Correction juin 2004
Pour répondre à ce sujet, il fallait connaître un peu de la biologie de Claviceps purpurea.
- Le criblage de la banque d'EST pouvait se faire de différentes manières: gènes ressemblant à un autre déjà identifié dans un processus infectieux, sélection de gènes spécifiquement exprimés pendant le processus infectieux (par criblage différentiel de la banque avec des cDNA radioactifs provenant du champignon pendant l'infection ou cultivé sur boîte de Petri)... (2 points)
- On peut montrer que le gène CPFT1 code pour un facteur de transcription uniquement si on montre qu'il se fixe sur un promoteur in vivo ou in vivo et que quand il est fixé, il active (éventuellement inhibe) la transcription. C'est une expérience complexe (surtout de montrer l'activation de la transcription in vitro et la fixation in vivo). On peut donc faire les expériences suivantes :
- montrer la fixation in vitro par retard sur gel ou empreinte à la DNAse1 de la protéine purifiée. (2 points)
- effectuer la délétion du gène à l'aide d'un fragment d'ADN : les régions flanquant le gène CPTF1 sont associées avec un marqueur de sélection (chez les champignons filamenteux généralement un marqueur de résistance à un antibiotique), le fragment utilisé pour transformer Claviceps et les transformants résistants sont sélectionnés. Il faut ensuite vérifier par Southern Blot que l'ADN exogène a bien remplacé le gène CPTF1. (3 points)
- Mesurer par Northern Blot ou RT-PCR le taux de messager du gène cpcat1: celui-ci doit diminuer aussi bien en condition de croissance sur boîte (expression basale) que en présence d'un stress oxydant (présence de H202 par exemple). Notez que l'on peut aussi mesurer l'activité catalase pour s'assurer qu'un autre gène codant une catalase ne prend pas la relève si l'expression de cpcat1 est réduite. (2 points)
- Le mutant et le sauvage sont ensuite inoculés à du seigle et on constate une infection bien meilleure avec la souche sauvage (CMI inférieure par exemple) et l'absence de H2O2 au point d'infection chez le sauvage et sa présence chez le mutant grâce au dosage disponible. (1 point)
Les conclusions que l'on peut tirer:
- Les radicaux libres tels que le H2O2 interviennent dans la défense des plantes contre les champignons et probablement signalisent la mise en oeuvre de défenses. Il semble que Claviceps soit reconnu par le seigle mais qu'il ait réussit à contourner ces défenses en augmentant la production d'une catalase dont l'activité consiste à éliminer le H2O2. Cela confirme la course entre hôtes et pathogènes: l'hôte met en place des systèmes de défense qui finissent par être contournés par les pathogènes. La réciproque doit aussi être possible, c'est à dire la mise en place de défenses supplémentaires. Notez que s'il n'y a pas de contournement, le champignon peut établir une relation harmonieuse avec son hôte: on parle alors de symbiose et le champignon n'est plus un parasite mais endophyte.
Pour votre information, il existe des endophytes phylogénétiquement apparentés à Claviceps. Ont-ils le gène CPFT1 ?...(5 points)
- L'identification de ce gène peut donner des idées de traitements des cultures. On peut par exemple envisager la construction d'une souche transgénique de seigle (ou sa sélection par des approches de génétique classique...) qui surproduirait le H2O2 juste au moment de l'infection. Il est possible aussi de traiter avec des inhibiteurs spécifiques des catalases (ce qui pose des problèmes car les catalases sont présentent chez tous les êtres vivants et sont souvent nécessaires à la survie en condition de stress) ou de CPFT1 (création d'inhibiteur par "drug design" par exemple). (5 points)
