CARACTÉRISATION DES RÉSIDUS
DES FORMULATIONS MICROENCAPSULÉES
DE PARATHION MÉTHYL.
NOUVELLE MÉTHODE
APPLICABLE AUX VÉGÉTAUX TRAITÉS AINSI QU’AUX ABEILLES ET A LEURS PRODUITS
Y. LOUBLIER*
LN.R.A.-C.N.R.S.,
Laboratoire deNeurobiologie comparée
des Invertébrés .
F 91440 Bures-sur-Yvelte J. LOUVEAUX
1, rue de la Guyonnerie, F 91440 Bures-sur-Yvette
RÉSUMÉ
La
technique
demicroencapsulation
despesticides
pose desproblèmes particuliers
dans le domaine de laprotection
des abeilles. Il peut êtreutile,
aulaboratoire,
de reconnaître laprésence
demicrocapsules
dans les matériaux soumis àl’analyse
etqui
ont faitl’objet
deprélèvements
au rucher. Pour faciliter la mise en évidence desmicrocapsules
sur les abeilles ou dans lesproduits qu’elles
récoltent ou encore sur lesvégétaux traités,
une méthode nouvelle a été mise aupoint qui
permet d’éliminer laplus grande partie
du supportvégétal
sans altérer lesmicrocapsules qui
résistent bien au traitementpréconisé
àl’hypochlorite
de sodium et à l’acidesulfurique.
Pour cetravail,
deux types demicroencapsulation
deparathion méthyl
ont été utilisés : lePenncap
MOet le Fulkil©. Notons
également
quel’application
du traitement à un herbicidemicroencapsulé (Capsolane)
a donné toute satisfaction. Il semble doncpossible
del’appliquer
à d’autres formulationsmicroencapsulées.
Lespréparations microscopiques
obtenues par cette méthoderapide
sontbeaucoup plus
lisibles que cellesqu’on
obtient sans traitement.INTRODUCTION
Au
coursdes dix dernières années la technique de microencapsulation
des pesticides
asensiblement modifié les données du problème de la protection
des abeilles
contreles effets
nonintentionnels de certains traitements phyto-
sanitaires. Du fait de leurs propriétés physiques
etde leurs dimensions moyennes, les microcapsules déposées
surles végétaux
se trouventaisément piégées par la
pilosité des abeilles et incorporées éventuellement au pollen qu’elles récoltent.
pollen qu’elles récoltent.
°" Adresse actuelle :
I.N.R.A.,
Station deZoologie
etApidologie,
Centre de Recherchesagronomiques,
F 84140 Montfavet.En moyenne, le diamètre des microcapsules
sesitue
auxenvirons de 30 à 50 [t m, les valeurs extrêmes étant de 10
et90 [i m. Le pollen contaminé constitue la
cause
principale des mortalités constatées par les apiculteurs.
La littérature relative
auxincidences apicoles de l’utilisation des pesticides microencapsulés
afait l’objet d’une
revuegénérale par A. S TONER et al. (1982).
La publication plus récente de E.L .A T xiNS
etD. K ELLUM (1984) n’apporte pas d’éléments
nouveaux en cequi
concernele fond du problème mais permet, par contre, de poser
encore unefois la question des moyens utilisables
aulaboratoire pour
mettre enévidence les microcapsules dans le pollen récolté par les abeilles ainsi que dans les abeilles
mortes ouvivantes, dans le nectar, le miel
oula cire
susceptibles d’avoir été contaminés. En effet, il peut être important dans certains
cas
de démontrer qu’une mortalité d’abeilles
estdue à
unpesticide microencapsulé
et non
à la formulation classique de la matière active. Par ailleurs, la possibilité
de
mettre enévidence
etde dénombrer les microcapsules
endes points précis de
leur cheminement puis de leur accumulation constitue
unavantage précieux pour la recherche
surles mécanismes de la contamination de l’environnement apicole par
les pesticides.
Jusqu’ici l’attention des chercheurs s’est fixée
surles formulations micro-
encapsulées de parathion méthyl
etplus particulièrement sur la spécialité Penncap M ® de la firme Pennwalt. B. Ross
et J. H ARVEY (1981)
ont exposé
une
méthode rapide, peu coûteuse
etquantitative pour l’extraction
etl’analyse du Penncap M ® à partir des abeilles, de la cire
etdu pollen. L’intérêt de
cetteméthode
est d’avoir
untrès bon rendement puisqu’il
estvoisin de 100 % sauf pour le miel
où il
estde l’ordre de 91 %. Elle repose
surla chromatographie liquide-gaz ;
elle permet d’atteindre la précision du ppb de parathion méthyl. Toutefois, elle n’est
pas utilisable pour caractériser la présence des microcapsules.
.
La première tentative de détection des microcapsules par voie chimique
estcelle de G.L. B LACKMER
etR.H. R EYNOLDS (1977) qui
nesemble pas avoir
eude suites. Une
autreméthode
aété proposée par B. Hnrrt!rY et al. (1983) ; elle
repose
surle dosage de l’aniline produite dans la dégradation par pyrolyse de la
matière constituant les microcapsules
etqui
est unpolymère voisin du nylon.
Cette méthode utilise la chromatographie
etla spectrométrie de
masse.Elle n’a été
utilisée que
surdes échantillons de pollen
enpelotes.
.
Une autre voie
aété proposée par R. H OOPINGARNER
etal. (1981) qui exposent
une
méthode visuelle de mise
enévidence des microcapsules. Cette méthode
aété testée
aulaboratoire
surdes abeilles nourries
avec unsirop artificiellement contaminé
avec
des concentrations croissantes de Penncap M © . Elle permet de
retrouver sousle microscope les capsules accumulées dans le tube digestif. Il
nesemble pas que
cette
méthode ait été développée ni qu’elle ait été utilisée
surdes abeilles prélevées
dans les conditions de la pratique.
En 1984, E.L. A TK irrs
etD. K ELLUM
ontmis
aupoint
ettesté
uneméthode
de détection visuelle des microcapsules dans le but d’établir
unecorrélation
entrele nombre de
cescapsules
etla quantité de matière active présente dans 1’échant:llon traité, miel
oupollen. On procède comme suit : 10 g de la matière à analyser
sont
dilués dans 20 ml d’eau ;
on centrifuge à 3 500
tours minute pendant 3 minutes ;
on
décante
et on recommencel’opération de façon à obtenir
unculot de centri-
fugation qui contient essentiellement des grains de pollen
etles microcapsules
éventuellement présentes. On colore
aubleu de méthylène
et onprépare
une sus-pension homogène à 1 % du culot de centrifugation. Sous le microscope
ondénombre les grains de pollen
etles capsules qui, elles,
neprennent pas la coloration.
A raison de 1 [ tl de la suspension par préparation microscopique on examine
5 champs visuels
augrossissement de
X200.
Les
auteurs ontétalonné la méthode à partir d’un matériel artificiellement contaminé
ettrouvé
unebonne corrélation
entrele nombre des capsules introduites
etle nombre de capsules retrouvées. La sensibilité de la méthode
estde l’ordre de 3 ppb.
La détection des microcapsules dans des échantillons de pollen provenant de
prélèvements réalisés à la suite de graves intoxications d’abeilles en 1978
et 1980
a
donné des résultats
assezsatisfaisants lorsqu’on les compare à
ceuxdes analyses chimiques effectuées
surces mêmes échantillons.
La méthode de E.L. A TKINS
etD. K ELLUM apporte
uneréponse partielle à la question posée. On peut lui reprocher d’exiger un travail long
et fastidieux. Il faut examiner
au moins 50 à 100 préparations microscopiques pour
retrouver un
nombre de microcapsules correspondant à
une teneur en parathion méthyl de
5 ppm: Si, par ailleurs,
onconsidère que la méthode de B. H ANNY
etal. exige
l’utilisation d’un spectrographe de masse,
ondoit admettre que la recherche d’une méthode nouvelle de détection visuelle des microcapsules, plus simple
etd’un emploi plus général
estjustifiée. C’est
cetteméthode que
nousexposerons à
présent.
MÉTHODE 1. Principe
Le
principe
de la méthode est celui de la destruction paroxydation
du matérielvégétal supposé
porteur demicrocapsules
tout en conservant intactes ces dernières et en permettant leurconcentration
dans un volume minimum ainsi que leur visualisation sous lemicroscope.
L’oxydation
du matérielvégétal
est obtenue par l’action à chaud del’hypochlorite
de sodium(NaOCI) qui détruit,
enparticulier,
l’exine desgrains
depollen.
Lecytoplasme
non détruit par NaOCI est éliminé par l’acidesulfurique (H z SO,).
On a vérifié que ces traitements ne détruisent ni les
microcapsules
dePenncap
Me ni celles IdéFulki1 @
bienqu’ils
en altèrentlégèrement
la forme.(Fig.
1 et2).
La méthode est directement
applicable
auxvégétaux traités,
aupollen
enpelotes
ou stocké dans les rayons de la ruche ainsiqu’au
nectar et au miel. Elle convient bien à la recherche desmicrocapsules
à la surface du corps des abeilles.Remarque :
Il convient de ne pas
dépasser
latempérature
de 80 °C au cours desopérations.
Enparticulier,
il est nécessaire de tenir compte dudégagement
de chaleur lié à l’utilisation de l’acidesulfurique.
2. Matériel et
produits
- Bécher de 300 ml.
-
Agitateur magnétique
chauffant.- Tamis à mailles de
0,4
et 0,1 mm.-
Centrifugeuse
et tubes à fondconique
de 100 ml et 25 ml. On a intérêt à utiliser unappareil
permettant de traiter à
chaque
fois un volume suffisant deliquide.
-
Hypochlorite
de sodium à 24° chlorés(NaOCI).
- Acide
sulfurique
pur et à 50 %(H._SO,).
- Alcool
éthylique
à 95°.- Solution
alcoolique
de vert deméthyl
à0,1
%.- Eau distillée ou de
pureté équivalente.
- Thermomètres : + 45 &dquo;C + 100 °C
(1/10) ;
- 10 °C + 60 °C(1/10).
On a utilisé pour la mise au
point
de la méthode et pour en tester la valeur lesprélèvements
effectués à l’occasion d’uneexpérimentation
(’!> ayant pourobjet
d’évaluer ledanger
pour les abeilles de traitements enpleine
floraison sur colza avecPenncap
M@ et Fulkile. Ces deuxpréparations
ont pour matière active leparathion méthyl
mais lesmicrocapsules
sont de nature et de dimensions différentes. On a pudisposer
d’abeilles provenant des ruchers d’observation touchés par lestraitements,
depollen
enpelotes
et en rayons de même provenance et d’inflorescences de colza traité.La méthode
également appliquée
sur un herbicidemicroencapsulé (Capsolane)
permet de mettre en évidence lesmicrocapsules
sans les altérer defaçon importante.
3. Recherche des
microcapsules
sur les abeilles(Fig.
3 et4)
Modeopératoire :
.’1)
Dix grammes d’abeilles(soit
environ 100abeilles)
sont mis dans un bécher de 300 mlavec 90 ml de NaOCI. On porte à 80 °C environ sous
agitation
constantependant
10 minutes. Cetteopération
a pour effet de détacher du corps des abeilles toutes lesparticules qui
y adhèrent et, enparticulier,
lesgrains
depollen.
Le temps et latempérature
ont été choisis de tellefaçon
que le corps des abeilles reste entier et que le contenu de l’abdomen ne serépande
pas dans leliquide.
2)
Filtrer sur le tamis à mailles de0,4
mm le contenu du bécher et laver 4 à 5 fois parjets
d’eau distillée les corps des abeilles en prenant soin de les retourner entrechaque lavage.
3) Centrifuger
dans des tubes de 100 ml à 700 g(environ
2 500 à 3 000 t/mn pour lesappareils courants) pendant
7 minutes et réunir en un seul les culots decentrifugation.
(
*
) Campagne
1983-1984.Expérimentation
ACTA-INRA-ITAPI.(ACTA, 1984).
On aégalement
utilisé unéchantillonnage
d’abeilles mortes à la suite d’une intoxication parparathion méthyl
encapsulé
en 1982. Echantillons conservés aucongélateur jusqu’à l’analyse.
4) Reprendre
par l’eau distillée le culot decentrifugation
etcentrifuger
à nouveau. Eliminer le surnageant en retournant le tube et recommencerl’opération
une seconde fois. Au cours de cesopérations
amener le culot decentrifugation
dans un tube de 25 ml à fondconique.
5)
Introduire 5 ml d’acidesulfurique
à 50 %. Mettre le culot ensuspension
etagiter
à chaud(60 °C) pendant
5 minutes environjusqu’à disparition
du trouble blanchâtre occasionné par lesmasses
cytoplasmiques.
6)
Introduire le tube dans un bain froid(18-20 °C environ)
et diluer leliquide
enajoutant
de l’eau distillée.Centrifuger
etrejeter
le surnageant.Répéter l’opération
defaçon
à éliminer l’acide dont la présenceempêcherait
la coloration.7)
Colorer le culot par introduction de 5 ml de solutionalcoolique
de vert deméthyl. Agiter.
Laisser
agir pendant
5 minutes.Centrifuger
etrejeter
le surnageant.La coloration a pour seul
objet
de mettre en évidence les restes d’exinequi pourraient
subsister defaçon
à ne pas les confondre avec desmicrocapsules, lesquelles
ne prennent pas la coloration.8)
Selonqu’il s’agit
d’un examenqualitatif
ou d’une étudequantitative
onopè: era
comme suit :8.1)
L’examenqualitatif
a pourobjet
de vérifier laprésence
ou l’absence demicrocapsules
sur le corps des abeilles.
Diluer le culot de
centrifugation
dansquelques w l
d’eau distillée. Prélever environ 10gl
de lasuspension
au moyen d’unepipette
Pasteur ou d’unepipette
àpointes
monoservices.Déposer
leliquide
sur lame et laisser sécher.Déposer
une goutte deglycérine gélatinée
deKayser
et recouvrir d’une lamelle 12 X 12 mm. Faire au moins deux ou troispréparations
defaçon
à utiliser laplus grande partie
du culot. Ceci estimportant
dans le cas où lesmicrocapsules
sont très peu nombreuses.L’examen
microscopique
despréparations
se fait augrossissement
X 320(objectif
40 et oculaire 8 àgrand champ).
On peut utiliser le fondclair,
le fond noir ou le contraste dephase,
auchoix,
selon le matériel dont ondispose
et selon laqualité
despréparations. Balayer
la totalité de lapréparation
pour la recherche desmicrocapsules.
Leurfréquence
peut êtreexprimée
par une note selon une conventionpréalablement
établie.8.2)
Une étudequantitative
a pour intérêt de permettre une évaluationprécise
de laquantité
depesticide portée
par une abeille et, parconséquent,
d’établir defaçon
claire la relation entre le traitement et les mortalités d’abeilles.A
partir
du culot decentrifugation,
on peutenvisager d’opérer
selon l’une des deux méthodes del’analyse pollinique quantitative
décrites dans les « Méthodes de tamélisso-palynalogie
» (J. LOUVEAUX etal.,
1970,1978).
Lesmicrocapsules
peuvent être assimilées à desgrains
depollen
et dénombrées de la même
façon.
4. Recherche des
mierocapsules
sur lesvégétaux
traités(Fig.
5 et6)
La méthode a été mise au
point
et testée sur fleurs de colza. Elle peut êtreadaptée
à d’autresvégétaux
sans modificationsimportantes.
Mode
opératoire :
.’1)
Prélever 10 fleurs ouvertes par échantillon. Les porter dans un bécher de 300 ml avec 20 ml de NAOCI. Maintenir à 80 °C environ sousagitation
constantejusqu’à
ce que la totalité des tissusvégétaux
soit devenue transparente, c’est-à-dirependant
20 minutes environ.2,
3 et4)
Mêmeprocédure
queprécédemment
sur abeilles.5) Reprendre
le culot dans l’alcooléthylique
à 95&dquo; defaçon
à ledéshydrater. Centrifuger.
Dilution dans l’eau.
Les
microcapsules
ne sont pas altérées mais fournissent uneimage plus
claire.The
microcapsules
are not altered but theimage
is clearer.On peut observer des
microcapsules
dePenncap
Me de taille variable(flèches).
Une
microcapsule
est visible(flèche).
Le traitement n’a pas totalement éliminé lesparticules
minérales mais il a faitdisparaître
entièrement lesgrains
depollen.
A
microcapsule
is visible(arrow).
The treatment has not eliminated mineralparticles totally,
butpollen grains
have beencompletely
removed.On y reconnaît de nombreux
fragments végétaux,
desgrains
depollen
et unemicrocapsule
dePenncap
M©(flèche).
They
were collected oneday
after treatment with « Penncap M » and washedwith
waterplus
triton(2 %).
A number ofvegetable fragments, pollen grains
and a« Penncap
M» microcapsule
can be seen
(arrow).
On y reconnaît
quelques
raresfragments végétaux
et unemicrocapsule
dePenncap
M©A few
fragments
ofvegetable
material can be seen and a« Penncap
M» microcapsule
isclearly identified.
Eliminer le surnageant et laisser
égoutter
le tubequelques
instants en le retournant sur unpapier
filtre.6)
Introduire 5 ml d’acidesulfurique
pur et laisseragir pendant
10 minutes en remuant de temps en temps.7) Compléter
le contenu du tube par de l’acidesulfurique
à 50 % en ayantsoin,
aupréalable,
del’immerger
dans un bain d’eau froide(18-20 °C environ).
8) Centrifuger.
Eliminer le surnageant. Filtrer sur un tamis à maille de0,1
mm et rincer à l’eau distillée.Centrifuger.
Pour la suite des
opérations procéder
commeprécédemment
sur abeilles(§
6 à 8).5. Recherche des
microcapsules
dans lepollen
enpelotes
ou extrait des cellulesLe
pollen
enpelotes provient
des récoltes obtenues à la trappe àpollen.
Lepollen
extrait des cellules estprélevé
directement dans un rayon de la ruche au moyen d’unepetite spatule.
Les
pollens
soumis àl’analyse
doivent être identifiés avec soin selon les méthodes habituelles de lamélisso pal’ynologie (J.
LouvEAux etal., 1970, 1978).
Mode
opératoire :
.’1)
30 mg depollen
enpelotes
ou le contenu de 5 cellules sont mis dans un tube àcentrifugation
de 25 ml et dilués dans 5 ml d’acidesulfurique
à 50 % en veillant à bien dissocier les massespolliniques. Lorsque
lasuspension
esthomogène,
porter à 80 °C en remuant de temps en tempspendant
10 minutes(pollen
enpelotes)
ou 30 minutes(pollen
extrait descellules).
2)
Mettre le tube dans un bain d’eau froide(18-20 °C environ),
et étendre d’eau distillée.Centrifuger. Rejeter
Ie surnageant.Reprendre
à l’eau distillée etcentrifuger
à nouveaujusqu’à
l’obtention d’un surnageant clair.3)
Mettre ensuspension
le culot dans 5 ml de NaOClpendant
10 minutes à chaud(60 °C environ)
et enagitant
constamment.4) Pour la suite des
opérations,
se reporter aux§ 6,
7 et 8 du modeopératoire
de la recherche desmicrocapsules
sur abeilles.DISCUSSION
Par rapport
auxméthodes déjà décrites
etqui
ontpour objet la mise
enévidence des microcapsules de pesticides dans les prélèvements de matériel végétal
ou
animal supposé contaminé, celle que
nous avonsmise
aupoint
ettestée
surdes échantillons représentatifs de situations
«naturelles apporte
unprogrès
sensible
surplusieurs points.
La méthode décrite présente l’avantage d’être applicable à
tousles types de
prélèvements possibles dans le cadre des accidents impliquant les pesticides micro- encapsulés
etdont les victimes
sontles abeilles. La destruction ménagée de la
fraction du matériel qui pourrait rendre difficile, sinon impossible, l’observation
microscopique constitue un progrès par rapport à l’observation directe telle qu’elle
est
proposée par E.L. A TKI NS et D. KELLUM
et qui exige la confection
et l’examen
d’un très grand nombre de préparations microscopiques encombrées de grains
de pollen et de débris plus
ou moins identifiables. Les opérations de purification et
de centrifugation peuvent être conduites
enséries,
cequi contribue
encoreà réduire
le temps nécessaire pour
uneanalyse.
Combinée
avecla recherche du pesticide par voie chimique, la méthode apporte
une
réponse plus complète à la question de savoir si le pesticide incriminé est ou
non sous
forme microencapsulée.
Le dénombrement des capsules associé à l’analyse chimique permettra d’affiner les résultats. Cependant,
unimportant travail
resteà accomplir pour préciser les
corrélations
entre cesdifférents paramètres. Dans les échantillons qui
nous ontservi
pour le présent travail
nous avonspu
constaterla parfaite conservation des
microcapsules
surles abeilles
mortes en1982, conservées
aucongélateur
etexaminées deux
ansplus tard,
en1984. Cela
nesignifie
aucunementque la matière active n’a pas subi de dégradation au cours du temps. L’utilisation du dénom- brement des capsules
en vue du calcul de la dose de pesticide reçue
ne peut donc être envisagée que
comme un complément de l’analyse chimique, mais
un complé-
ment
très utile.
Reça
pourpublication
en décembre 1985.Accepté
pourpublication
enfévrier
1986.SUMMARY
CHARACTERIZATION OF RESIDUES OF MICROENCAPSULATED METHYLPARATHION.
A NEW METHOD THAT CAN BE APPLIED TO TREATED PLANTS AS WELL AS TO HONEYBEES AND THEIR PRODUCTS
A method for
destroying plant
tissues(petals, sepals,
stamens,pollen) allowing microcapsule preservation
isgiven.
It can beapplied
toblossoms, pollen
loads orpollen
stored incells, honey
and bee bodies.The utilization of NAOCI at
80 °C,
which allows the elimination of almost allplants tissues,
and the effect ofH,50&dquo;
which dissolvespollen grain cytoplasm, yields microscopic
slidescontaining
almost solely themicrocapsules (fig.
5 and6).
Microcapsule
detectionfrom
beebodies
10 g of bees are put into 90 ml of NaOCI and
kept
at 80 °C with constantshaking
for 10 min. The mixture is filtered on a 0.4 mm sieve and washed several timesby centrifugation
in distilled water. Onto the residue ispoured
5 ml ofH,SO, (50 %).
This mixture is shaken until thedisappearance
of the whiteturbiditiy
due to thecytoplasm.
Severalcentrifugations
in distilled water are necessary beforestaining
in a 0.1 %methyl
green solution. A part of the residue isplaced
on amicroscope
slideaccording
to the methods ofmelissopalynology (J.
LOUVEAux etal.,
1970, 1978).
Microcapsule detection from
treatedplants
10 blossoms are put into 20 ml of NaOCI and
kept
at 80 °C with constantshaking
until the tissues become transparent.They
are filtered on a 0.4 mn sieve andcentrifuged
in distilled water.To the residue is added 5 ml of
H 2 S0 4’
This mixture is shaken for 10 min. It is filteredagain
ona 0.1 mm sieve and washed in water. After
staining,
amicroscope
slide is made.Detection
of microcapsules from pollen
loads andpollen
stored in cells30 mg
pollen
loads or the contents of 5 cells are put in a 25 mlcentrifuge
tube with 5 ml ofH z SO, (50 %).
The tubes are shaken to ensure agood particle dispersion
beforeelevating
the temperature to 80 °C for 10 min for thepollen
loads and 30 min for the cells. The residue iscentrifuged and
washed until a clear supernatant appears. Then the tube is filled with 5 ml of NaOCI andplaced
in a warm water-bath for 10 min. This mixture iscentrifuged
and washed several times beforestaining
andplacing
on amicroscope
slide.This method has had a succesful trial on
samples
from anexperiment
with common treatments(bees, pollen
in cells andblossoms)
and from bees which were dead aftermicroencapsulated pesticide application
two years beforeperfecting
the method.Combined with chemical
detection,
thisrapid method,
both in the treatment itself and the examination ofslides,
shallbring
apositive
answer as to the use ofmicroencapsulated products.
ZUSAMMENFASSUNG
CHARAKTERISIERUNG VON METHYLPARATHION IN FORM VON MIKROKAPSELN.
EINE NEUE
METHODE,
ANWENDBAR SOWOHL FÜR BEHANDELTE PFLANZEN WIE FÜR BIENEN UND IHRE PRODUKTEEs wurde eine Methode zur
Aufbereitung
von Blütenteilen(Blüten-
undKelchblätter,
Staub-gefäße, Pollen)
beigleichzeitiger Erhaltung
derMikrokapseln
untersucht. Sie ist unmittelbar für behandeltePflanzen,
Pollen in Höschen odergespeichert
inZellen,
fürHonig
und für Bienen anwendbar.Die
Anwendung
von heißem NaOCI(80 °C),
die zur fastvölligen Entfernung
der Pflanzen-partikel führt, gefolgt
von einerZerstörung
desZytaplasmas
mitH . _SO&dquo; ergibt
am Ende der Prozedur einenmikroskopischen Ausstrich,
der fast ausschließlich ausMikrokapseln
besteht(Fig.
5 und6).
Feststellung
vonMikrokapseln
amBienenkörper
10 g Bienen werden in 90 ml Na0C1 bei 80 °C 10 min.
lang
in dauernderBewegung gehalten.
Nach
Filtrierung (Porengröße 0,4 mm)
wird der Rückstand mehrmals mit destilliertem Wassergewaschen
und filtriert und dann mit 5 ml einer 50 %H,SO,
behandelt bis die durchZytoplasma
verursachte weißlicheTrübung
verschwunden ist. Dann wird mehrmals mit dest. Wassergewaschen
undzentrifugiert
und anschließend mit0,1
%Methylgrün gefärbt.
Ein Teil des Rückstandes wirdentsprechend
denempfohlenen
Methoden derMelissopalynologie
(Louvenux et al.,1970, 1978)
zu einemmikroskopischen Präparat
verarbeitet.Feststellung
vonMikrokapseln auf
behandeltenPflanzen
10 offene Blüten werden in 20 ml NaOCl bei 80 °C so
lange gerührt,
bis das Gewebe transparent ist.Filtrierung
mit0,4
mm Porenweite und mehrfachesZentrifugieren
in dest. Wasser.Auflösung
des Rückstandes in 5 ml 50 %H!SO!
für 10 min.Zentrifugieren
und Filtrieren des Rückstandes durch einen 0,1 mmFilter,
dann mehrfaches Auswaschen in destilliertem Wasser, Färben und Montieren auf einemObjektträger.
Untersuchung
vonMikrokapseln
in Pollenhöschen und in Pollen ausVorratszellen
30 mg Pollenhöschen oder Inhalt von 5 Zellen wird zusammen mit 5 mlH..SO, (50 %)
in 25 mlZentrifugengläser gegeben.
Die Partikel müssen gut zerteiltsein,
bevor dieTemperatur
für 10 min(bei Höschen)
oder für 30 min(bei
Pollen ausZellen)
auf 80 °C erhöht wird.Zentrifugieren
und Auswaschen des Sediments bis der überstand klar wird. Einfülllen von 5 ml Na0C1 und Einstellen in ein warmes Wasserbad für 10 min.Zentrifugieren, mehrmaliges Auswaschen,
dann Färben undAnfertigung
einesmikroskopischen Präparates.
Diese Methode wurde mit
Erfolg
an Proben von den üblichenBehandlungsverfahren (Bienen,
Pollen in Zellen undBlüten)
und vonBienen,
die zwei Jahre vorAusarbeitung
dieser Methode nach Besprühen mit einem Pestizid inMikrokapseln getötet
worden waren,erprobt.
Zusammen mit einer chemischenAnalyse
des Pestizids kann diese Schnellmethode sowohl bei der Behandlung selbst wie bei einerUntersuchung
vonPräparaten Aufklärung
über den Einsatz von Substanzen inMikrokapseln geben.
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TONER