PARTIE 3 : RESULTATS ET COMMENTAIRES
2.2 MATERIEL
2.2.3 Equipements et autres matériel :
Nous avons utilisé, des embouts bleus et jaunes, du sopalin, des marqueurs, des gants, des tubes Eppendorf, des portoirs, des micropipettes réglables et un minuteur.
La réalisation du travail a nécessité l’utilisation de certains équipements comme un vortex pour l’homogénéisation des échantillons, une étuve de marque Memmert utilisé pour incuber les échantillons, une centrifugeuse de marque eppendorf 5810R, un spectrophotomètre de marque infinite (F 200 pro Tecan) qui a permis de faire la lecture des densités optiques (DO) à une longueur d’onde donnée.
13 2.3 METHODES
2.3.1 Type d’étude
Il s’agit d’une étude prospective réalisée du 29 mai au 29 Aout 2017.
2.3.2 Echantillonnage
Nous avons travaillé sur une partie des échantillons d’une cohorte d’étude mise en place au centre hospitalier et universitaire-mère et enfant de la lagune du 15 juillet 2015 au 30 janvier 2017 par l’équipe du Dr Lokossou. Cette cohorte a permis de réaliser une étude multicentrique importante sur la pré-éclampsie. Cette étude a été financée par le Centre de Recherche de Développement International (CRDI). Ce financement a été obtenu par Dr Lokossou Adjimon Gatien en collaboration avec le laboratoire du Professeur Benoit Barbeau de l’Université du Québec à Montréal et du Professeur René Xavier Perrin de l’Hôpital Mère et Enfant CHU-MEL de Cotonou. Par ailleurs, cette étude sur la pré-éclampsie qui nous a permis d’avoir les échantillons pour réaliser notre travail de recherche consiste en un suivi des femmes enceintes au cours de la grossesse. C’est ainsi que le sang périphérique de 22 femmes enceintes normales a été inclue du début de leurs grossesses jusqu’à 20 semaines après centrifugation ont été transférés dans des tubes Eppendorf préalablement identifiés.
Ensuite, ces sérums ont été centrifugés une deuxième fois à 1500 trs/min pendant 15 minutes.
Cette deuxième centrifugation permet d’enlever du sérum des débris cellulaires restants.
Pour maintenir l’intégrité des constituants du sérum, les échantillons sériques ont été conservés au congélateur à une température de -20°C au laboratoire de Sérologie de CHU-MEL de Cotonou. Pour la poursuite des analyses, les échantillons ont été transportés, dans une glacière contenant des accumulateurs de froid, au laboratoire de CERPAGE de la FSS de Cotonou pour la purification des exosomes et le dosage de la syncytine-2 par la technique ELISA.
2.3.4 Phase analytique
2.3.4.1 Précipitation des exosomes
La précipitation des exosomes consiste à prélever 250 µl du sérum auquel nous avons rajouté 63 µl de la solution de précipitation des exosomes. Après avoir bien homogénéisé, le mélange est incubé à une température de 4°C pendant 30 min puis il est centrifugé à 1500 trs/min pendant 30 min. Le surnageant obtenu est éliminé et le culot obtenu est conservé. Pour éliminer les résidus de surnageant, le culot est centrifugé à nouveau à 1500 trs/min pendant 5 min pour éliminer tout trace de liquide. Le culot obtenu contient les exosomes. Il est resuspendu dans 200 µl d’une solution tampon permettant la libération du contenu des exosomes. Le mélange obtenu est vortexé pendant 15 secondes puis incubé dans un bain marie à 37°C pendant 20 min pour libérer les protéines d’exosomes. Après cette incubation, le mélange a été centrifugé à 1500 trs/min pendant 5 minutes pour éliminer les débris membranaires et conserver la phase liquide qui contient les protéines d’exosomes. Le surnageant est ensuite transféré dans un autre tube Eppendorf convenablement étiqueté. Par la suite, les exosomes purifiés sont centrifugé à 1500 trs/min pendant 5 minutes pour éliminer les débris restants. Le surnageant obtenu contenant les protéines est conservé à une température de 4°C pour une utilisation immédiate et à –20°C pour une utilisation ultérieure.
2.3.4.2 Quantification des exosomes.
La quantification des exosomes consiste d’abord à diluer chaque échantillon au 1/10ème avec de l’eau distillée. Ensuite 10µl de l’échantillon dilué est déposé dans chaque puits d’une plaque à 96 puits à fond plat suivant un plan d’expérimentation bien établi.
Nous avons préalablement préparé une solution de calibration à partir d’une solution mère de BSA (Bovine Sérum Albumine) concentrée à 400 µg/ml (400 µg de BSA+1 ml d’une solution de PBS). A partir de cette solution mère, nous avons réalisé une dilution sérielle de 1/2 jusqu’au 1/128ème. Nous avons donc obtenu une gamme avec les concentrations suivante:
2000 µg/ml, 1000 µg/ml, 500 µg/ml, 250 µg/ml, 125 µg/ml, 62,5 µg/ml et 31,25 µg/ml.
15 Cette gamme de la BSA préparée ainsi que les échantillons dilués ont été déposé en dupliquât, dans les puits d’une plaque à 96 puits à fond plat suivant un plan de plaque prédéfini. Ensuite nous avons préparé, à partir d’une trousse commerciale, la solution de quantification des protéines contenues dans les exosomes selon la méthode de Bradford.
Nous avons par la suite déposé 200 µl de solution de Bradford préparée dans chaque puits où nous avons préalablement déposé des échantillons. La plaque a été recouverte convenablement avec du parafilm et incubée à 37°C pendant 30 min puis nous avons lu la densité optique (DO) avec un spectrophotomètre à 560 nm. Une courbe standard a été établie à partir de la gamme de BSA. Elle a permis de déterminer la concentration des différents échantillons.
2.3.4.3 Quantification de la syncytine-2 et la protéine CD63
Cette quantification a été faite par la technique ELISA. La protéine CD63 est un des marqueurs des exosomes. Sa quantification nous a permis d’évaluer la pureté de nos préparations d’exosomes. Les valeurs de DO obtenues après le dosage de la syncytine-2 ont été normalisées avec celles obtenues pour le CD63. Nous avons par la suite comparé pour chaque femme le ratio syncytine-2/CD63 entre les différentes semaines d’aménorrhée.
Quantification de la syncytine-2
Après la quantification des protéines, nous avons dilué les protéines extraites des exosomes pour pouvoir déposer dans chaque puit d’une plaque ELISA 25 µg de protéines totales.
La plaque est ensuite recouverte avec du parafilm et incubée à une température de 37°C pendant toute une nuit.
Le lendemain, tous les puits ont été vidés par retournement et lavés trois fois en remplissant les puits avec un tampon de lavage composé de Phosphate Buffered Saline (PBS) et 0,05%
de tween. Ces lavages permettent d’enlever l’excès de protéines non adsorbé par la plaque.
Après ces séries de lavages, nous avons déposé 50 µl d’une solution d’anticorps anti-syncytine-2 dilué au 1/50ème dans les puits correspondants. Après avoir recouvert la plaque avec de parafilm, cette dernière a été incubée à la température ambiante pendant une heure.
Après trois séries de lavages, nous avons rajouté 50 µl d’une solution d’anticorps secondaire conjugué à la peroxydase et diluée au 1/5000ème.
La plaque a ensuite été incubée pendant une heure à température ambiante. Après trois séries de lavages avec la solution de lavage, nous avons déposé 50 µl de la solution de révélation qui est le TMB (TétraMéthylBenzidine). Le TMB est un substrat chromogène permettant d’induire la coloration bleue témoignant la présence de la syncytine-2. Après 15 min d’incubation à l’abri de la lumière, la réaction a été arrêtée avec l’acide sulfurique de concentration 2 M. Enfin, les densités optiques correspondant à chaque puit ont été mesurées au spectrophotomètre à 450 nm.
Quantification de la protéine CD63
Le dosage de la protéine CD63 dans les surnageant contenant les exosomes a été fait en utilisant une trousse de la compagnie Elabscience. Nous avons centrifugé l’étalon à 10000 trs/min pendant une minute, puis nous avons reconstitué la gamme en lui ajoutant 1 ml de solution de dilution des échantillons. Ceci nous a permis d’obtenir une solution concentrée à 10 ng/ml. Après 10 min d’incubation pour permettre une bonne homogénéisation nous avons réalisé une dilution sérielle pour pouvoir obtenir les concentrations suivantes : 10 ; 5 ; 2,5 ; 1,25 ; 0,625 ; 0,3125 ; 0,156 ; 0 ng/ml. Nous avons ensuite distribué en double 100 µl du contrôle négatif (PBS), des différents points de la gamme et des échantillons dans des puits correspondants. La plaque a été recouverte de papier scellant puis incubée à 37°C pendant 90 min. Après ce temps d’incubation, nous avons retiré la plaque et jeté le liquide se trouvant dans chaque puits. Nous avons par la suite rajouté 100 µl de la solution de détection composée d’anticorps primaire anti-CD63 couplé à la biotine. La plaque a été recouverte et incubé à 37°C pendant 1h.
Après trois séries de lavages de 5 min chacun. Nous avons rajouté dans chaque puit 90 µl d’une solution d’anticorps secondaire conjugué à la peroxydase et incubée à 37°C pendant 30 min après avoir recouvert la plaque avec le papier scellant.
Après trois séries de lavages de 5 min chacun, nous avons rajouté 90 µl du substrat de la peroxydase, le Triméthylebenzidine (TMB) dans chaque puits et recouvert la plaque avec du papier scellant et nous l’avons incubé à 37°C pendant 15 min à l’abri de la lumière. Nous avons arrêté la réaction en distribuant 50 µl d’acide sulfurique à 2 molaires. Enfin, les densités optiques correspondant à chaque puit ont été mesurées au spectrophotomètre à 450 nm.
17 2.3.4-Phase poste analytique
Après les expérimentations et les lectures des densités optiques (DO), les DO réelles des échantillons ont été calculées en soustrayant la DO des puits contrôles négatifs des DO de ces échantillons. Les valeurs obtenues sont enregistrées dans un fichier en utilisant le logiciel Excel. Ce logiciel a permis de faire des analyses descriptives.
PARTIE 3 : RESULTATS ET COMMENTAIRES
Tableau 1 : Moyenne d’âge des femmes enceintes de la cohorte.
Paramètres Femmes enceintes (n=22)
Minimum Maximum
Age 30,76±4,08 22 35
La répartition des femmes en tranche d’âges montre que 50% des femmes de la cohorte avait entre 20 et 30 ans et les 50% restant avaient un âge supérieur à 30 ans (Tableau 2).
Tableau 2 : Description des femmes enceintes par groupe d’âge.
Tranche d’âges Fréquences Pourcentages Cumulée
20 - 30 7 50 50
> 30 7 50 100
Total 14 100 -
Par la suite, nous avons regroupé les femmes enceintes en catégorie en fonction de l’âge gestationnel. Nous avons alors regardé l’incorporation de la syncytine-2 dans les exosomes de 0 à 9,5 SA puis de 9,6 à 13 SA ; de 13,1 à 16 SA et de 16 à 20 SA.
La figure 4 montre une incorporation croissante de la syncytine-2 entre 0 et 13 SA dans les exosomes des femmes enceintes. Entre 0 et 9,5 SA, la moyenne d’incorporation du ratio syncytine-2/CD63 est de 19 (±17,36). Entre 9,6 et 13 SA, cette moyenne est de 27,38 (±25,10) (Tableau 3). Après 13 SA un seuil semble être atteint, suivi d’une diminution jusqu’à 16 SA.
Entre 13,1 et 16 SA, la moyenne d’incorporation de la syncytine-2/CD63 dans les exosomes des femmes enceintes normales est de 14,15 (±10,15) entre 13,1 et 16 SA. (Tableau 3).
19 Entre 16 et 20 SA, l’incorporation de la syncytine-2 augmente à nouveau dans les exosomes de ces femmes, avec une moyenne d’incorporation du ratio syncytine-2/CD63 qui est 27,14 (±20,45) (Tableau 3).
Figure 4 : Variation du niveau d’incorporation de la syncytine-2 dans les exosomes du sang périphérique de femmes enceintes durant les vingt premières semaines.
0 5 10 15 20 25 30
0 à 9,5 sa 9,6 à 13 sa 13,1 à 16 sa 16 à 20 sa
RatioSyncytine-2/CD63
Semaines d'aménorhées
Tableau 3 : Incorporation de la syncytine-2 dans les exosomes entre 0 et 9,5 SA. Lokossou et al. 2014 ; Lucia M. et al. 2010 ; Hedlund et al. 2009). Au cours de la grossesse, on observe une augmentation du nombre d’exosomes d’origine placentaire dans le sang périphérique maternel (Suchismita S. et al. 2014 ; Salomon C. et al. 2014). Des études scientifiques ont démontré la présence de la syncytine-2 à la surface de ces exosomes (Toufaily C. et al. 2015 ; Vargas A et al. 2014 ; Chie-pein C. et al. 2008). L’objectif général de notre étude est d’évaluer le niveau d’incorporation de la syncytine-2 à la surface des exosomes des femmes enceintes durant les 20 premières semaines de la grossesse. Il ressort de nos résultats une incorporation croissante de la syncytine-2 à la surface des exosomes entre 9,6 et 13 SA suivi d’une diminution entre 13,1 et 16 SA. L’incorporation de la syncytine-2 croit à nouveau entre 16 et 20 SA. A la fin du premier trimestre, un seuil de syncytine-2 semble être nécessaire pour la poursuite de la grossesse, à travers un placenta bien formé. Par ailleurs, pour assurer sa bonne fonction d’échanges materno-foetaux, les cytotrophoblastes villeux fusionnent pour former le syncytiotrophoblaste (Anne D. et al. 2011 ; Fournier T. et al.
2008). Cette fusion se fait grâce à la syncytine-2. C’est cette structure multi nucléée qui assure une bonne fonction du placenta (Sandra B. 2003). A la fin du premier trimestre, cette fusion devient plus importante pour assurer un bon déroulement de la grossesse (Vargas A et al.
2014 ; Toufaily C. et al. 2013 ; Anne D. et al. 2011). C’est ce qui pourrait expliquer la diminution de l’incorporation de la syncytine-2 dans les exosomes. Cette période semble définir une phase de transition au cours de laquelle le bon déroulement du second et du troisième trimestre est préparé.
21 Si le seuil d’incorporation de la syncytine-2 de 27,38 n’est pas atteint au cours du premier trimestre, on assistera certainement à des défauts de placentation accompagnés de pathologie gestationnelles comme la pré-éclampsie (Kshirsagar S.K. et al. 2012 ; Mincheva-Lucia M. et al. 2010). La diminution de l’incorporation de la syncytine-2 observée à la fin du premier trimestre doit être rapidement compensée pour permettre au placenta de maintenir sa structure et ses fonctions. C’est probablement ce qui explique l’augmentation de l’incorporation de la syncytine-2 observée entre 16 et 20 SA. Cette augmentation est le reflet de ce qui se passe au niveau placentaire (Suchismita S. et al. 2014 ; Salomon C. et al. 2014). Ainsi, la synthèse de syncytine-2 par les cytotrophoblastes au cours du second trimestre devrait augmenter pour permettre une bonne poursuite de la formation du syncytiotrophoblaste et donc permettre un bon fonctionnement du placenta au cours de cette période.
Nous sommes les premiers à évaluer l’incorporation de la syncytine-2 dans les exosomes placentaires entre 1 et 20 SA, donc juste avant l’apparition des signes cliniques de la pré-éclampsie. Le rôle de la syncytine-2 dans le développement de la pré-éclampsie est maintenant bien connue (Toudic C. et al. 2017 ; Toufaily C. et al. 2015 ; A.G Lokossou et al.
2014 ; Vargas A et al. 2014). Des études ciblant ces différentes périodes dans d’autres cohortes avec un effectif plus important sont nécessaires pour envisager l’utilisation de cette incorporation de la syncytine-2 comme un marqueur précoce de diagnostic de certaines pathologies gestationnelles comme la pré-éclampsie. En effet, il serait intéressant d’évaluer l’incorporation de cette protéine dans les exosomes de femmes enceintes ayant souffert de la PE au cours de leur grossesse entre une semaine d’aménorrhée et 20 SA.
CONCLUSION
Le placenta, organe fondamental pour le maintien et le développement fœtal se forme après la fusion des cytotrophoblastes pour former une structure multinucléée appelée syncytiotrophoblaste. Cette fusion est possible grâce à la syncytine-2 exprimée par les cytotrophoblastes. Cette protéine est incorporée à la surface des exosomes placentaires au cours de la grossesse. Notre étude de recherche, a montré une augmentation de l’incorporation de la syncytine-2 entre 9,6 -13 SA et 16 -20 SA. Ainsi, une faible incorporation de la syncytine-2 dans les exosomes au cours de ces périodes pourrait être associée à des pathologies gestationnelles comme la pré-éclampsie. Ce dosage de la syncytine-2 peut permettre de savoir précocement si une femme enceinte développera ou non la pré-éclampsie.
23 RECOMMENDATION
Nous recommandons aux chercheurs biologistes, de poursuivre les recherches pour déterminer les mécanismes d’incorporation de la syncytine-2 à la surface des exosomes et les pathologies qui seront à l’origine d’une mauvaise expression de cette protéine.
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUE
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30- Vargas. Implication des protéines d'enveloppe d'hervs dans le développement du placenta: utilisation potentielle comme biomarqueurs de la pré-eclampsie. 2013.
27
LISTE DES SIGLES ET ABREVIATIONS ... vii
LISTE DES TABLEAUX ... viii
PARTIE 1 : SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE ... 3
1-1 Définition Syncytine ... 3
1-2 Différents types de syncytine ... 3
1-2-1 Syncytine-1 ... 3
1-2-2 Syncytine-2 ... 3
1-3 Rôles de la syncytine-2 ... 5
1-3-1 Rôle immunosuppresseur ... 5
1-3-2 Rôle dans la formation du placenta ... 5
1-4 Exosomes ... 6
1-4-1 Définition ... 6
1-4-2 Description des exosomes ... 6
1-4-3 Rôles des exosomes ... 7
1-4-3-1 Rôle dans le système immunitaire et dans la placentation ... 7
PARTIE 2 : MATERIELS ET METHODES ... 9
2-1CADRE D’ETUDES ... 9
2-1-1 CADRE INSTITUTIONNEL ... 9
2-1-2 CADRE TECHNIQUE ... 9
2-1-2-1 HISTORIQUE ... 9
2-1-2-2 PRESENTATION DES INFRASTRUCTURES ET DE L’ORGANISATION ADMINISTRATIVE ... 10
2-1-2-3 LOCALISATION ET PRESENTATION DU LABORATOIRE ... 11
2-1-2-4 Description du laboratoire de recherche du CERPAGE ... 11
2.2 MATERIEL ... 12
2.2.1 Matériel biologique ... 12
2.2.2 Réactifs ... 12
2.2.3 Equipements et autres matériel : ... 12
2.3 METHODES ... 13
2.3.1 Type d’étude ... 13
2.3.2 Echantillonnage ... 13
2.3.3 Phase prospective ... 13
2.3.4 Phase analytique ... 14
2.3.4.1 Précipitation des exosomes ... 14
2.3.4.2 Quantification des exosomes. ... 14
2.3.4.3 Quantification de la syncytine-2 et la protéine CD63 ... 15
2.3.4-Phase poste analytique ... 17
PARTIE 3 : RESULTATS ET COMMENTAIRES ... 18
3-1 RESULTATS ... 18
DISCUSSION ... 20
CONCLUSION ... 22
RECOMMENDATION ... 23
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUE ... 24
TABLE DES MATIERES ... 27 ANNEXES ... a
a
ANNEXES
Annexe: 1Plaque de réaction en ELISA après réaction
Annexe:2Plaque de réaction en ELISA après ajout de TMB
Photo1: spectrophotomètre de marque infinit et imprimante ELISA
Photo 2: centrifugeuse de marque eppendorf 5810 R
Photo 3: bain marie
Annexe 3: Photos des appareils qui ont permis de realiser ce travail