préparée à partir d’une solution stock à 1M en Tris dans de l’eau milli- Q. Le pH de la solution est tamponné au moyen d’HCl concentré à 25% (v/v). Ce tampon sert de base comme tampon de chromatographie ou d’extraction de protéines totales.

Tampon TAE.

Le tampon TAE est utilisé pour réaliser des électrophorèses d’ADN. Un stock cinquante fois concentré est préparé. Par litre d’eau distillée :

Composé Quantité

Tris base 242 g

Acide acétique glacial 57,1 ml

EDTA 0.5M 100 ml

Ajuster à pH 8.5 avant de compléter à 1 litre. De l’agarose purifié (ROCHE) est utilisé à 1%

ou 2% (p/v) dans du TAE pour réaliser les gels pour électrophorèse d’ADN.

III.2. Souches bactériennes.

III.2.1. Souches dérivées de la souche C. metallidurans CH34.

Cinq souches de C. metallidurans CH34 ont été sélectionnées comme référence dans ce travail, ces souches ont été obtenues par mutation au moyen d’un choc thermique (Mergeay et al., 1985) ou par transformation:

• C. metallidurans CH34 : souche ayant le génotype sauvage. Elle possède les deux grands plasmides pMOL28 et pMOL30.

• C. metallidurans AE104 : souche, ne possédant pas de plasmides.

• C. metallidurans AE126: souche ayant perdu le plasmide pMOL30.

• C. metallidurans AE128: souche ayant perdu le plasmide pMOL28.

• C. metallidurans AE1744 : dérivé de la souche AE104 où le plasmide recombinant

pMOL1024 a été introduit par transformation (Borremans et al., 2001). Ce plasmide est

construit au départ d’un vecteur de clonage pLAFR3, porteur d’une résistance à la tétracycline

(Staskawicz, et al., 1987), dans lequel le cluster cop de pMOL30 a été inséré dans un site

BamHI après digestion du partielle du plasmide pMOL30 par ce même enzyme.

Chapitre III : Matériel et méthodes.

III.2.2. Mutants insertionnels des gènes cop de pMOL1024 et pMOL30.

Transformation du plasmide pMOL1024.

Les souches utilisées sont les suivantes :

• E. coli CM 1684 est une souche de E. coli DH10B contenant le plasmide recombinant pMOL1024 (Tet

, voir pt III.2.1.).

• E. coli MC1061 : souche de génotype, F

, Ara

, Leu

.

• E. coli CM404 : souche Leu

Pro

, Thi

, Lac

, portant le plasmide pRK2013 (Km

). Ce plasmide de type « helper » est porteur de gènes codant pour la mobilisation et le transfert de plasmides. Toutefois, le pRK2013 est non-réplicatif dans C. metallidurans et ne peut s’y maintenir.

• C. metallidurans CH34 et C. metallidurans AE104 : voir au point III.2.1.

Les mutants ont été obtenu en utilisant le kit de mutagenèse EZ-Tn5™ <DHFR-1> Insertion Kits (EPICENTRE Technologies). Le principe de la mutagenèse est décrit à la figure III.1. Le transposon utilisé est appelé « miniTn5 » (Trim

).

Figure III.1. : Principe de mutagenèse in vitro du kit EZ-Tn5™ <DHFR-1> Insertion Kits (EPICENTRE Technologies).

pMOL1024 (Tet^R)

Trim^R

853 + Tet 20 µg/ml + Trim 100 µg/ml

pMOL1024 :: miniTn5

= pSVTn

Chapitre III : Matériel et méthodes.

Le protocole complet utilisé pour cette expérience est le suivant :

1. Extraire de la souche E. coli CM 1684 le DNA du plasmide pMOL1024. Cette extraction est obtenue au moyen du kit d’extraction de plasmide QIAprep Spin Miniprep (QIAGEN) en utilisant le protocole adapté aux plasmides de plus de 10 kb.

2. Réaliser sur le plasmide pMOL1024 la mutagenèse in vitro au moyen du kit EZ-Tn5™

<DHFR-1> Insertion Kits (EPICENTRE Technologies) contenant le transposon portant le gène de résistance au triméthoprime, une transposase et une solution permettant l’arrêt de la réaction. La réaction est réalisée avec des quantités équimolaires de cosmide et de transposon de sorte qu’il y ait statistiquement une seule insertion par cosmide pMOL1024. La réaction est réalisée in vitro et le miniTn5 ne code pas pour la transposase, ce qui limite les risques de transposition in vivo, de plus ce transposon est de type « single oper » et par définition il est très stable dans la souche hôte.

3. Electroporer les cosmides mutés dans une souche de E. coli MC1061. Le milieu de sélection est un milieu riche contenant de la triméthoprime (100 µg/mL) et de la tétracycline (20 µg/mL). Nous obtenons ainsi une banque de mutants dans le pMOL1024. Les plasmides présents dans les transformants sont nommés pSVTn où n est le numéro du plasmide (avec n= 1 à 284).

4. Après purification des souches, extraire les plasmides recombinants au moyen du kit d’extraction de plasmide QIAprep Spin Miniprep (QIAGEN).

5. La concentration des ADN extraits est mesurée par spectrophotomètre Nanodrop ND- 1000 et envoyés pour séquençage. Les amorces utilisées pour la localisation du transposon (et situées aux extrémités de celui-ci) sont :

DHFR-1 FP-1 Forward Primer 5' GGCGGAAACATTGGATGCGG 3' DHFR-1 RP-1 Reverse Primer 5' GACACTCTGTTATTACAAATCG 3'

6. Le transfert des plasmide muté vers C. metallidurans AE104 ou vers C. metallidurans CH34 se fait par conjugaison triparentale (voir point III.2.3).

Conjugaison triparentale.

Les plasmides provenant des différents mutants sont transférés d’E. coli MC1061 pSVTn (souche donneuse) à C. metallidurans CH34 ou AE104 (souche receveuse) par conjugaison triparentale à l’aide d’une souche «helper» E. coli CM404.

Voici les différentes étapes :

1. Mettre en culture les trois souches (donneuse, receveuse et helper) dans trois tubes contenant 4 mL de milieu riche 869. Incliner les tubes et laisser incuber toute la nuit à 30°C et 200 rpm.

2. Prélever 25 µ L de chacune des cultures et les déposer sur une boîte de milieu riche 869 divisée en quatre zones. Prélever de nouveau 25 µ L de chacune des cultures et les réunir en une goutte sur la quatrième zone de la boîte.

3. Incuber 24 heures à 30°C.

4. Récupérer la zone de croissance de la quatrième zone et la resuspendre dans 1 mL de MgSO

10

M.

5. Réaliser des dilutions successives (jusque 10

) dans du MgSO

10

M.

6. Trois gouttes de 30 µ L de suspension cellulaire d'une dilution sont déposées sur chaque

tiers de boîte (méthode des 3 gouttes voir figure III.2.).

Chapitre III : Matériel et méthodes.

Figure III.2 : Méthode des 3 gouttes : trois gouttes de 30 µl chacune sont déposée sur milieu gélosé.

Pour C. metallidurans AE104 :

7. Le milieu Schatz azélate + tétracycline (20 µg/mL) + triméthoprime (100 µg/mL) correspondant au milieu de sélection pour les cellules transconjugantes (C.

metallidurans AE104 pSVTn. En effet, l’azelate étant une source de carbone qui n’est pas métabolisable par E. coli, et le Tet et la Trim combinées sélectionnent pour les plasmides pSVTn.

8. Les colonies isolées sont purifiées sur le milieu gélosé sélectionnant le pSVTn puis mises en collection par cryogénisation en présence de glycérol 50%. Avant la mise en collection, le génotype est vérifié à nouveau par PCR au moyen d’amorce située aux extrémités du gène cop identifié comme celui qui contient le transposon miniTn5.

Pour C. metallidurans CH34 :

7. Le milieu 284 azélate + triméthoprime (100 µ g/mL) sélectionne les cellules receveuses (C. metallidurans CH34) ayant intégré un Tn Trim

.

8. Prendre une colonie du milieu sélectif et la mettre en culture dans 10 ml de 284 azélate + Trim (100µg/ml). Laisser croître 48h.

9. Réaliser des dilutions logarithmiques et étaler 100 µl de la dilution à 10

sur 284 azélate + Trim (100µg/ml). Incuber 3 jours à 30°C.

10. Faire une réplique des colonies sur boites de milieu 284 azélate + Trim (100µg/ml) + Tet (20 µg/ml)+ Zn(II) 1 mM.

11. Sélectionner les souches de phénotype Trim

et Tet

: ces souches ont perdu le plasmide pSVTn mais le transposon miniTn5 s’est intégrés vraissemblablement dans le plasmide pMOL30 par double recombinaison homologue. Le Zn(II) 1 mM est utilisé pour s’assurer que le plasmide pMOL30 est bien présent. Les bons candidats Trim

et Tet

sont conservés en collection par cryogénisation à -80°C en présence de glycérol 50%.

Avant la mise en collection, le génotype de la souche est vérifié à nouveau par PCR au moyen d’amorces située aux extrémités du gène cop identifié comme celui qui contient le transposon miniTn5 (voir point suivant, III.2.2.3).

10 ^-6

10 ^-5 10 ^-4

Chapitre III : Matériel et méthodes.

Vérification du génotype des mutants après transfert vers C. metallidurans.

Une réaction en chaîne par la polymérase (ou PCR pour Polymerase Chain Reaction, en anglais) permet de vérifier le site d’insertion du transposon dans les différents transconjugants AE104 pSVTn. Les transconjugants sont prélevés du milieu sélectif Schatz contenant de l'azélate et de la triméthoprime (100 µ g/mL) (et de la tétracycline pour les insertions dans pMOL1024 ou du Zn(II) 1 mM pour les insertions dans pMOL30).

1. Prélever une colonie contenant une insertion dans les gènes d’intérêt et les resuspendre dans 50 µ L d’eau distillée stérile.

2. La réalisation de la réaction se fait avec de la Taq DNA polymérase (kit PCR Master Mix 2x Promega).

3. Dans les tubes PCR, préparer les échantillons selon la composition suivante :

• suspension cellulaire : 2,5 µ L

• amorces (pour les brins direct et inverse) : 5 µ L de chaque, à 10 nM de concentration finale

• PCR Master Mix 2x concentré (Promega) : 12,5 µL 4. Les conditions de la PCR sont les suivantes :

• Hybridation : 55°C durant 45 secondes

• Elongation : 72°C durant 8 minutes

• Dénaturation : 94°C durant 60 secondes

• Nombre de cycles : 30

5. Les amorces (Sigma) se fixent aux deux extrémités des gènes cop :

• copA direct : CCGTTTCGTACAAGGTTTGG

• copA inverse :CACAAGTACTTCGCGGAACA

• copB direct : GGCCTGATCCGACTTCTCTTC

• copB inverse : AGAACCACATGCGAATACCC

• copD direct : AACTGTCGCAGTGCGTTTC

• copD inverse : ATTTGCATGGGGGAAAGAAT

• copE direct : CGTATCCATATGCATCGTCTGTTCCGACGG

• copE inverse : CGTATCCTCGAGGGTCTCGTTGCGAGGAGCTGC

• copR direct : ATTTGCATGGGGGAAAGAAT

• copR inverse : AGGTGCCTCGAGGACGTATC

• copS direct : ACCGTCTGTCCCTGACTG

• copS inverse : GGAACGTCATGGTGAAACG

• copK direct : CGGTCGATATGAGCAATGTC

• copK inverse : GAGCCTGAAAATCTCGTTGC

• copF direct : ATGAATGACCGTAGCCCGCTC

• copF inverse : TCAGACAGCCGTCCGCCTGAG

• copG direct : ATGAAATACCTGTTTGCCGCT

• copG inverse : TTAATCTTGGGAGAAGGGCTT

• copV direct : CGTATCCATATGAATCCGGATATCTACCGC

Chapitre III : Matériel et méthodes.

• copV inverse : CGTATCCTCGAGCAGGTAGCCGCCCACAAGGCC

• copM direct : CGTATCCATATGAAAAGACAGTTCTCGAAC

• copM inverse : CGTATCCTCGAGGGGCGCATTGGGTCCACCATG

• copT direct : ATGCCCGACCTGTCTCATCT

• copT inverse :CGCGTTCACAGAACTTT

• copJ direct : GGCCTCCTGGGGTTAGGTA

• copJ inverse : CGACCGATGTACTCGTTGGT

• copL direct : CTCATCGAACGCTGGAAATC

• copL inverse : AGGCTGGAGTATGGGACGTA

• copQ direct : CGTATCCATATGGAGATTATGAAAACGCTG

• copQ inverse : CGTATCCTCGAGAGCGCGCCGTCAGAGAACGTATC

6. Après réaction, les fragments amplifiés sont analysés sur gel d’agarose pure à 1% (p/v) dans du tampon TAE en présence de 0,1 µg/ml de concentration finale en broumre d’éthydium. L’augmentation de la taille du fragment correspondant à l’insertion du Tn (soit 1kb de plus que la taille du gène cop fonctionnel) est visualisée sur gel par comparaison avec le fragment amplifié sur la souche de référence AE1744.

Figure III.3 : Visualisation de la taille des fragments amplifiés pour le transconjugant AE104 pSVT copR ::miniTn5.

Les souches obtenues sont alors notées C. metallidurans pMOL30 ::miniTn5 ou pMOL1024 ::miniTn5 (dans ce cas, le plasmide est aussi appelé pSVTn) et constituent une banque de mutants de la souche AE1744 ou CH34 dans laquelle un des gènes cop a été inactivé par insertion d’un transposon, ces mutants sont communément nommés « mutants knock-out ».

copR :: miniTn5

copR

Chapitre III : Matériel et méthodes.

III.2.3. Souches recombinantes de E. coli surexprimant les gènes copI et copK.

Construction du vecteur d’expression de copI et insertion du plasmide dans la souche de surexpression.

La première étape de la construction du vecteur d’expression consiste en l’amplification du gène copI. Les primers utilisés sont les suivants :

• copI direct : CGTATCCATATGAAGACACTCGCGCTTTCTCTC

• copI inverse : CGTATCAGATCTTCATTTTCTCACAAGCACCTT

Les codons d’initiation et de terminaison de la traduction sont écrits en rouge. L’amorce CopI direct porte un site de restriction Nde I (CATATG-en rose/rouge) et CopI inverse porte un site de restriction Bgl II (AGATCT-en vert).

Les conditions de la PCR (Polymerase Chain Reaction) sont les suivantes :

• Température d’hybridation : 50°C durant 30 secondes

• Température d’élongation : 72°C durant 3 minutes

• Température de séparation des brins : 95°C durant 30 secondes

• Nombre de cycle : 30

L’enzyme utilisé est la Pwo polymérase (INVITROGEN) qui génère des extrémités franches.

Le fragment obtenu est introduit dans le gène létal pour E. coli ccdB du vecteur de transition pTOPO grâce à la topoisomérase I du virus Vaccinia. Le plasmide recombinant est transféré à une souche compétente et seules les cellules transformées peuvent survivre. L’ADN du plasmide pTOPO modifié est alors extrait au moyen d’un kit QIAprep Spin Miniprep. Le fragment portant le gène copI est obtenu par digestion avec les enzymes BglII et NdeI, il est inséré dans le vecteur d’expression pET15-b (NOVAGEN) linéarisé par digestion avec NdeI et BamHI. Le pET15-b porte un gène de résistance à l’ampicilline et introduit une étiquette 6- His à l’extrémité N-terminale de la protéine CopI. Le plasmide pET15-b ainsi obtenu est introduit dans la souche de E. coli Rosetta (résistante au chloramphénicol). Le milieu sélectif des cellules transformées est donc un milieu riche contenant de l’ampicilline (25 µg/ml) et du chloramphénicol (30 µg/ml). L’expression du gène copI dans cette construction est inductible à l’IPTG.

Construction du vecteur d’expression de copK et insertion du plasmide dans la souche de surexpression.

Le protocole complet est fourni dans les articles en annexe 3 (Tricot et al., 2005, Bersh et al., soumis).

III.3. Analyses physiologiques et phénotypiques.

III.3.1. Courbes de viabilité.

La mesure de viabilité est effectuée sur milieu solide 284 gluconate. Du Cu(II) est ajouté au

milieu solide à des concentrations comprises entre 0,1 et 1,2 mM. Pour l’addition de Cu(I), on

ajoute 1mM d’ascorbate de sodium, avant d’ajouter du Cu(II) à des concentrations comprises

entre 10 et 50 µM, on considère que la totalité du Cu(II) est réduite en Cu(I) par ce large excès

d’ascorbate.

Chapitre III : Matériel et méthodes.

Le protocole est le suivant :

1. Préparer une pré-culture liquide en milieu 284 gluconate des différentes souches de C.

metallidurans et incuber pendant une nuit à 30°C et 200 rpm. Au besoin, ajouter du cuivre dans la préculture (cas des courbes de viabilité pour une population acclimatée) 2. Au départ de la pré-culture, réaliser des dilutions décimales successives des

échantillons (jusqu'à 10

).

3. Trois gouttes de 30 µ L de suspension cellulaire d'une même dilution sont déposées sur chaque tiers de boîte (méthode des 3 gouttes voir figure III.2) de milieu solide.

4. Incuber les boîtes à 30 °C pendant 5 jours. Les cultures sur Cu(I) sont incubées dans une étuve opaque, l’ascorbate étant lumino-sensible.

5. Compter le nombre d'unités formant colonie (ou UFC) à l'endroit où les trois gouttes ont été déposées pour la dilution la plus adéquate et calculer la moyenne.

6. Exprimer le résultat obtenu par rapport au nombre de colonies sur milieu 284 gluconate sans cuivre ajouté qui correspond à 100 % de viabilité.

7. Lorsque aucune UFC n’est comptée sur milieu solide à la dilution 10

, on considère que la viabilité est au maximum de 0,03 % (sachant qu’environ 30 UFC sont comptées dans la dilution initiale à 10

)

III.3.2. Courbes de croissance.

1. Remplir les tubes de 10 ml de 284 gluconate au moyen d’une dispensette calibrée et stériliser à 121°C durant 20 minutes.

2. Introduire stérilement le volume voulu de solution stock stérile de Cu(NO)

à 100 mM, au nécessaire ajouter de l’ascorbate à la solution.

3. Les tubes regroupant une gamme de concentrations en Cu(II) (de 0 à 3 mM) sont inoculés par 500 µl d’une préculture de C. metallidurans à DO

de 1,3 UA. Le milieu de préculture est un milieu 284 gluconate ne contenant pas de cuivre.

4. Les tubes sont incubés à 30°C avec une agitation orbitale de 200 rpm. Les tubes doivent être inclinés à 45°.

5. La DO des cultures en tubes est mesurée à 660 nm (GENESYS 2000) jusqu’à ce

qu’elle atteigne la fin de la phase exponentielle de croissance.

Chapitre III : Matériel et méthodes.

III.3.3. Etudes par cytométrie de flux.

Calibration, étalonnage et paramètres du cytomètre de flux.

Le cytomètre en flux est un Epics XL (Beckman Coulter). C’est un cytomètre d’analyse muni d’un laser à argon 488nm refroidi à l’air et équipé de deux détecteurs capables de mesurer la lumière diffusée aux petits angles (FSC ou forward scatter, qui nous donne une idée relative de la taille des cellules) et la lumière diffusée à 90°C (SSC ou side scatter qui nous donne une idée de la forme (invaginée ou non) des cellules et de la présence de vacuoles) ainsi que de quatre détecteurs fluorescents. Les quatre détecteurs permettent de mesurer la fluorescence émise dans quatre canaux de longueurs d'onde différents :

FL1 : filtre à bande passante de 525 nm : pour la fluorescence verte FL2 : filtre à bande passante de 575 nm : pour la fluorescence orange FL3 : filtre à bande passante de 620 nm : pour la fluorescence rouge

FL4 : filtre à bande passante de 675 nm : pour la fluorescence rouge extrême

Le cytomètre mesure une intensité de fluorescence relative dépendante des réglages (nombre de volts sur les détecteurs par exemple), de la configuration du banc optique de l’instrument (choix de la lumière d’excitation et choix des filtres devant les détecteurs) mais aussi du degré de polarisation de la fluorescence. L'intensité relative de fluorescence (ou MFI : Mean Fluorescence Intensity) est utilisée pour caractériser la distribution de fluorescence d’une population de particules. Pour un fluorochrome donné, l’intensité de fluorescence de chaque particule est distribuée sur une échelle de 256 ou 1024 canaux selon que l'échelle utilisée est linéaire ou logarithmique. La MFI exprime le canal moyen ou médian de l’ensemble des canaux occupés par la distribution de fluorescence des particules. Cette mesure en canaux est secondairement transformée en unités arbitraires de 0.1-1000. Cette transformation a pour but de tenir compte de la nature logarithmique de la mesure. Traditionnellement, on utilise la moyenne de la distribution de fluorescence pour comparer deux situations expérimentales, lues par l’instrument, dans les mêmes conditions.

Molecules of equivalent soluble fluorochrome (unités MESF)

La MFI d’une population de particules, (éventuellement la fluorescence propre d’un élément ou d’une cellule), colorées par un fluorochrome est traduite en un nombre de molécules du fluorochrome en solution, donnant une fluorescence équivalente à celle de la particule chargée. Pour chaque condition expérimentale (chaque souche de bactérie et chaque fluorochrome utilisé), nous avons établi des courbes de calibration à partir de billes de latex de la marque Sperotech, recouvertes d’une quantité connue et croissante de fluorochrome vert, orange, rouge ou extrême rouge. Ces billes sont elles-mêmes calibrées par rapport à une série de dilutions du même fluorochrome. Ces billes calibrées servent à l’établissement de nos courbes de référence de la quantification en unité MESF ou au contrôle journalier des performances des instruments. On ne peut comparer les MESF de fluorochromes différents.

Ainsi, lorsqu’une population cellulaire a une moyenne de 100.000 MESF, cela ne veut pas dire qu’elle porte exactement 100.000 molécules de ce fluorochrome, mais qu’elle a une fluorescence au moins équivalente à 100.000 molécules de fluorochrome en solution.

Un logiciel informatique permet d’isoler la population bactérienne souhaitée en éliminant les

bruits de fond (background) comme les petites particules ou cristaux éventuels présents dans

le tampon ou dans le liquide de gaine. La zone correspondant aux bactéries est alors

déterminée selon les critères de FSC (taille) et de SSC (granularité) et la fluorescence

correspondant à cette population est analysée.

Chapitre III : Matériel et méthodes.

Pour chaque échantillon étudié, un total de 3000 à 10.000 bactéries est ainsi analysé et stocké en quelques secondes. Toutes les mesures sont effectuées en triplicats ou si besoin, en quadruplats.

Préparation des échantillons avec les différents marqueurs.

Six paramètres physiologiques ont été mesurés en cytométrie de flux : la taille, la granulométrie, la perméabilité membranaire, le potentiel membranaire, l’activité réductase et le taux d’oxygène radicalaire.

Le tableau suivant (Table III.1) répertorie les marqueurs fluorescents utilisés pour nos études physiologiques.

Table III.1 : Liste des marqueurs fluorescents.

Marqueurs fluorescents

λ d'excitation

(nm) λ d'émission

(nm) Mesures physiologiques

Iodure de propidium 535 620 Perméabilité

membranaire

DiOC2(3)* 488 520-530 Potentiel membranaire

RedoxSensor Green* 490 520 Activité réductase

Hydroéthidine 488 590 Production d'oxygène

radicalaire DiOC₂(3)* : 3,3’-diethyloxacarbocyanine iodide

RedoxSensor Green* : formule non dévoilée

Le potentiel membranaire, généré par l'hydrolyse de l'ATP et les transferts électroniques à la surface membranaire, est mesuré par un marqueur cationique, le DiOC

(3). Ce marqueur lipophile s'accumule à l'intérieur des bactéries dont le potentiel de membrane est négatif à l'intérieur et positif à l'extérieur.

Tous les marqueurs fluorescents proviennent de la firme Molecular Probes sauf l’iodure de propidium qui provient de la firme Sigma.

Voici les différents protocoles établis pour les huit tests physiologiques, avec pour chacun, trois réplicats des 9 concentrations en Cu

(0, 0,15, 0,3, 0,45, 0,6, 0,75, 0,9, 1,05 et1,2 mM) : Taille et granulométrie :

1. Prélever des cellules dans le tapis bactérien au moyen d’une anse stérile et les resuspendre dans 500 µ L de tampon RD (Sigma).

2. Transférer 100 µ L de cette suspension dans 300 µ L de tampon RD, répéter trois fois (échantillons A, B et C).

3. Mesurer le canal moyen du FSC (taille) et SSC (granularité) de 10.000 bactéries.

Perméabilité membranaire :

1. Prélever des cellules dans le tapis bactérien au moyen d’une anse stérile et les resuspendre dans 500 µ L de tampon RD.

2. Transférer 100 µ L de cette suspension dans 400 µ L d’iodure de propidium (IP) avec une concentration finale en IP de 40µg/mL, répéter trois fois (échantillons A, B et C).

3. Attendre 30 minutes.

4. Mesurer le canal moyen de la fluorescence de l'IP de 10.000 bactéries.

Chapitre III : Matériel et méthodes.

Potentiel membranaire :

1. Prélever des cellules dans le tapis bactérien au moyen d’une anse stérile et les resuspendre dans 500 µ L de tampon RD.

2. Ajouter à cette suspension 100 µl de la solution stock préparée avec 7 mL de tampon RD + 420 µ L du composé DIOC

(3) 3mM stabilisé dans une solution de dimethylsulfoxide (DMSO), répéter trois fois (échantillons A, B et C).

3. Attendre 15 minutes.

4. Mesurer le canal moyen de la fluorescence (rouge et verte) du DIOC

(3) de 10.000 bactéries. Le rapport des deux fluorescences est alors calculé.

Activité réductase :

1. Prélever des cellules dans le tapis bactérien au moyen d’une anse stérile et les resuspendre dans 1 mL de tampon RD.

2. Ajouter à cette suspension 500 µ L de la solution stock préparée avec 35 mL de tampon RD + 70 µL du composé RedoxSensor Green 1mM stabilisé dans une solution de DMSO, répéter trois fois (échantillons A, B et C).

3. Attendre 15 minutes.

4. Mesurer le canal moyen de la fluorescence du RedoxSensor Green de 10.000 bactéries.

Production d'oxygène radicalaire :

1. Prélever des cellules dans le tapis bactérien au moyen d’une anse stérile et les suspendre dans 200 µ L de tampon RD.

2. Ajouter à cette suspension 800µ L d’hydroéthidine, répéter trois fois (échantillons A, B et C).

3. Attendre 30 minutes.

4. Mesurer le canal moyen de la fluorescence de l'hydroéthidine de 10.000 bactéries.

Mesures sur culture adaptée au cuivre.

Le protocole est le suivant :

1. Préparer une pré-culture sur milieu 284 gluconate des différentes souches de C.

metallidurans et incuber pendant 24 heures à 30°C et 200 rpm.

2. Au moyen d’une anse de platine, prélever une goutte de la culture bactérienne et déposer trois fois l’anse sur boîte 284 gluconate contenant différentes concentrations en cuivre, puis étaler le reste de cellules sous forme de stries épuisantes.

3. Les boîtes sont incubées à 30°C pendant 5 jours.

Mesures sur une culture soumise à un choc de Cu.

Le protocole est le suivant :

1. Préparer une pré-culture sur milieu 284 gluconate des différentes souches de C.

metallidurans et incuber à 30°C et 200 rpm pour atteindre une D.O. comprise entre 0.9 et 1 (fin de phase exponentielle).

2. Ajouter à cette culture, du cuivre à une concentration finale de 0.3, 0.6 et 1.2 mM.

3. Incuber à 30°C et 200 rpm pendant 4 heures.

4. Faire les mesures physiologiques aux temps t =1h et t =4h.

Chapitre III : Matériel et méthodes.

Les mesures physiologiques se font de la même manière qu’en phase solide, mais cette fois-ci en utilisant un volume cellulaire de 100 µ L et une solution contenant le fluorochrome de 400 µ L.

Analyse statistique.

Les tests statistiques réalisés sur les mesures des différentes concentrations en cuivre sont comparés avec les mesures obtenues à 0 mM. Le test de Student a été choisi afin d'évaluer les différences statistiques significatives. Celle-ci sont exprimées de la manière suivante, une étoile (*) correspond à un p value < à 0.05 et deux étoiles (**) correspond à p value < à 0.001.

III.3.4. Expression de la protéine CopK dans les banques de mutants.

L’expression de la protéine CopK dans les mutants a été réalisées dans la cadre d’un mémoire (Rosier Caroline, 2007, Université de Mons-Hainaut).

III.4. Surexpression, purification et analyse fonctionnelle de deux protéines Cop.

III.4.1. Surexpression et purification de CopK.

Le protocole complet est fourni dans les articles en annexe 3 (Tricot et al., 2005, Bersh et al., soumis).

III.4.2. Surexpression et purification de CopI.

Une pré-culture ON (over-night) de 10 ml permet d’inoculer une fiole de 1 l contenant 250 ml de milieu 853 + Amp (25 µg/ml) + Chl (30 µg/ml). La fiole est alors mise en culture à 200 rpm et 37°C. Quand la DO est comprise entre 0.5 et 0.8 UA, l’expression du gène copI est induite par l’addition d’IPTG à une concentration finale de 1 mM. La fiole est alors mise en culture à 20°C durant 16 heures.

Premier protocole de purification de CopI.

Les cultures de 250 ml sont centrifugées à 6000 rpm et 4°C pendant 20 minutes. Les culots sont resuspendus dans 5 ml de tampon de sonication Tris HCl 100 mM, pH 8 contenant un cocktail d’anti-protéases (Complete EDTA-free, BOEHRINGER). Les parois cellulaires sont alors détruites au moyen du sonicateur Vibra Cell 75041 (BIOBLOCK SEVANTIFE).

L’extrait est refroidi à 4°C durant la sonication réalisée en continu durant 3 minutes. L’extrait

est centrifugé à 10.000 rpm à 4°C pendant 20 minutes pour éliminer les débris cellulaires. Le

surnageant contenant les protéines solubles est récupéré et est déposé sur plusieurs colonnes

afin de réaliser la purification de la protéine CopI. Les colonnes utilisées ont un diamètre de

10 mm pour 300mm de longueur. La résine d’accrochage de la protéine est une sepharose

chélatante (SUPRADEX) qui peut être conditionnée au Cu(II) ou au Ni(II). La colonne

utilisée pour le tamisage moléculaire a les mêmes dimensions que la précédente, le garnissage

utilisé est une résine Supradex G75. L’appareillage utilisé pour réaliser les chromatographies

est un système automatique AKTA qui permet le suivi en ligne de la DO à 280 nm. Les

chromatogrammes sont obtenus au moyen du logiciel Unicorn (PHARMACIA). Les gels

d’électrophorèse des protéines séparées par chromatographie sont réalisés au moyen du

système Nu-Page (INVITROGEN) dont le tampon de préparation des échantillons contient du

SDS (gel d’acrylamide en gradient 4-12% Bis-Tris Nu- Page®, InvitrogenTM). Les protéines

Chapitre III : Matériel et méthodes.

déposées sur gel sont donc dénaturées et dans des conditions non-réductrices. Le tampon de migration utilisé est le tampon Nu-Page MES. Le marqueur utilisé sur gel est le SeeBlue Plus2 Pre-Stained Protein Standard (INVITROGEN), les profils de migration fournis par INVITROGEN permettent de déterminer les poids moléculaires de la protéine d’intérêt.

Figure III.4 : Protéines et poids moléculaire apparent du marqueur dans le tampon de migration MES (poids moléculaire relatif à la distance de migration dans le gel).

Second protocole de purification de CopI.

Les cultures de 1 l sont centrifugées à 5000 rpm et 4°C pendant 30 minutes. Les culots sont

mis en suspension dans 100 ml de tampon (sucrose 20%, tris 30mM pH 8, 200µl d’EDTA

0,5M) qui permet la perméabilisation de la membrane externe, tout en maintenant l’intégrité

du cytoplasme (Thompson et al., 1973). Le culot est remis en suspension dans un tampon et

refroidit 10 minutes sur de la glace. Les culots sont centrifugés à 10000 rpm durant 10

minutes à 4°C. Ce culot est remis en suspension dans du MgSO

5 mM glacé (0°C) et

maintenu sur la de la glace durant 10 minutes. Les culots sont centrifugés à 10000 rpm durant

20 minutes à 4°C. La solution obtenue est traitée par chromatographie échangeuse d’ions en

tampon Tris-HCl 20mM pH8 sur une colonne ResourceS avec élution par un gradient de

NaCl 0 mM-150mM. L’appareillage utilisé pour la chromatographie des protéines est un

système ÄKTA (General Electric Healthcare) avec le logiciel UNICORN pour l’acquisition

des chromatogrammes. La protéine récoltée dans les fractions autour de 50 mM en NaCl est

récoltée quasiment pure, et a servi aux analyses fonctionnelles. La protéine purifié est oservée

par gel d’électrophorèse en conditions dénaturantes, comme décrit au point précédent (pt

III.4.2.1).

Chapitre III : Matériel et méthodes.

III.4.3. Analyse fonctionnelle des protéines.

Analyses bioinformatiques au départ de la séquence primaire.

L’analyse de la séquence primaire est réalisée au moyen de logiciels disponibles gratuitement sur internet. Les alignements BLAST, et la recherche de domaines sont réalisés via le programme de recherche et comparaison ProtParam tool, disponible sur le site : www.expasy.org/tools/protparam.html. La base de donnée utilisée est l’UnitProtb knowledgebase disponible sur le site : www.expasy.org/sprot/. La recherche des domaines

transmembranaires est réalise au moyen du logiciel DAS

(http://www.sbc.su.se/~miklos/DAS/). La recherche de la localisation des protéines Cop est réalisée au moyen des logiciels pSORT et pSORT-b (http://www.psort.org/). Les comparaisons de séquence sont réalisées au moyen du logiciel « NCBI blast » (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi) et du logiciel MAGE (https://www.genoscope.cns.fr/agc/mage/wwwpkgdb/Login/log.php?pid=33) pour les synténies de gènes cop (soit la comparaison de loci similaires au groupe de gène cop de pMOL30). La modélisation de la protéine CopI est réalisée au moyen des logiciels « pdb View » et « PyMol », cette modélisation a été réalisée par Cédric Beauvois (IRMW).

Afin de choisir une stratégie de purification, les propriétés physico-chimiques des protéines Cop ont été observées (table III.2).

Caractéristiques physico-chimiques des protéines Cop.

Les paramètres physico-chimiques (table IV.1) permettent de prédire la stabilité des protéines

in vitro (au travers de l’index d’instabilité), et aussi d’envisager le protocole de purification le

plus adapté. Il est communément admis qu’une protéine de petite taille est plus aisée à

cristalliser qu’une protéine plus lourde, bien que cela reste une règle empirique. La majorité

des protéines de E. coli ont un point isoélectrique proche de 7, si bien qu’en utilisant une

combinaison adaptée du pH du tampon et de la résine ionique, il est possible de fixer une

protéine fortement basique ou fortement acide en éluant la majorité des protéines de la souche

d’expression. L’index aliphatique reflète l’hydrophobicité d’une protéine.

Chapitre III : Matériel et méthodes.

Table III.2 : Propriétés physico-chimiques des protéines Cop.

nombre Poids Point Résidus Résidus Index Index

d'acide moléculaire isoélectrique négatifs positifs d'instabilité aliphati-

Protéine aminés (Da) théorique (Asp + Glu) (Arg + Lys) que

CopV 117 12204,04 4,34 17 8 12,13 86,81

CopT 254 27137.6 5.53 27 22 33,5 83,58

CopM 136 14436,4 8,58 13 15 46,09 73,24

CopK 94 10268,9 9,26 12 15 29,85 69,47

CopN 164 17869,5 9,39 15 17 41,42 101,77

CopS 463 51539,1 6,29 58 53 36,19 96,11

CopR 228 25526,4 5,5 34 30 42,88 116,71

CopA 614 67744 6,5 66 61 27,68 72,25

CopB 495 53534,8 5,8 53 42 27,43 44,26

CopC 132 14040,2 9,11 10 12 23,62 83,64

CopD 305 32248,2 9,46 13 18 28,25 126,13

CopI 158 16686,4 9,61 14 19 24,1 79,11

CopJ 174 19244,8 8,97 19 22 48,69 79,2

CopG 137 14134,2 8,73 8 11 36,09 79,78

CopF 805 85089,5 5,76 83 69 40,46 94,24

CopO 62 6965,9 8,24 5 6 48,96 86,89

CopL 421 46453 6,81 47 46 26,49 95,56

CopQ 78 7864,6 6,22 8 7 15,66 57,56

CopH 153 15851,8 5,02 13 9 35,32 87,45

CopE 211 23741,2 8,34 24 26 69,2 87,11

CopW 69 7330,2 6,71 9 9 20,17 80,87

Légende : les données physico-chimiques sont calculées par le logiciel ProtParam.

Le nombre d’acides aminés et le poids moléculaire des protéines Cop varie de 62 à 805 résidus et de 6,9 à 85 kDa.

Le point isoélectrique fluctue de 4,34 à 9,61.

Un index d’instabilité inférieur à 40 correspond à une protéine stable in vitro, tandis qu’un index supérieur à 40 correspond à une protéine qui peut être instable (Gasteiger et al., 2005).

Les protéines CopM, CopN, CopR, CopJ, CopF, CopO et CopE sont prédites potentiellement instables, autrement dit ces protéines se dégraderaient rapidement dans un extrait cellulaire.

L’index aliphatique se base sur un algorithme dépendant du taux d’Ala, Leu, Ile et Val (Kyte et Doolittle, 1982) dans la séquence primaire. Les protéines CopD, CopN, CopR, sont particulièrement hydrophobes, tandis que CopB a un index aliphatique très bas. Ceci tient essentiellement à son motif répété riche en Met/His qui abaisse l’index aliphatique (voir table IV.3) de la protéine, cet index étant de 77,07 si l’on n’introduit pas ce motif dans le calcul de l’index aliphatique. A titre de comparaison, l’index aliphatique de CopB codée par le mégaplasmide est de 67,42. Ces motifs constituent par conséquent un domaine très soluble de la protéine.

Spectrométrie de masse (réalisée par R. Wattiez,UMH et G. Vandenbussche, ULB).

Pour CopI, les échantillons ont été chargés dans un capillaire de borosilicate recouvert d’une

fine couche d’or-palladium (Proxeon) permettant de délivrer l’échantillon avec un flux de 10-

40 nl/min. Les spectres de masse ont été enregistrés en mode positif au moyen d’un

spectromètre de masse Q-Tof Ultima (Waters/Micromass), équipé d’une source de

nanoélectrospray Z-spray. Des voltages de 1.1-1.5 kV et de 50 V ont été utilisés

Chapitre III : Matériel et méthodes.

respectivement pour le capillaire et le cône d’entrée. La source a été maintenue à une température de 100 °C. L’acquisition des données a été réalisée en utilisant le système MassLynx 4.0. La masse moléculaire de la protéine a été déterminée après déconvolution des spectres m/z par le programme MaxEnt1 (Waters/Micromass).

Pour CopK, les protocoles sont fournis en annexe 3 (Bersh et al., soumis).

Techniques d’électrophorèse.

Environ 10 µg de protéine CopI est mise en présence de différentes concentrations en Cu(II), ou Cu(II) + ascorbate (formation de Cu(I)) ou Cu(II) + EDTA (agent complexant du Cu(II) ou Cu(II) + β-mercaptoéthanol, le volume final total étant toujours de 10µl. Après 10 minutes de contact à température ambiante, CopI est dénaturé par ajout de 10 µl d’un tampon de dénaturation concentré 2 fois (Tris base 242 mM, SDS 4%, glycérol 20%, pH 8,5)) et bouilli durant 10 minutes dans un bain chauffé par bunsen. Les gels sont ensuite réalisés comme décrit plus haut.

Mesures spectrales.

Les spectres d’absorption ont été réalisés sur un spectrophotomètre UV-VIS Unicam 8700 Series et son logciel PU8700 Series UV/VIS Spectrophotometer v.1.20. Un balayage de 280nm jusque 750nm est réalisé à une vitesse de 128nm/min. La cellule utilisée possède une longueur optique de 1cm et une contenance de 150 µl (Hellma, type n° 105.202-05).

III.5. Analyse de sols katangais riches en cuivre.

III.5.1. Echantillonnage des sols.

Ces échantillonnages ont été réalisés par le professeur Nathalie Verbruggen en février 2005 et Alfred Cubaka en mai 2005, du Laboratoire de Génie Génétique des Plantes de l’ULB). Les échantillonnages ont été réalisés sur des sols katangais connus pour être soit des sites naturels riches en cuivre encore non exploités, soit des sites miniers en activité, soit des sites miniers qui ne sont plus exploités depuis plusieurs années. Pour chaque site, les échantillons de terre ont été prélevés dans l’environnement racinaire de plantes présentes soit dans le dembo d’empoisonnement, soit dans des déblais d’extractions. L’essentiel des échantillons de terre ont été prélevés dans l’environnement des racines d’une plante. Etant donné que les plantes cuprophytes sélectionnées sont toutes de petites tailles, l’échantillon de terre peut être considéré comme provenant de la zone A du sol, soit la zone située dans les cinq premiers centimètre en dessous de la surface qui est considérée comme aérobe. Les 21 premiers échantillons rapportés par le Pr Verbruggen ont surtout permis de mettre au point l’ensemble des protocoles d’extraction et d’isolation des bactéries des sols pollués au cuivre, compte tenu du fait que ceux trouvés dans la littérature ne nous semblaient pas bien adaptés à la recherche de bactéries cupro résistantes en particulier.

Les 76 échantillons suivants, rapporté par Alfred Cubaka (Lic. Biologie en Sciences végétales, DEA ULB) ont servis dans le cadre de cette étude à isoler une soixantaine de souches métallorésistantes choisies pour leur résistance au Cu(II) plus élevée que celle de C.

metallidurans CH34. L’ADN total de ces échantillons a été extrait, de même que les

concentrations en métaux lourds biodisponibles ont été déterminées.

Chapitre III : Matériel et méthodes.

III.5.2. Analyses minérales.

Les analyses minérales ont été réalisées par le Dr Gilles Collinet du Laboratoire de Pédologie des Facultés Universitaires Agronomiques de Gembloux (FUSAGx).

III.5.3. Analyses par biologie moléculaire.

Extraction de l’ADN total d’un sol.

L’ADN total des sols a été extrait au moyen du kit Total DNA soil extraction (MoBio).

Toutefois, le protocole a été adapté et au lieu de 250 mg de terre, ce sont 500 mg qui servent à l’extraction. De plus, l’ADN fixé sur une résine est décroché par un volume d’élution réduit de moitié par rapport aux recommandations du fournisseur. Ceci afin d’avoir des concentrations plus élevée en ADN total extrait, compte tenu de faibles rendements quand le protocole d’extraction est appliqué suivant les recommandations du fabriquant.

Amplification des gènes copA, copK et czcC.

Le choix des amorces a fait l’objet d’une réflexion. Concernant les amorces des gènes copK, celles-ci ont été choisies en considérant le fait que copK n’a pas d’homologue dans les bases de donnée, l’amorce du brin direct commence donc au codon ATG initial de la traduction et l’amorce du brin inverse se termine par le codon STOP de terminaison de la traduction. Les amorces du gène czcC ont été choisi sur base de la littérature (Dell’Amico et al., 2006). Les amorces copA ont été choisies spécialement dans la région la mieux conservée du gène copA d’une espèce bactérienne à l’autre. Ceci afin de ne pas se concentrer en particulier sur le gène copA de C. metallidurans CH34, puisque des amplifications de ce type n’avaient pas donné de réponse (Dell’Amico et al., 2006).

Les amorces utilisées sont les suivantes :

• czcC fw : ACATACCTTGGTGCAATTCGA

• czcC rv : ATGTTTTATGAATCCCGTCTTACC

• copK fw : AAACAAAAACTGATGGTCGGA

• copK rv : TCAGCCCCCTTCGCTGTGGCC

• copA fw : ATCCATGGCACGGCATCATCATCCTGCCG

• copA rv : AGGTGCATCGGGTGAGTCATCATCGTCGTTG

L’amplification est réalisée au moyen du kit Taq polymerase de Promega. Les conditions de la PCR (Polymerase Chain Reaction) sont les suivantes :

• Température d’hybridation : 50°C durant 30 secondes

• Température d’élongation : 72°C durant 3 minutes

• Température de séparation des brins : 95°C durant 30 secondes

• Nombre de cycle : 35

Chapitre III : Matériel et méthodes.

III.5.4. Analyses microbiologiques.

Sélection des bactéries cupro résistantes au Cu(II).

Pour tous les échantillons, environs 1g de terre racinaire a été prélevé pour chaque échantillon de la façon la plus stérile possible, soit en utilisant des gants désinfectés à l’alcool dénaturé et séchés, une spatule stérilisée par flambage et une boite de Pétri stérile qui fait office de réceptacle. Ensuite, les bactéries ont été mises en suspension dans du sulfate de magnésium à 10 mM suivant un procédé préalablement mis au point (Lodewyckx, 1997).

Pour la première série d’échantillons, les dilutions sont étalées sur le milieu 869 :10 ainsi que 284 Cmix (Lodewyckx, 1997), ces milieux contenant 1 ou 2 mM de Cu(II) ou pas de Cu(II) ajouté. Cette première série a montré également l’utilité d’ajouter de l’actidione à 100 µ g/ml au milieu afin de limiter la propagation des eucaryotes. La seconde série d’échantillons dilués a été déposée sur 869 :10 ou 284 Cmix contenant 1.5 mM en Cu(II).

Sélection et caractérisation des souches.

Toutes les souches ont été choisies sur milieu 869 :10 ou 284 + Cmix contenant 1.5 mM en Cu(II). Au départ, 600 souches ont été choisies sur base de leurs caractéristiques macroscopiques (forme, taille et couleur de la colonie). Celles-ci ont été repiquées sur le même milieu minimum contenant toutefois un des ions métalliques suivant, soit Co(II) (1mM), Cd(II) (0,8mM), Zn(II) (2mM), Hg(II) (0,1mM), Ni(II) (1mM), AsO

(5mM);

Cu(II) (à 1mM, 1,5mM, 3mM et 5mM). 60 souches parmi les plus résistantes au Cu(II) et

présentant des multi-résistances aux métaux lourds ont été sélectionnées. La caractérisation

des souches s’est alors faite par microscopique couplée à une coloration de Gram. Pour les

souches où observation macroscopique et microscopique, et où un groupe a été considéré, car

les observations conduisaient aux mêmes résultats, une manipulation complémentaire

d’identification par VITEKII a été réalisée pour plusieurs souches de chaque groupe.

Chapitre III : Matériel et méthodes.

III.6. Complément d’informations sur les méthodes utilisées.

III.6.1. La cytométrie de flux appliquée aux bactéries.

La cytométrie de flux qui permet de visualiser des modifications physiologiques cellulaires in vivo.

Figure III.5 : Représentation schématique d’un cytomètre de flux.

Le spectromètre de flux visualise une à une les cellules qui passent devant un laser dont la lumière est observée dans son axe radial (ce qui montre la taille de la cellule) et dans son axe radial (car la déviation de la lumière dépend de la forme cellulaire). Des photomultiplicateurs peuvent également mesurer des fluorescences à des longueurs d’ondes données.

Divers paramètres physiologiques peuvent donc être observés par la fluorescence de molécules qui vont soit se fixer autour de la cellule, soit entrer dans la cellule. A titre d’exemple, l’iodure de propidium fluoresce dans le rouge s’il est fixé sur l’ADN mais il ne peut traverser une cellule dont l’intégrité membranaire est parfaite. Au plus une cellule en contact avec de l’iodure de propidium fluoresce, au plus son intégrité membranaire est affectée.

La cytométrie de flux permet également l’analyse de milliers de cellules en quelques

secondes.

Chapitre III : Matériel et méthodes.

III.6.2. Spectrométrie de masse des protéines.

La spectrométrie de masse est une méthode analytique qui mesure le ratio de la masse sur la charge d’un ion. Tout spectromètre de masse comporte trois corps principaux : une source d’ionisation, un analyseur de masse et un système de détection.

En spectrométrie de masse des protéines, deux sources d’ionisation sont utilisées : l’ESI (« electron spray ionisation ») et le MALDI (« matrix-assisted laser desorption/ionization »).

L’ESI consiste en la nébulisation d’une solution au travers d’un capillaire microscopique d’un aérosol qui contient les macromolécules à analyser. Ces gouttelettes sont soumises à la sortie du capillaire à un puissant champ électromagnétique qui permet l’ionisation des macromolécules. Après évaporation du solvant, les ions sont amenés en phase gazeuse et peuvent entrer de façon individuelle dans l’analyseur de masse.

Le MALDI consiste en la déshydratation préalable des macromolécules en présence d’un agent permettant la formation d’une matrice. Cette dernière permet de protéger les macromolécules du laser qui va favoriser la vaporisation des macromolécules tout en les ionisant. Le système en dépressurisation entraîne les ions vers l’analyseur de masse.

L’analyseur utilisé en spectrométrie de masse des protéines est un TOF (« time-of-flight ») : il consiste en un champ électrique qui accélère les ions au travers d’un même potentiel, et qui mesure le temps nécessaire pour atteindre le détecteur. Si les particules ont la même charge, les énergies cinétiques seront les mêmes et la vitesse ne dépendra que de la masse. Ainsi, les ions les plus légers sont les premiers à atteindre le détecteur. Ce temps de vol peut être allongé par l’ajout de réflectrons qui vont répulser les ions pour les diriger vers le détecteur.

Le détecteur transforme les ions qui frappent une surface en signal électrique. Plus ces ions sont nombreux, plus le courant est important. Les signaux pouvant être faible en spectrométrie de masse des protéines, le détecteur est souvent couplé à un amplificateur.

Figure III.5 : Modes d’ionisation en spectrométrie de masse.

Ionisation ESI, capillaire et source d’ionisation.

Ionisation MALDI, détail d’une surface d’ionisation.

Concrètement, la spectrométrie de masse permet de séquencer une protéine (généralement

après protéolyse), de mettre en évidence sa liaison avec un substrat, et d’étudier le protéome

d’un organisme dans son ensemble après séparation des protéines par électrophorèse

bidimensionnelle ou des peptides générés par protéolyse par chromatographie liquide couplée

au spectromètre de masse.