MÉTHODE RAPIDE POUR LA DÉTERMINATION
PAR CHROMATOGRAPHIE EN [PHASE GAZEUSE
DES GLUCIDES DU NECTAR : TECHNIQUE
DE PRÉLÈVEMENT DU NECTAR ET DE PRÉPARATION
DES ÉTHERS TRIMÉTHYLSILYLES EN PRÉSENCE D’EAU
Ein Schnellverfahren
zurBestimmung der Zucker im Nektar mit Hilfe
der Gas Chromatographie : Technik der Nektarentnahme und Herstellen der Trimethylsilyl-Ester in Anwesenheit
vonWasser
Girolamo BOSI
Istituto dí Zoocolture
Università-Perugia (Italie)
SUMMARY
A RAPID METHOD OF DETERMINATION BY GAZ CHROMATOGRAPHY OF NECTAR GLUCIDS
A
rapid
method of determinationby
gaschromatography
of nectarglucids
is described.The nectar is drawn
by centrifugation
at 3 000 t/min
of the flowers incentrifugal
tubes pro- vided with screw on caps and teflonseals, containing
alayer
of about 5 mm ofglass
micros-pheres
and a flock of backwashed cotton.After
partial dehydration
ofsample
in thedrier,
in a vacuum, the authorproceeded
tothe
preparation
of thetrimethylsilylethers
in the samecentrifugal tube, adding
thereagents : pyridine (1 ml), hexamethyldisilazane (0,9 ml)
and trifluoroacetic acid(0,1 ml).
The tube was closed with its cap and
agitated
for a fewminutes;
it was then left to restovernight.
The author obtained the
complete
derivatization of the mono,bi,
andtrisaccharides,
which were
subjected
to gaschromotographic analyses
atprogrammed temperature using
pyrex
glass
columns of2,5
m X 3 mm and OV 17 at 3%
on chromosorb G as astationary
phase.
RÉSUMÉ
On décrit une méthode
rapide
pour la détermination parchromatographie
enphase
gazeuse des
glucides
du nectar.Le nectar est
prélevé
parcentrifugation
à 3 000 t/mn
des fleurs dans des tubes à centri-fuger
à vis bouchés avecgarniture
entéflon,
contenant une couche de 5 mm environ de micros-phères
en verre et un tampon de cotondégraissé.
Après déshydratation partielle
de l’échantillon dans undessicateur,
sousvide,
on a pro- cédé à lapréparation
destrimethylsilyléthers
dans le même tube àcentrifuger,
enajoutant
lesréactifs :
pyridine (1 ml), hexamethyldisilazane (0,9 ml)
et acidetrifluoroacétique (0,1 ml).
On ferme le tube par son bouchon et l’on
agite
pourquelques minutes; après,
on laissereposer
pendant
une nuit.On obtient une dérivatisation
complète
des mono-,bi-,
et trisaccharidesqui
sontanalysés
par
chromatographie
enphase
gazeuse àtempérature programmée,
enemployant
des colonnesen verre pyrex de
2,5
m X 3 mm et OV 17 à 3%
sur chromosorb G commephase
stationnaire.INTRODUCTION
Les difficultés que l’on
rencontre engénéral dans le prélèvement direct du
nectar
des fleurs
etles quantités minimes de matériel que l’on peut obtenir par les systèmes traditionnels représentent des facteurs limitatifs pour l’étude du
nectar.
Les techniques de plus large emploi
ont recoursà des micropipettes par
lesquelles
onaspire les petites gouttes de
nectaradhérentes
auxtissus glandu-
laires. Dans la plupart des espèces végétales, pour obtenir quelques milli-
grammes de matériel il faut
unnombre exceptionnellement élevé de fleurs.
D’ailleurs la sécrétion
est souventsi petite que le problème de la
trouverdevient plus ardu que la recherche
même.Pour
cesraisons, dans
cetInstitut
on aessayé plusieurs fois de
mettre aupoint des techniques moins complexes.
Dans des recherches précédentes
on a eu recours aulavage par l’eau d’un certain nombre de fleurs (de 10 à 20),
aufiltrage
etensuite à l’évaporation des
extraits
sousvide, à basse température
surévaporateur
tournant.Ce mode opératoire facilitait considérablement le prélèvement du nectar, mais l’évapo-
ration de l’eau restait
unproblème
nonseulement très ennuyeux mais aussi très délicat, parce que l’on devait travailler à basse température pour
nepas modifier la
naturechimique des glucides mêmes du
nectar.Après de nombreux essais
on amis
aupoint
unetechnique simple
etrapide
que l’on décrit ci-après.
MATÉRIEL
ETMÉTHODE
Prélèvement du nectar
1)
tubes àcentrifuger
à vis bouchés de 16 mm X 100 avecgarniture
entéflon;
2) microsphères
de verre d’un diamètre de 2 mmenviron;
3) centrifugeuse
de laboratoire(vitesse
3 000 t/mn).
On
dépose
dans le tube lessphères
de verrejusqu’à
une hauteur de 5 mmenviron;
onsuperpose un tampon de coton
dégraissé
et l’on étend délicatement lesfleurs,
sipossible
retour-nées.
Lorsqu’on
arempli le tube, l’on centrifuge
à 3 000t !mn pendant
5mn; le
nectar sedépose
au fond.
On enlève les fleurs avec une
pince
fine,puis
le tampon de cotonqui, pendant
samontée,
traînera le
pollen
et lesfragments végétaux
adhérents auxparois
du tube. Le nectar extrait est enpartie déshydraté,
en legardant
sous vidependant
une nuit en dessicateur(sur CaCl&dquo;
Drierite ou un autre
déshydratant).
Préparation
des étherstriméthylsilyles
La
technique
traditionnellementemployée
est celle bien connue de SWEELEYet al.(1963), adoptée
par POURTALLIER(1967)
pour les miels et par d’autres auteurs pour les miels et les nectars. Elles’applique
à un échantillonparfaitement anhydre,
en utilisant comme réactifsla
pyridine, l’hexaméthyldisilazane
et letriméthylchlorosilane.
A la
technique
susdite on apréféré
celle de dérivatisationproposée
par K.-M. BaoasT et C.-E. LOTTJr.(1966), applicable
à des échantillonsqui
contiennentjusqu’à
40 mg d’eau.Réactifs :
1) Pyridine
pure pouranalyse,
redistillée sur potasse;2) Hexaméthyldisilazane
pur pouranalyse;
’
3)
Acidetrifluoracétique
pur pouranalyse.
Les modalités d’exécution sont les suivantes :
a)
10-20 mg de nectar(maximum
50mg), partiellement déshydraté,
sont dissous dans 1 ml depyridine,
que l’on introduit dans le tubequi
contient le nectar et lessphères
de verre. Si la
quantité
de nectar estsupérieure
à 50 mg on utilise unequantité
pro-portionnellement plus grande
depyridine;
on transfère ensuite 1 ml de la solution dansun autre
tube;
b)
Onajoute 0,9
ml dehexamethyldisilazane;
c)
Onajoute
0,1 ml d’acidetrifluoracétique;
d)
On fermehermétiquement
le tube à vis bouché et onagite énergiquement pendant
1 mn
puis
on laisse reposer. Au bout de 15 mn on vérifie lacomplète
dérivatisation desmono- et
disaccharides;
celle des trisaccharides demande une durée de 5 h. Il sera donc convenable de laisser reposer toute la nuit. On obtient une solutionparfaitement limpide,
sansprécipités,
que l’on peutprélever
par lamicroseringue
etinjecter.
Cetteméthode évite la corrosion et l’obstruction des
aiguilles
desseringues
cequi
est unavantage non
négligeable
compte tenu de leur coût élevé.Analyse
parchromatographie
enphase
gazeuseLes
analyses
ont été exécutées surgaz-chromatographe
Carlo Erba mod.GI,
à double colonne et double détecteur à ionisation de flamme et programmateur linéaire detempérature.
Colonnes en verre pyrex de
2,5
m X 3 mm de diamètre intérieur.Phase stationnaire : OV 17 à 3
%
sur chromosorb G lavé aux acides et silanisé.Température
de la colonne :programmée
de 190° C à 295°C,
avec uneprogression
de 3° Cpar minute.
Température
du détecteur et del’injecteur :
290° C.Gaz de transport : azote à la
pression
de2,5 kg/cm 2
à 190° C.Enregistreur : Speedomax W,
5 mV fondéchelle,
à la vitesse de 12pouces !h.
Quantité injectée : 0,5
- 2fil
avec une atténuation de 100 X 4 ou tout autre convenable.La méthode a été
expérimentée
surquelques
centaines d’échantillons pour une rechercheencore en cours d’exécution sur les
glucides
des nectars.Reproductivité
Un
mélange
standard de mono-, bi- et trisaccharides(v. chromatogramme 1)
additionnéd’une
quantité
d’eauégale
à 20%
de sonpoids,
a été soumis à silanisation etanalysé
au gaz-chromatographe après
5h,
20 h, 5jours
et 10jours,
avec des résultatsparfaitement
compa- rables.Calcul des pourcentages
relatifs
Evaluation
quantitative
Le calcul des pourcentages relatifs des différents composants d’un
mélange
peut être effectué par la formule suivante :où
h!;h, ... hn
sont les hauteurs dechaque pic
etfi ;f,... f n
sont les facteurs de correction des hauteursrespectives.
Les
f sont
calculésexpérimentalement
sur unchromatogramme
d’unmélange
standarddes différents sucres à
égale concentration,
en faisant le rapport entre la hauteur d’unpic
etcelle de tous les autres
pics.
Exemple :
sih w , A n , h c
sont les hauteurs despics
d’unmélange
des composantsA, B, C,
à
égale concentration,
les facteurs de correction deh A ,
hBeth c
serontrespectivement :
Lorsqu’on
a vérifié la cohérence deréponse
du détecteur pour lesquantités
d’échantillonsinjectées,
si l’on maintientrigoureusement
constantes les conditions detravail,
même les facteurs de correction restentinchangés.
Reçu
pourpublication
en Novembre 1972.Eingegangen
im November 1972.ZUSAMMENFASSUNG
Ein Schnellverfahren zur
Analyse
der verschiedenen Zucker im Nektar mittels der Gas-Chromatographie
wird beschrieben. DieUntersuchungen
erstrecken sich auffolgende
Punkte :a)
Technik der Entnahme des Blütennektars.In ein
Zentrifugenröhrchen
von 10 cmLänge
und 16 mm Durchmesser mit Schraub- verschluss undTeflondichtung gibt
man etwa 5 mm hochMikroglaskügelchen
und einenentfetteten Wattebausch. Dann füllt man das Röhrchen lose mit den Blüten und
zentrifugiert
5 Min
lang
bei 3 000 U/min.
Der Nektar sammelt sich hierauf in kleinenTropfen
am Grundedes Röhrchens.
b) Herstellungsmethode
derTrimethylsilyl-Ester
in Anwesenheit von Wasser.Nach Entnahme der Blüten und der Watte lässt man das Röhrchen mit dem Nektar und den
Glaskügelchen
über Nacht im Vakuum imTrockenapparat
stehen.Die Derivation des teilweise
dehydrierten
Nektarserfolgt
hierauf imgleichen Zentrifugen-
röhrchen unter
Zugabe folgender Reagenzien : Pyridin (1 ml), Hexamethyldisilazan (0,9 ml)
und
Trifluor-Essigsäure (0,1 ml).
Nachdem das Röhrchen durch einen
Stopfen
verschlossenwurde,
schüttelt man eseinige
Minuten
lang heftig
und lässt es danach wieder über Nacht ruhen. Soerfolgt
die vollkommeneTrennung
derMono-,
Di- undTrisaccharide,
die man sofort durchGas-Chromatographie
be-stimmen kann.
c) Gas-Chromatographie
beiprogrammierter Temperatur.
Es wurde ein
Gas-Chromatograph
mitdoppelter
Säule ausPyrexglas
von2,5
m X 3 mm unddoppeltem
Flammen-Ionisations-Detektor benutzt.Stationäre Phase 3
%
OV 17 auf Chromosorb G.Injizierte Menge 0,5
- 2 ul bei einerVerdünnung
von 100 : 4.Die
Untersuchung
erstreckte sich aufChromatogramme
der Zucker in den Nektareneiniger
Pflanzenarten sowie einerStandardmischung
ausMono-,
Di- und Trisacchariden.Ausser den Monosacchariden Fruktose und
Glukose,
dem Disaccharid Saccharose wurdengelegentlich
die Trisaccharide Raffinose und Melezitosefestgestellt.
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SW
EELEY