POUR L’OBTENTION DU DIPLOME DE LICENCE PROFESSIONNELLE REPUBLIQUE DU BENIN
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MINISTERE DE L’ENSEIGNEMENT SUPERIEUR ET DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE
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UNIVERSITE D’ABOMEY-CALAVI (UAC)
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ECOLE POLYTECHNIQUE D’ABOMEY-CALAVI (EPAC)
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DEPARTEMENT DE GENIE DE BIOLOGIE HUMAINE (GBH)
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Option : Analyses Biomédicales (ABM)
THEME
Réalisé par :
KOUNOUDJI Giscarde Spinosa
Sous la direction
Tuteur Superviseur
Mr SOSSA Dagnon Dr Adjimon Gatien LOKOSSOU Biotechnologiste médical Immunologiste
Enseignant- chercheur à l’EPAC
Année académique2016-2017 10eme Promotion
Incorporation de la syncytine 2 dans les exosomes des femmes
enceintes normales entre 1 et 20 Semaines d’Aménorrhée
REPUBLIQUE DU BENIN
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MINISTERE DE L’ENSEIGNEMENT SUPERIEUR ET DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE
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UNIVERSITE D’ABOMEY CALAVI (UAC)
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ECOLE POLYTECHNIQUE D’ABOMEY-CALAVI (EPAC)
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DEPARTEMENT DE GENIE DE BIOLOGIE HUMAINE (GBH)
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Directeur:
Pr Mohamed SOUMANOU Directeur Adjoint:
Pr Clément AHOUANOU
Chef de département:
Dr Pascal ATCHADE
LISTE DES ENSEIGNANTS
NOMS et Prénoms Matières enseignées 01 ABLEY Sylvestre Déontologie Médicale
02 ADOMOU Alain Physique
03 AGBANGLA Clément Génétique Moléculaire
04 AGOUA Jean Informatique
05 AHOYO Théodora Angèle Microbiologie/Santé publique et Hygiène Hospitalière 06 AKAKPO B. Huguette Education Physique et Sportive
07 AKOGBETO Martin Entomologie Médicale
08 AKPOVI Casimir Biologie cellulaire/Physiologie Humaine/Biochimie Métabolique
09 ALITONOU Alain Guy Chimie Générale/Chimie Organique
10 ANAGO Eugénie Biochimie Structurale/Biochimie Clinique/Biologie Moléculaire
11 ANAGONOU Sylvère Education Physique et Sportive 12 ATCHADE Pascal Parasitologie/Mycologie
13 AVLESSI Félicien Chimie Générale/Chimie Organique 14 BANKOLE Honoré Bactériologie/Virologie
15 DARBOUX Raphaël Histologie Appliquée
16 DESSOUASSI Noel Biophysique
17 DOSSEVI Lordson Techniques Instrumentales
18 DOSSOU Cyriaque Techniques d’Expression et Méthodes de Communication 19 DOUGNON T. Victorin Microbiologie/Méthodologie
20 HOUNNON Hyppolite Mathématiques
21 HOUNSSOSSOU Hubert Biostatistique et Epidémiologie 22 LALLY Armel Législation et Droit du travail
23 LOKO Frédéric Biochimie clinique
24 LOKOSSOU Gatien Immunologie/Immunologie-Pathologie
25 LOZES Evelyne Immunologie/Immunologie-Pathologie/Equipements Biomédicaux
ii
26 MASSOULOKONON
Vincent
Histologie Générale
27 OGOUDIKPE Nicarette Informatique Médicale 28 SECLONDE Hospice Transfusion Sanguine
29 SEGBO Julien Biochimie/Biologie Moléculaire
30 SENOU Maximin Histologie Appliquée
31 TOPANOU Adolphe Hématologie/Hémostase et Pharmacologie
32 SOEDE Casimir Anglais
33 YOVO K. S. Paulin Pharmacologie
34 TOHOYESSOU Zoé Soins Infirmiers
DEDICACE
Je dédie ce travail :
A mon père Hospice KOUNOUDJI et à ma mère Rose AKPLOGAN pour toute leur affection et leur rigueur à mon égard. Qu’ils trouvent en ce travail, la récompense des inestimables sacrifices qu’ils ont consentis pour ma réussite sur tous les plans. Que Dieu tout puissant, qui m’a donné la force et le courage d’aller au bout de ce travail, vous bénisse et vous accorde une longue vie.
iv REMERCIEMENTS
Ce rapport est le résultat de l’action conjuguée de plusieurs personnes à qui nous tenons à exprimer notre profonde gratitude.
Nos sincères remerciements sont ainsi adressés :
A l’Eternel DIEU tout puissant qui n’a jamais cessé de me combler de ses grâces.
A toute la famille KOUNOUDJI
A la grande famille DONGBETO et plus particulièrement à Hermane DONGBETO pour leur affections et encouragement tout au long du parcourt universitaire.
Au Docteur Adjimon Gatien LOKOSSOU, notre superviseur de mémoire, nous avons eu le privilège de travailler dans votre équipe et d’apprécier vos qualités et vos valeurs. Votre sérieux, votre compétence, votre rigueur et votre sens du devoir nous ont énormément marqués. Veuillez trouver ici l’expression de notre respectueuse considération et notre profonde admiration pour vos qualités scientifiques.
Aux enseignants du Département de Génie de Biologie Humaine (GBH), tous nos remerciements pour la qualité et la réussite de notre formation.
Au Directeur du Centre de Santé Départemental du MONO-COUFFO, pour nous avoir accueillie dans votre hôpital, profonde gratitude.
Au responsable du laboratoire, Monsieur Dagnon SOSSA, vous avez accepté de co-diriger ce travail malgré vos multiples occupations. Merci pour la mise à disposition de votre laboratoire et pour la contribution effective à la réalisation de ce travail.
A notre tutrice de stage, tata BADAROU Amirath, tous nos remerciements à vous pour votre disponibilité malgré vos nombreuses occupations et pour votre contribution à la réussite du travail.
A tout le personnel du laboratoire du CHD-Mono : mesdames Leaticia DOSSOU-KAGO, Pauline EDAH, Ahoueffa ANATO, Bernice DONOU et Rosemonde SEBIO, messieurs Félicien DJINAHIN et Bernard ALODOHOUNDE, pour l’accueil et la bonne collaboration ; profonde gratitude.
A mes très chers frères pour leur assistance et leur grand sens du devoir.
A tous mes neveux et mes cousins qui sont chers à mon cœur.
A mes amis de la 10ème promotion pour les bons moments que nous avons partagés.
A tous nos amis qui, de près ou de loin, ont participé à l’exécution de ce modeste travail par leur soutien et leur présence à nos côtés durant les moments d’angoisses et de joies.
vi HOMMAGES
A son Excellence le Président du Jury
Vous nous faites l’honneur d’accepter, avec une très grande aimabilité, de présider notre jury. Vos conseils et recommandations vont améliorer le travail.
Aux Honorables Membres du Jury
Vous nous avez honorées en acceptant avec grande sympathie de siéger dans le jury de notre soutenance, Hommages respectueux.
LISTE DES SIGLES ET ABREVIATIONS C : Concentration
cAMP : Adénosine Monophosphate cyclique CETV : Cytotrophoblaste Extra Villeux CTV : Cytotrophoblaste Villeux
DO : Densité Optique
ELISA : Enzyme Linked ImmunoSorbant Essay ERV : Rétrovirus Endogène
g : gramme
HIV : human imunodefience viruses HERV : Human Endogenous Retrovirus L : litre
MFSD2 : Major Facilitator Suppressive Domain contain 2 nm : nanomètre
pH : potentiel d’Hydrogène UI : Unité Internationale
°C : Degré Celsius µL : microLitre mmol : milli mole mg : milligramme µmol : micromole mL : milliLitre PE : Pré-éclampsie
SA : Semaines d’Aménorrhée WG : Weeks of Gestation
viii LISTE DES TABLEAUX
Tableau 1 : Moyenne d’âge des femmes enceintes de la cohorte. ... 18 Tableau 2 : Description des femmes enceintes par groupe d’âge. ... 18 Tableau 3 : Incorporation de la syncytine-2 dans les exosomes entre 0 et 9,5 SA. ... 20
LISTE DES FIGURES
Figure 1 : Structure schématique des syncytines 1 et 2 avec leurs domaines fonctionnels (A G. Lokossou et al. 2014). ... 4 Figure 2: Biogenèse des exosomes –présentation schématique de la voie endocytaire des exosomes produits et sécrétés. (Lucia Mincheva-Nilsson and Vladimir Baranov, 2010) ... 7 Figure 3 : Structure schématique de l’exosome et ses protéines (A G LOKOSSOU et al, 2014) ... 8 Figure 4 : Variation du niveau d’incorporation de la syncytine-2 dans les exosomes du sang périphérique de femmes enceintes durant les vingt premières semaines. ... 19
RESUME
Le placenta est un organe indispensable pour le maintien de la grossesse et la croissance fœtale. De récentes études ont démontré une sécrétion microvésiculaire active au niveau du placenta. Parmi ces microvésicules, on distingue les exosomes. L’incorporation de la syncytine-2 à la surface de ces exosomes a été clairement démontrée. En effet la syncytine-2 joue un rôle prépondérant dans la formation du placenta grâce à sa capacité de fusion.
L’objectif général de notre étude de recherche est d’évaluer l’incorporation de la Syncytine-2 dans les exosomes de femmes enceintes normales entre une et 20 semaines de gestation. Pour ce faire, les échantillons sériques de 22 femmes enceintes ont été prélevé du début de la grossesse jusqu’à 20 SA. Après avoir analysé le contenu des exosomes du sang périphérique de ces femmes enceintes, nous avons constaté une incorporation croissante de la syncytine-2 entre 9,6-13 SA et entre 16-20 SA. Par ailleurs, cette incorporation de la syncytine-2 a diminué entre 13,1 et 16 SA. Le rôle de la syncytine-2 dans le développement de la pré- éclampsie (PE) étant bien connu maintenant, il serait intéressant d’évaluer l’incorporation de cette protéine dans les exosomes de femmes enceintes ayant souffert de la PE au cours de leur grossesse.
Mots clés : syncytine-2, exosomes, placenta, grossesse.
x ABSTRACT
The placenta is an important organ for the maintenance of pregnancy and fetal growth. Recent studies have shown active microvesicular secretion by the placenta. Among these microvesicles, there are exosomes. The incorporation of syncytin-2 on the surface of these exosomes has been clearly demonstrated. In fact, syncytin-2 plays a major role in the formation of the placenta by it capacity to induce cytotrophoblasts fusion. The aim of our study is to evaluate the incorporation of Syncytin-2 into exosomes of normal pregnant women between one and 20 weeks of gestation (WG). For this, serum samples from 22 pregnant women were collected from the beginning of pregnancy to 20 weeks. After analyzing the content serum-derived exosomes of these pregnant women, we found an increase incorporation of syncytin-2 in serum-derived exosomes between 9.6-13 WG and between 16- 20 WG. Moreover, this incorporation of syncytin-2 decreased between 13.1 and 16 AS. The role of syncytin-2 in the development of pre-eclampsia is well known now, it would be interesting to evaluate the incorporation of this protein into the exosomes of pregnant women who have suffered PE during their pregnancy.
Key words: syncytin-2, exosomes, placenta, pregnancy.
SOMMAIRE
PARTIE 1 : SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE ... 3
PARTIE 2 : MATERIELS ET METHODES ... 9
PARTIE 3 : RESULTATS ET COMMENTAIRES ... 18
CONCLUSION ... 22
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUE ... 24
TABLE DES MATIERES ... 27 ANNEXES ... a
1
INTRODUCTION
Le placenta est un organe transitoire d’échange entre le fœtus et sa mère. Il contribue au maintien de la grossesse et assure le développement fœtal. Il est situé entre l’embryon et l’endomètre décidual maternel. C’est un organe fondamental pour la poursuite de la grossesse qui assure à la fois un rôle de barrière et d’échanges de gaz, de liquide et de nutriments entre la mère et le fœtus pour la croissance de ce dernier (Fournier T. et al. 2008). Ces caractéristiques sont propres au développement du placenta humain et de celui des primates supérieurs (Fournier T. et al. 2008). Il représente un modèle de différenciation cellulaire unique dans tout le règne animal. Après la phase initiale de la nidation, la cellule trophoblastique se différencie selon deux voies distinctes, en cytotrophoblastes villeux (CTV) et en cytotrophoblastes extra villeux (CTEV). Les CTV assurent les échanges materno-fœtaux et les fonctions endocrines du placenta tandis que les CTEV sont invasifs et sont indispensables à l’implantation et au remodelage des vaisseaux utérins (Fournier T.et al.
2008). Ces cellules trophoblastiques, expriment les Syncytine 1 et 2 qui sont des glycoprotéines d’enveloppe des rétrovirus qui ont infecté les primates supérieurs. En outre, ces protéines ont la capacité de fusionner les cellules mononuclées pour former une structure multi-nucléée (Cécile E et al, 2008). Par cette propriété, les syncytines fusionnent les cytotrophoblastes sous-jacent pour donner le syncytiotrophoblaste au cours de la placentation (A G Lokossou et al. 2014 ; Anne D. et al. 2011). Ces protéines sont codées respectivement par deux gènes : le gène HERW1 (Human Endogenous Retrovirus) de la famille HERW, situé sur le Chromosome 7 et le gène ERV-FRD1 (Endogenous Retrovirus) de la famille des rétrovirus ERV-FRD situé sur le chromosome 6 (A G Lokossou et al. 2014).
En plus de cette capacité à induire la fusion des cellules, elles sont aussi dotées d’une fonction immunosuppressive (A G Lokossou et al. 2014 ; Sugimoto et al, 2009) avec la syncytine-2 qui semble avoir une fonction immunosuppressive plus importante que la syncytine-1 (Anne D. et al. 2011). Plusieurs études ont montré que le placenta sécrète des microvésicules dont les exosomes qui semblent jouer un rôle important dans l’immunotolérance materno-fœtal. Par ailleurs, la syncytine-2 est incorporée à la surface de ces exosomes (A G Lokossou et al. 2014
; Chie-pein C. et al 2008).
Compte tenu de cette présence dans les exosomes et du rôle de la syncytine-2 au cours de la grossesse nous nous sommes intéressées à l’incorporation de la syncytine-2 dans les exosomes de femmes enceintes normales entre une et vingt Semaines d’Aménorrhée (SA).
Notre objectif principal est d’évaluer l’incorporation de la Syncytine-2 dans les exosomes de femmes enceintes normales entre une et 20 semaines de gestation.
De façon spécifique, nous avons :
- purifié et quantifié les exosomes à partir des sérums des femmes enceintes normales
- quantifié l’incorporation de la syncytine-2 dans ces exosomes.
3 PARTIE 1 : SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE
1-1 Définition Syncytine
La syncytine est une glycoprotéine d’enveloppe codée par des rétrovirus endogènes, capables d’induire la fusion cellulaire et nécessaires à la formation de l’architecture placentaire (Sandra B. et al. 2003). Elle est abondamment exprimée au niveau du placenta durant la grossesse.
C’est une protéine codée par le gène env des rétrovirus qui ont infectés les primates supérieurs (A G Lokossou et al. 2014 ; Sandra B. et al. 2003).
1-2 Différents types de syncytine 1-2-1 Syncytine-1
La syncytine-1 est une glycoprotéine d’enveloppe des rétrovirus endogènes codée par la famille HERV-W (Chie-Pein C. et al. 2008). Elle est exprimée particulièrement au niveau du placenta. Cette glycoprotéine d’enveloppe codée par le gène env des rétrovirus endogènes joue un rôle fondamental dans la formation du placenta grâce à sa capacité de fusion (A G Lokossou et al. 2014 ; Vargas A. et al. 2014). Son expression est régulée positivement par les hormones stéroïdiennes (Sandra B. et al. 2003). Cependant d’autres glycoprotéines d’enveloppe des rétrovirus ont été découvertes et sont aussi impliquées dans la fusion cellulaire. C’est le cas par exemple de la syncytine-2 qui semble jouer un rôle plus important que la syncytine-1 (A G Lokossou et al. 2014 ; Sandra B. et al. 2003).
1-2-2 Syncytine-2
La Syncytine-2, protéine fusogénique appartenant à une autre séquence d'HERV, a d'abord été décrite comme pouvant potentiellement avoir un rôle physiologique dans la placentation humaine (Sandra B. et al. 2003). Codée par le gène env de la famille HERV-FRD et située sur le chromosome 6, elle interagit avec son récepteur MFSD2 (Major Facilitator Superfamily Domain Containing 2) qui appartient à la famille des transporteurs des hydrates de carbones (Esnault et al. 2008). Cette glycoprotéine de 75 kDa est un ensemble de 538 acides aminés regroupés en sous-unités de surface (SU) et transmembranaire (TM) reliées par des liaisons de faible énergie (liaison hydrogènes). L’ensemble est ancré dans la membrane cellulaire grâce aux peptides de fusion (FP) et au peptide de signal (SP) se trouvant au niveau de l’acide aminé N-terminal (A G Lokossou et al. 2014 ; Vargas A. et al. 2014 ; Chie-Pein C. et al.
2008).
Les syncytines-1 et -2 comportent également un domaine immunosuppresseur impliqué dans les fonctions immunosuppressives de ces protéines (A G Lokossou et al. 2014) (Figure 1).
Elle est positivement stimulée par la forskolin qui est un activateur de l’adénylase cyclase, entrainant une augmentation de l’AMPc (Adénosine Monophosphate cyclique) dans la cellule (Pascal G. et al. 2016 ; Chie-Pein C. et al. 2008). Dans les conditions physiologiques, cette voie de signalisation cAMP dépendante est principalement induite par l’hCG (Hormone gonadotrophine chorionique humaine) secrétée par le placenta au cours de la grossesse (Gerbaud et al. 2015).
SP : Peptide de Surface ISD : Domaine Immunosuppressif
FP : Peptide de Fusion TMD : Domaine Transmembranaire
Figure 1 : Structure schématique des syncytines 1 et 2 avec leurs domaines fonctionnels (A G. Lokossou et al. 2014).
5 1-3 Rôles de la syncytine-2
1-3-1 Rôle immunosuppresseur
Le rôle immunosuppressif de la syncytine-2 est lié à la présence d’un domaine immunosuppressif (ISD) dans la sous-unité transmembranaire (TM) (A G Lokossou et al.
2014). Des tests réalisés in vitro et in vivo ont permis de démontrer les fonctions immunosuppressives de ce domaine composé de 17 acides aminés (Schlecht-Louf et al.). Par ailleurs, des études ont également démontré que l’infection de primates supérieurs par des rétrovirus favoriserait une activité immunosuppressive vis-à-vis du système immunitaire de l’hôte (Denner J. 2014). Cette fonction immunosuppressive a été conservée par la syncytine-2 chez l’homme. Le fœtus est une semi-allogreffe et a besoin d’être protégé au cours de la grossesse. Cette protection est assurée par l’immunosuppression mise en place à certain moment de la grossesse (Steinborn et al. 2007). Les fonctions immunosuppressives de la syncytine-2 semble faire d’elle un acteur important de cette immunosuppression gestationnelle (A G Lokossou et al. 2014 ; Anne D. et al. 2011).
1-3-2 Rôle dans la formation du placenta
La syncytine-2 est une glycoprotéine d’enveloppe rétrovirale possédant des capacités fusogénique induisant la formation de syncytium (cellules polynucléées découlant de fusion cellulaire) (Anne D. et al. 2011). Le placenta est obtenu après fusion et différenciation des cytotrophoblastes en syncytiotrophoblaste (Fournier T. et al. 2008). L’expression de la syncytine-2 dans les cytotrophoblastes et de son récepteur MFSD2 par les syncytiotrophoblastes permettrait l’incorporation des cytotrophoblastes sous-jacents dans les syncytiotrophoblastes. Ce processus permettrait le renouvellement du tissu syncytial tout au long de la grossesse. Cette structure sera le siège des interactions fœto-maternelles (échange de nutriments essentiels, régulation de la réponse immune, protection contre d’éventuels pathogènes) et de diverses fonctions spécifiques au placenta (synthèse et sécrétion d’hormones influençant le développement fœtal) (Sandra B. et al. 2003).
1-4 Exosomes
1-4-1 Définition
L'étymologie du mot exosome vient du grec exô- qui signifie hors de, et de -sôma, signifiant corps.
Les exosomes sont de petites vésicules membranaires d'environ 50 à 100 nm, adoptant en microscopie électronique une forme de coupelle (Vargas et al. 2014). Ils relarguent directement leur contenu intracellulaire dans le milieu extracellulaire.
Ils peuvent être secrétés par tous les types de cellules, notamment par les cytotrophoblastes, les lymphocytes, réticulocytes, les plaquettes, les mastocytes, les cellules dendritiques, les cellules souches, les astrocytes ou les cellules tumorales (Suchismita S. et al. 2014 ; Atay S. et al. 2011).
1-4-2 Description des exosomes
Les exosomes sont formés à partir des endosomes tardifs. Ces endosomes tardifs sont obtenus à partir des endosomes de tri (Vargas A. 2013). Cette formation des exosomes se déroule comme suit : la membrane endosomale s'invagine entrainant la formation de vésicules dans ce compartiment. On parle de corps multivésiculaire (MVB). Par la suite, l'endosome peut soit fusionner avec le lysosome, ce qui aboutira à sa dégradation ; soit l'endosome peut fusionner avec la membrane plasmique. Cette fusion permet la libération des exosomes dans l'espace extracellulaire (Hanson P.et al. 2012) (Figure 2). Ces exosomes peuvent se retrouver dans plusieurs liquides biologiques tel que : le sang, l’urine, le liquide amniotique (Lucia M. et al.
2010). Les exosomes se différencient des autres microvésicules par les caractéristiques suivantes : ils sont des microvésicules qui suivent la voie endocytaire et non un simple bourgeonnement, ils ont une structure homogène lorsqu’ils sont observés au microscope électronique (A G Lokossou et al. 2014), ils ont une densité de flottabilité qui varie de 1,13 g/mL a 1,19 g/mL (Martinez N. et al. 2014). Bien que la composition des exosomes soit liée au type cellulaire, ils ont en commun un certain nombre de protéines considérées comme des marqueurs des exosomes. Parmi elle, on distingue : les tétraspanines (CD9, CD63 et CD81), le complexe de transport ESCRT (Endosomal Sorbiting Complex Required for Transport), les protéines Alix et TSG101 (Tumor Susceptibility Gene101) (A G Lokossou et al. 2014 ; Simpson R.J et al. 2011). Dans les exosomes, on retrouve également des acides nucléiques et des lipides (Figure 3) (AG Lokossou et al. 2014).
7 Les exosomes peuvent circuler dans tout l’organisme et peuvent ainsi jouer un rôle de médiateurs à distance de leur lieu de production. Ils servent de véhicule de transport et d'expulsion de composantes cellulaires (Preenan P. et al. 2016 ; Murray D. et al. 2015 ; Suchismita S. et al. 2014).
Figure 2: Biogenèse des exosomes –présentation schématique de la voie endocytaire des exosomes produits et sécrétés. (Lucia Mincheva-Nilsson and Vladimir Baranov, 2010) CG, Complex Golgi ; RER, reticulum endoplasmic rugueux ; MV, microvesicule ; MVB, corps multivésiculaire.
1-4-3 Rôles des exosomes
1-4-3-1 Rôle dans le système immunitaire et dans la placentation
De récentes études ont révélé l'existence d'une sécrétion microvésiculaire active incluant les exosomes au sein du placenta. Cette information conduit à des évidences concernant leur fonction dans les phénomènes d'immunotolérance materno-fœtal (Hedlund et al. 2009). De plus, cette sécrétion microvésiculaire est augmentée au cours de la grossesse (Lucia M.et al.
2010).
Les exosomes sont secrétés par différents types de cellules dont les cellules présentatrices d'antigène (CPA), les cytotrophoblastes (Preenan P. et al. 2016 ; Julieta De T et al. 2015 ; Suchismita S. et al. 2014). Les fonctions de ces exosomes dépendent de leur teneur en protéines et en acides nucléiques (A G Lokossou et al. 2014).
En général les exosomes produits par les cellules dendritiques (CD), les lymphocytes B et les macrophages interviennent directement et indirectement dans le système immunitaire.
Ils jouent le rôle d’effecteur immunitaire soit par leur capacité cytotoxique soit par leur implication dans la production de cytokines ou d’anticorps et la maturation des lymphocytes T (Lucia M. et al. 2010 ; Thery C. et al. 2009). Des études récentes ont démontré que les exosomes placentaires sont impliqués dans le contrôle des mécanismes critiques de l'immunité, en altérant la signalisation cellulaire des cellules T ou en inhibant les récepteurs NKG2D (Natural-Killer Group 2, member D) des cellules NK. Les exosomes interviennent aussi sur l'activité apoptotique des cellules via les facteurs FasL, TRAIL (Stenqvist A. et al.
2013 ; Lucia M. et al. 2010). Par ailleurs, il est clairement démontré que la syncytine-2 est incorporée à la surface des exosomes et semble jouer un rôle immunosuppresseur au cours de la grossesse. Tout ceci créant un environnement immunotolérant pour un meilleur développement du fœtus (A G Lokossou et al. 2014 ; Lucia M. et al. 2010).
Figure 3 : Structure schématique de l’exosome et ses protéines (A G LOKOSSOU et al, 2014)
9 PARTIE 2 : MATERIELS ET METHODES
2-1 CADRE D’ETUDES
2-1-1 CADRE INSTITUTIONNEL
Le cadre institutionnel, anciennement appelé Collège Polytechnique Universitaire, devenu Ecole Polytechnique d’Abomey-Calavi depuis, a été créé en février 1977 pour répondre à un besoin de formation technique au niveau de l’enseignement supérieur. A L’époque, la mission assignée au Collège Polytechnique Universitaire (CPU) est de former des techniciens supérieurs capables de satisfaire aux attentes de développement économique du Bénin. Les évolutions de l’environnement, notamment les progrès en matière technologique, ont amené les autorités à engager des réformes en vue de prendre en compte ces avancées et faciliter l’actualisation des enseignements dispensés. C’est dans ce cadre que la dénomination CPU a été modifiée en Ecole Polytechnique d’Abomey-Calavi.
Cette école est composée de 02 secteurs : le secteur industriel et le secteur biologique. Le secteur industriel comprend les départements de : Génie Civil, Génie Informatique et Télécommunication, Génie Mécanique et Energétique, Génie Electrique, Génie de Maintenance Bio Médical Hospitalière. Le secteur biologique comprend les départements de Génie d’Imagerie Médicale et Radiobiologie, Génie de l’environnement, Production Santé Animale, Génie de Technologie Alimentaire et Génie de Biologie Humaine (GBH) où la formation nous est donnée pendant trois ans. Ce département de GBH délivre actuellement des diplômes de Licence Professionnelle et de Technicien Supérieur.
2-1-2 CADRE TECHNIQUE
Après avoir fait huit semaines pour nous familiariser aux différentes sections de laboratoire d’analyses biomédicales du Centre Hospitalier Départemental du Mono-Couffo (CHD-M), nous avons mis en œuvre notre projet d’étude dans le laboratoire de recherche du Centre d'Étude et de Recherche sur le Paludisme Associé à la Grossesse et l'Enfance (CERPAGE) au sein de la Faculté de Science de Santé (FSS) de Cotonou.
2-1-2-1 HISTORIQUE
Créé en avril 1997, dans le département du Mono, sise à Lokossa, le Centre Hospitalier Départemental du Mono-Couffo est un hôpital de référence qui désert les formations sanitaires des départements du Mono et du Couffo. Il est d’une capacité de 121 lits.
Le CHD-M désert une population estimée à un million deux cent quatre-vingt mille six cent vingt-huit (1.280.628) habitants en 2014 et sur le plan administratif douze communes subdivisées en quatre-vingt-cinq arrondissements.
Les patients pour la plupart sont référés des centres de santé d’arrondissement, des centres de santé de commune et des quatre hôpitaux de zones de ces départements à savoir celui d’Aplahoué, de Comè, de Klouékanmè et celui de Lokossa. Toutefois, on enregistre quelques malades en provenance de la république du Togo. Fruit de la coopérative Bénino-Chinoise, ce centre bénéficie depuis sa création d’une assistance particulière de la mission médicale chinoise qui se renouvelle tous les deux ans. Cette mission est composée de 13 chinois dont 12 médecins et un interprète. Son premier directeur a été Dr AYI Marcellin et depuis 1998 il est dirigé par des Administrateurs. Il est actuellement dirigé par monsieur AMOUSSOU Codjo Oscar.
Le centre dispose d’une organisation composée d’un conseil d’administration et des commissions spécialisées et consultatives.
Conformément au décret 90-347 du 14 Novembre 1990 portant approbation des statuts des centres hospitaliers départementaux et formations sanitaires assimilés en République du Bénin, le CHD-M est administré par un conseil d’administration de 14 membres et présidé par un représentant du Ministère de la Santé actuellement en la personne de monsieur PADONOU Aminou Mous Baye. Le conseil statue sur la politique générale du centre élaborée par la direction en conformité avec les objectifs définis dans la nouvelle stratégie sanitaire nationale.
2-1-2-2 PRESENTATION DES INFRASTRUCTURES ET DE L’ORGANISATION ADMINISTRATIVE
Situé entre la Direction Départementale des Enseignements Maternel et Primaire et la Direction de l’Environnement de l’Habitat et de l’Urbanisme. Le Centre Hospitalier Départemental du Mono dispose des services d’urgences, de médecine générale, de chirurgie et d’un bloc opératoire, d’une maternité.
Il dispose également d’un service de pédiatrie, d’un laboratoire hospitalier, d’une banque de sang, d’un service de cardiologie, de diabétologie, de radiologie, d’échographie et de scanner, de kinésithérapie, d’ophtalmologie, de stomatologie, de pharmacie, d’ORL (Oto-Rhino- Laryngologie), d’administration et la morgue.
11 2-1-2-3 LOCALISATION ET PRESENTATION DU LABORATOIRE
Toutes les analyses médicales prescrits aux patients pour leur prise en charge sont réalisées dans le laboratoire du CHD-M. Dès l’entrée principale se trouve à gauche le bâtiment principal abritant le bloc administratif, l’accueil ainsi que quelques services.
Pour accéder au laboratoire, il faut longer le couloir qui sépare la caisse des pharmacies A et B. Au niveau du pavillon des urgences chirurgicales prendre par la droite jusqu’à l’intersection. Dans le couloir se trouve une plaque luminescente portant l’indication « LABORATOIRE-BANQUE DE SANG ». Le laboratoire dispose d’un bureau pour le chef du service de laboratoire, d’une salle de garde pour les techniciens, d’une salle de prélèvement, d’une laverie ainsi que trois différentes sections de manipulation (hématologie-parasitologie, bactériologie, biochimie-sérologie).
Après avoir pris connaissance du fonctionnement du laboratoire, nous avions parcouru toutes les sections en passant par le poste du prélèvement.
Les prélèvements s’effectuent tous les jours ouvrables de 8h à 10h et les échantillons sont acheminés vers les différentes sections où se déroulent les examens :
- En hématologie-Parasitologie : la numération formule sanguine (NFS), la numération des plaquettes, la numération des réticulocytes, la vitesse de sédimentation, l’hémostase (Temps de Coagulation, Temps de Saignement), la goutte épaisse, la densité parasitaire et le frottis sanguin, AKOP (Amibe Kyste et œuf de Parasite)
- En sérologie-Biochimie : le sérodiagnostic de Widal et Félix (SDW), la sérologie du virus de l’immunodéficience humaine (VIH), la glycémie, la créatininémie, l’azotémie, l’uricémie, le dosage des transaminases, la magnésémie, la calcémie, la cholestérolémie totale et HDL, le dosage des triglycérides, la bilirubinémie, la protidémie, l’albuminurie de 24h , la glycémie post prandiale et l’ionogramme.
- En bactériologie : l’examen cytobactériologique des urines (ECBU) et l’antibiogramme, l’examen cytobactériologique du liquide d’ascite, le spermogramme, le prélèvement vaginale.
2-1-2-4 Description du laboratoire de recherche du CERPAGE
Le Centre d'Étude et de Recherche sur le Paludisme Associé à la Grossesse et l'Enfance (CERPAGE) est dirigé par le Professeur Achille Massougbodji.
Ce centre de recherche est affilié à l’unité mixte de recherche 216 de l’Institut de Recherche et de Développement (IRD), à l’Institut des Sciences Biomédicaux Appliquées (ISBA) et à la Faculté des Sciences de la Santé (FSS).
Le CERPAGE est dédié à la recherche épidémiologique, clinique, parasitologique, immunologique et biologique sur le paludisme de la femme enceinte et du jeune enfant.
Il est composé d’une salle de culture cellulaire, d’une salle pour la cytométrie en flux, d’une salle pour la réalisation des tests ELISA (Enzyme Linked ImmunoSorbant Assay). Ce centre de recherche partage un laboratoire de biologie moléculaire avec le Centre de Lutte Intégrée contre le Paludisme (CLIP), dirigé par le Professeur Dorothée Kindé-Gazard. Le CLIP regroupe toutes les institutions œuvrant dans la lutte contre le paludisme au Bénin à savoir, le CERPAGE, des laboratoires de recherche de la FSS, de l’ISBA, de l’Université d’Abomey- Calavi, le Centre de Recherche Entomologique de Cotonou, l’unité mixte de recherche 224 de l’IRD, le Programme National de Lutte contre le Paludisme.
2.2 MATERIEL
2.2.1 Matériel biologique
Nous avons travaillé sur le sérum des femmes enceintes obtenu à partir de leur sang périphérique prélevé dans des tubes secs. A partir de ces sera, nous avons précipité des microvésicules appelées exosomes, dans lesquelles plusieurs molécules dont la syncytine-2 sont incorporées.
2.2.2 Réactifs
Pour la précipitation de ces exosomes, nous avons utilisé une solution de précipitation composée du polyéthylène glycol 8000 (PEG 8000) et de l’eau stérile. Pour préparer un litre de cette solution, nous avons pris 500g de PEG 8000 auquel nous avons ajouté 500 ml d’eau stérile.
Nous avons également utilisé un tampon de conservation des exosomes appelé exosomes binding buffer, du PBS (Phosphate-Buffered Saline) utilisé pour la dilution des exosomes et du détergent Tween utilisé à 0,05% avec du PBS pour préparer la solution de lavage.
2.2.3 Equipements et autres matériel :
Nous avons utilisé, des embouts bleus et jaunes, du sopalin, des marqueurs, des gants, des tubes Eppendorf, des portoirs, des micropipettes réglables et un minuteur.
La réalisation du travail a nécessité l’utilisation de certains équipements comme un vortex pour l’homogénéisation des échantillons, une étuve de marque Memmert utilisé pour incuber les échantillons, une centrifugeuse de marque eppendorf 5810R, un spectrophotomètre de marque infinite (F 200 pro Tecan) qui a permis de faire la lecture des densités optiques (DO) à une longueur d’onde donnée.
13 2.3 METHODES
2.3.1 Type d’étude
Il s’agit d’une étude prospective réalisée du 29 mai au 29 Aout 2017.
2.3.2 Echantillonnage
Nous avons travaillé sur une partie des échantillons d’une cohorte d’étude mise en place au centre hospitalier et universitaire-mère et enfant de la lagune du 15 juillet 2015 au 30 janvier 2017 par l’équipe du Dr Lokossou. Cette cohorte a permis de réaliser une étude multicentrique importante sur la pré-éclampsie. Cette étude a été financée par le Centre de Recherche de Développement International (CRDI). Ce financement a été obtenu par Dr Lokossou Adjimon Gatien en collaboration avec le laboratoire du Professeur Benoit Barbeau de l’Université du Québec à Montréal et du Professeur René Xavier Perrin de l’Hôpital Mère et Enfant CHU-MEL de Cotonou. Par ailleurs, cette étude sur la pré-éclampsie qui nous a permis d’avoir les échantillons pour réaliser notre travail de recherche consiste en un suivi des femmes enceintes au cours de la grossesse. C’est ainsi que le sang périphérique de 22 femmes enceintes normales a été inclue du début de leurs grossesses jusqu’à 20 semaines d’aménorrhée (SA).
Après la purification des exosomes et l’analyse de leur contenu, nous avons évalué les niveaux d’incorporation de la syncytine-2 dans les exosomes de sang périphérique de ces femmes.
2.3.3 Phase prospective
Suite au consentement éclairé et signé des femmes enceintes, des échantillons sanguins ont été prélevés puis analysés.
La collecte des échantillons avait été faite dans des centres de consultation prénatale des Cliniques Deo-Gracias (CDG) de Porto-Novo, Mon Etoile (CME) de Cotonou et du Centre Hospitalière Universitaire-Mère et Enfant de la Lagune (CHU-MEL) de Cotonou. Après le prélèvement, les échantillons ont été transférés directement au laboratoire de Sérologie de CHU-MEL de Cotonou.
Ils ont ensuite été centrifugés d’abord à 3000 trs/min pendant 10 minutes. Les sera obtenus après centrifugation ont été transférés dans des tubes Eppendorf préalablement identifiés.
Ensuite, ces sérums ont été centrifugés une deuxième fois à 1500 trs/min pendant 15 minutes.
Cette deuxième centrifugation permet d’enlever du sérum des débris cellulaires restants.
Pour maintenir l’intégrité des constituants du sérum, les échantillons sériques ont été conservés au congélateur à une température de -20°C au laboratoire de Sérologie de CHU- MEL de Cotonou. Pour la poursuite des analyses, les échantillons ont été transportés, dans une glacière contenant des accumulateurs de froid, au laboratoire de CERPAGE de la FSS de Cotonou pour la purification des exosomes et le dosage de la syncytine-2 par la technique ELISA.
2.3.4 Phase analytique
2.3.4.1 Précipitation des exosomes
La précipitation des exosomes consiste à prélever 250 µl du sérum auquel nous avons rajouté 63 µl de la solution de précipitation des exosomes. Après avoir bien homogénéisé, le mélange est incubé à une température de 4°C pendant 30 min puis il est centrifugé à 1500 trs/min pendant 30 min. Le surnageant obtenu est éliminé et le culot obtenu est conservé. Pour éliminer les résidus de surnageant, le culot est centrifugé à nouveau à 1500 trs/min pendant 5 min pour éliminer tout trace de liquide. Le culot obtenu contient les exosomes. Il est resuspendu dans 200 µl d’une solution tampon permettant la libération du contenu des exosomes. Le mélange obtenu est vortexé pendant 15 secondes puis incubé dans un bain marie à 37°C pendant 20 min pour libérer les protéines d’exosomes. Après cette incubation, le mélange a été centrifugé à 1500 trs/min pendant 5 minutes pour éliminer les débris membranaires et conserver la phase liquide qui contient les protéines d’exosomes. Le surnageant est ensuite transféré dans un autre tube Eppendorf convenablement étiqueté. Par la suite, les exosomes purifiés sont centrifugé à 1500 trs/min pendant 5 minutes pour éliminer les débris restants. Le surnageant obtenu contenant les protéines est conservé à une température de 4°C pour une utilisation immédiate et à –20°C pour une utilisation ultérieure.
2.3.4.2 Quantification des exosomes.
La quantification des exosomes consiste d’abord à diluer chaque échantillon au 1/10ème avec de l’eau distillée. Ensuite 10µl de l’échantillon dilué est déposé dans chaque puits d’une plaque à 96 puits à fond plat suivant un plan d’expérimentation bien établi.
Nous avons préalablement préparé une solution de calibration à partir d’une solution mère de BSA (Bovine Sérum Albumine) concentrée à 400 µg/ml (400 µg de BSA+1 ml d’une solution de PBS). A partir de cette solution mère, nous avons réalisé une dilution sérielle de 1/2 jusqu’au 1/128ème. Nous avons donc obtenu une gamme avec les concentrations suivante:
2000 µg/ml, 1000 µg/ml, 500 µg/ml, 250 µg/ml, 125 µg/ml, 62,5 µg/ml et 31,25 µg/ml.
15 Cette gamme de la BSA préparée ainsi que les échantillons dilués ont été déposé en dupliquât, dans les puits d’une plaque à 96 puits à fond plat suivant un plan de plaque prédéfini. Ensuite nous avons préparé, à partir d’une trousse commerciale, la solution de quantification des protéines contenues dans les exosomes selon la méthode de Bradford.
Nous avons par la suite déposé 200 µl de solution de Bradford préparée dans chaque puits où nous avons préalablement déposé des échantillons. La plaque a été recouverte convenablement avec du parafilm et incubée à 37°C pendant 30 min puis nous avons lu la densité optique (DO) avec un spectrophotomètre à 560 nm. Une courbe standard a été établie à partir de la gamme de BSA. Elle a permis de déterminer la concentration des différents échantillons.
2.3.4.3 Quantification de la syncytine-2 et la protéine CD63
Cette quantification a été faite par la technique ELISA. La protéine CD63 est un des marqueurs des exosomes. Sa quantification nous a permis d’évaluer la pureté de nos préparations d’exosomes. Les valeurs de DO obtenues après le dosage de la syncytine-2 ont été normalisées avec celles obtenues pour le CD63. Nous avons par la suite comparé pour chaque femme le ratio syncytine-2/CD63 entre les différentes semaines d’aménorrhée.
Quantification de la syncytine-2
Après la quantification des protéines, nous avons dilué les protéines extraites des exosomes pour pouvoir déposer dans chaque puit d’une plaque ELISA 25 µg de protéines totales.
La plaque est ensuite recouverte avec du parafilm et incubée à une température de 37°C pendant toute une nuit.
Le lendemain, tous les puits ont été vidés par retournement et lavés trois fois en remplissant les puits avec un tampon de lavage composé de Phosphate Buffered Saline (PBS) et 0,05%
de tween. Ces lavages permettent d’enlever l’excès de protéines non adsorbé par la plaque.
Après ces séries de lavages, nous avons déposé 50 µl d’une solution d’anticorps anti- syncytine-2 dilué au 1/50ème dans les puits correspondants. Après avoir recouvert la plaque avec de parafilm, cette dernière a été incubée à la température ambiante pendant une heure.
Après trois séries de lavages, nous avons rajouté 50 µl d’une solution d’anticorps secondaire conjugué à la peroxydase et diluée au 1/5000ème.
La plaque a ensuite été incubée pendant une heure à température ambiante. Après trois séries de lavages avec la solution de lavage, nous avons déposé 50 µl de la solution de révélation qui est le TMB (TétraMéthylBenzidine). Le TMB est un substrat chromogène permettant d’induire la coloration bleue témoignant la présence de la syncytine-2. Après 15 min d’incubation à l’abri de la lumière, la réaction a été arrêtée avec l’acide sulfurique de concentration 2 M. Enfin, les densités optiques correspondant à chaque puit ont été mesurées au spectrophotomètre à 450 nm.
Quantification de la protéine CD63
Le dosage de la protéine CD63 dans les surnageant contenant les exosomes a été fait en utilisant une trousse de la compagnie Elabscience. Nous avons centrifugé l’étalon à 10000 trs/min pendant une minute, puis nous avons reconstitué la gamme en lui ajoutant 1 ml de solution de dilution des échantillons. Ceci nous a permis d’obtenir une solution concentrée à 10 ng/ml. Après 10 min d’incubation pour permettre une bonne homogénéisation nous avons réalisé une dilution sérielle pour pouvoir obtenir les concentrations suivantes : 10 ; 5 ; 2,5 ; 1,25 ; 0,625 ; 0,3125 ; 0,156 ; 0 ng/ml. Nous avons ensuite distribué en double 100 µl du contrôle négatif (PBS), des différents points de la gamme et des échantillons dans des puits correspondants. La plaque a été recouverte de papier scellant puis incubée à 37°C pendant 90 min. Après ce temps d’incubation, nous avons retiré la plaque et jeté le liquide se trouvant dans chaque puits. Nous avons par la suite rajouté 100 µl de la solution de détection composée d’anticorps primaire anti-CD63 couplé à la biotine. La plaque a été recouverte et incubé à 37°C pendant 1h.
Après trois séries de lavages de 5 min chacun. Nous avons rajouté dans chaque puit 90 µl d’une solution d’anticorps secondaire conjugué à la peroxydase et incubée à 37°C pendant 30 min après avoir recouvert la plaque avec le papier scellant.
Après trois séries de lavages de 5 min chacun, nous avons rajouté 90 µl du substrat de la peroxydase, le Triméthylebenzidine (TMB) dans chaque puits et recouvert la plaque avec du papier scellant et nous l’avons incubé à 37°C pendant 15 min à l’abri de la lumière. Nous avons arrêté la réaction en distribuant 50 µl d’acide sulfurique à 2 molaires. Enfin, les densités optiques correspondant à chaque puit ont été mesurées au spectrophotomètre à 450 nm.
17 2.3.4-Phase poste analytique
Après les expérimentations et les lectures des densités optiques (DO), les DO réelles des échantillons ont été calculées en soustrayant la DO des puits contrôles négatifs des DO de ces échantillons. Les valeurs obtenues sont enregistrées dans un fichier en utilisant le logiciel Excel. Ce logiciel a permis de faire des analyses descriptives.
PARTIE 3 : RESULTATS ET COMMENTAIRES 3-1 RESULTATS
Notre travail d’étude et de recherche s’est porté sur 22 échantillons de femmes enceintes normales dont le sang périphérique a été prélevé entre 6 et 17 semaines d’aménorrhée.
Pendant cette période, la moyenne des prélèvements par femme était de 2,82. La moyenne d’âge était de 30,76 (±4,08) avec l’âge minimum de 22 ans et l’âge maximum de 35 ans (Tableau1).
Tableau 1 : Moyenne d’âge des femmes enceintes de la cohorte.
Paramètres Femmes enceintes (n=22)
Minimum Maximum
Age 30,76±4,08 22 35
La répartition des femmes en tranche d’âges montre que 50% des femmes de la cohorte avait entre 20 et 30 ans et les 50% restant avaient un âge supérieur à 30 ans (Tableau 2).
Tableau 2 : Description des femmes enceintes par groupe d’âge.
Tranche d’âges Fréquences Pourcentages Cumulée
20 - 30 7 50 50
> 30 7 50 100
Total 14 100 -
Par la suite, nous avons regroupé les femmes enceintes en catégorie en fonction de l’âge gestationnel. Nous avons alors regardé l’incorporation de la syncytine-2 dans les exosomes de 0 à 9,5 SA puis de 9,6 à 13 SA ; de 13,1 à 16 SA et de 16 à 20 SA.
La figure 4 montre une incorporation croissante de la syncytine-2 entre 0 et 13 SA dans les exosomes des femmes enceintes. Entre 0 et 9,5 SA, la moyenne d’incorporation du ratio syncytine-2/CD63 est de 19 (±17,36). Entre 9,6 et 13 SA, cette moyenne est de 27,38 (±25,10) (Tableau 3). Après 13 SA un seuil semble être atteint, suivi d’une diminution jusqu’à 16 SA.
Entre 13,1 et 16 SA, la moyenne d’incorporation de la syncytine-2/CD63 dans les exosomes des femmes enceintes normales est de 14,15 (±10,15) entre 13,1 et 16 SA. (Tableau 3).
19 Entre 16 et 20 SA, l’incorporation de la syncytine-2 augmente à nouveau dans les exosomes de ces femmes, avec une moyenne d’incorporation du ratio syncytine-2/CD63 qui est 27,14 (±20,45) (Tableau 3).
Figure 4 : Variation du niveau d’incorporation de la syncytine-2 dans les exosomes du sang périphérique de femmes enceintes durant les vingt premières semaines.
0 5 10 15 20 25 30
0 à 9,5 sa 9,6 à 13 sa 13,1 à 16 sa 16 à 20 sa
RatioSyncytine-2/CD63
Semaines d'aménorhées
Tableau 3 : Incorporation de la syncytine-2 dans les exosomes entre 0 et 9,5 SA.
SA Observés Moyenne
Ratio syn-2/CD63
Ecart-type Intervalles de confiance à 95%
0 - 9,5 9,6 – 13 13,1 – 16 16 – 20
17 20 7 13
19,00 27,38 14,15 27,14
17,36 25,10 10,13 29,45
10,08 – 27,93 15,64 – 39,13 4,78 – 23,53 9,34 – 44, 93
DISCUSSION
Plusieurs microvésicules comme les exosomes sont sécrétées au cours de la grossesse (A G Lokossou et al. 2014 ; Lucia M. et al. 2010 ; Hedlund et al. 2009). Au cours de la grossesse, on observe une augmentation du nombre d’exosomes d’origine placentaire dans le sang périphérique maternel (Suchismita S. et al. 2014 ; Salomon C. et al. 2014). Des études scientifiques ont démontré la présence de la syncytine-2 à la surface de ces exosomes (Toufaily C. et al. 2015 ; Vargas A et al. 2014 ; Chie-pein C. et al. 2008). L’objectif général de notre étude est d’évaluer le niveau d’incorporation de la syncytine-2 à la surface des exosomes des femmes enceintes durant les 20 premières semaines de la grossesse. Il ressort de nos résultats une incorporation croissante de la syncytine-2 à la surface des exosomes entre 9,6 et 13 SA suivi d’une diminution entre 13,1 et 16 SA. L’incorporation de la syncytine-2 croit à nouveau entre 16 et 20 SA. A la fin du premier trimestre, un seuil de syncytine-2 semble être nécessaire pour la poursuite de la grossesse, à travers un placenta bien formé. Par ailleurs, pour assurer sa bonne fonction d’échanges materno-foetaux, les cytotrophoblastes villeux fusionnent pour former le syncytiotrophoblaste (Anne D. et al. 2011 ; Fournier T. et al.
2008). Cette fusion se fait grâce à la syncytine-2. C’est cette structure multi nucléée qui assure une bonne fonction du placenta (Sandra B. 2003). A la fin du premier trimestre, cette fusion devient plus importante pour assurer un bon déroulement de la grossesse (Vargas A et al.
2014 ; Toufaily C. et al. 2013 ; Anne D. et al. 2011). C’est ce qui pourrait expliquer la diminution de l’incorporation de la syncytine-2 dans les exosomes. Cette période semble définir une phase de transition au cours de laquelle le bon déroulement du second et du troisième trimestre est préparé.
21 Si le seuil d’incorporation de la syncytine-2 de 27,38 n’est pas atteint au cours du premier trimestre, on assistera certainement à des défauts de placentation accompagnés de pathologie gestationnelles comme la pré-éclampsie (Kshirsagar S.K. et al. 2012 ; Mincheva-Lucia M. et al. 2010). La diminution de l’incorporation de la syncytine-2 observée à la fin du premier trimestre doit être rapidement compensée pour permettre au placenta de maintenir sa structure et ses fonctions. C’est probablement ce qui explique l’augmentation de l’incorporation de la syncytine-2 observée entre 16 et 20 SA. Cette augmentation est le reflet de ce qui se passe au niveau placentaire (Suchismita S. et al. 2014 ; Salomon C. et al. 2014). Ainsi, la synthèse de syncytine-2 par les cytotrophoblastes au cours du second trimestre devrait augmenter pour permettre une bonne poursuite de la formation du syncytiotrophoblaste et donc permettre un bon fonctionnement du placenta au cours de cette période.
Nous sommes les premiers à évaluer l’incorporation de la syncytine-2 dans les exosomes placentaires entre 1 et 20 SA, donc juste avant l’apparition des signes cliniques de la pré- éclampsie. Le rôle de la syncytine-2 dans le développement de la pré-éclampsie est maintenant bien connue (Toudic C. et al. 2017 ; Toufaily C. et al. 2015 ; A.G Lokossou et al.
2014 ; Vargas A et al. 2014). Des études ciblant ces différentes périodes dans d’autres cohortes avec un effectif plus important sont nécessaires pour envisager l’utilisation de cette incorporation de la syncytine-2 comme un marqueur précoce de diagnostic de certaines pathologies gestationnelles comme la pré-éclampsie. En effet, il serait intéressant d’évaluer l’incorporation de cette protéine dans les exosomes de femmes enceintes ayant souffert de la PE au cours de leur grossesse entre une semaine d’aménorrhée et 20 SA.
CONCLUSION
Le placenta, organe fondamental pour le maintien et le développement fœtal se forme après la fusion des cytotrophoblastes pour former une structure multinucléée appelée syncytiotrophoblaste. Cette fusion est possible grâce à la syncytine-2 exprimée par les cytotrophoblastes. Cette protéine est incorporée à la surface des exosomes placentaires au cours de la grossesse. Notre étude de recherche, a montré une augmentation de l’incorporation de la syncytine-2 entre 9,6 -13 SA et 16 -20 SA. Ainsi, une faible incorporation de la syncytine-2 dans les exosomes au cours de ces périodes pourrait être associée à des pathologies gestationnelles comme la pré-éclampsie. Ce dosage de la syncytine-2 peut permettre de savoir précocement si une femme enceinte développera ou non la pré-éclampsie.
23 RECOMMENDATION
Nous recommandons aux chercheurs biologistes, de poursuivre les recherches pour déterminer les mécanismes d’incorporation de la syncytine-2 à la surface des exosomes et les pathologies qui seront à l’origine d’une mauvaise expression de cette protéine.
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29- Vargas A. Shufeng Z. Ethier-Chiasson, M. Denis, F. Julie , L. Caroline, G. Benoit, B. Syncytin proteins incorporated in placenta exosomes are important for cell uptake and show variation in abundance in serum exosomes from patients with preeclampsia.
FASEB.2014, .8, 3703-3719.
30- Vargas. Implication des protéines d'enveloppe d'hervs dans le développement du placenta: utilisation potentielle comme biomarqueurs de la pré-eclampsie. 2013.
27 TABLE DES MATIERES
LISTE DES ENSEIGNANTS ... i
DEDICACE ... iii
REMERCIEMENTS ... iv
HOMMAGES ... vi
LISTE DES SIGLES ET ABREVIATIONS ... vii
LISTE DES TABLEAUX ... viii
LISTE DES FIGURES ... viii
RESUME ... ix
ABSTRACT ... x
SOMMAIRE ... xi
INTRODUCTION ... 1
PARTIE 1 : SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE ... 3
1-1 Définition Syncytine ... 3
1-2 Différents types de syncytine ... 3
1-2-1 Syncytine-1 ... 3
1-2-2 Syncytine-2 ... 3
1-3 Rôles de la syncytine-2 ... 5
1-3-1 Rôle immunosuppresseur ... 5
1-3-2 Rôle dans la formation du placenta ... 5
1-4 Exosomes ... 6
1-4-1 Définition ... 6
1-4-2 Description des exosomes ... 6
1-4-3 Rôles des exosomes ... 7
1-4-3-1 Rôle dans le système immunitaire et dans la placentation ... 7
PARTIE 2 : MATERIELS ET METHODES ... 9
2-1CADRE D’ETUDES ... 9
2-1-1 CADRE INSTITUTIONNEL ... 9
2-1-2 CADRE TECHNIQUE ... 9
2-1-2-1 HISTORIQUE ... 9
2-1-2-2 PRESENTATION DES INFRASTRUCTURES ET DE L’ORGANISATION ADMINISTRATIVE ... 10
2-1-2-3 LOCALISATION ET PRESENTATION DU LABORATOIRE ... 11
2-1-2-4 Description du laboratoire de recherche du CERPAGE ... 11
2.2 MATERIEL ... 12
2.2.1 Matériel biologique ... 12
2.2.2 Réactifs ... 12
2.2.3 Equipements et autres matériel : ... 12
2.3 METHODES ... 13
2.3.1 Type d’étude ... 13
2.3.2 Echantillonnage ... 13
2.3.3 Phase prospective ... 13
2.3.4 Phase analytique ... 14
2.3.4.1 Précipitation des exosomes ... 14
2.3.4.2 Quantification des exosomes. ... 14
2.3.4.3 Quantification de la syncytine-2 et la protéine CD63 ... 15
2.3.4-Phase poste analytique ... 17
PARTIE 3 : RESULTATS ET COMMENTAIRES ... 18
3-1 RESULTATS ... 18
DISCUSSION ... 20
CONCLUSION ... 22
RECOMMENDATION ... 23
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUE ... 24
TABLE DES MATIERES ... 27 ANNEXES ... a
a
ANNEXES
Annexe: 1Plaque de réaction en ELISA après réaction
Annexe:2Plaque de réaction en ELISA après ajout de TMB
Photo1: spectrophotomètre de marque infinit et imprimante ELISA
Photo 2: centrifugeuse de marque eppendorf 5810 R
Photo 3: bain marie
Annexe 3: Photos des appareils qui ont permis de realiser ce travail
