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Variabilité des composés de surface de Propionibacterium freudenreichii
Vincent Péton
To cite this version:
Vincent Péton. Variabilité des composés de surface de Propionibacterium freudenreichii. 2011, 38 p.
�hal-01454177�
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MASTER SCIENCES, TECHNOLOGIES, SANTE Mention : Recherche en Biologie
Spécialité : Microbiologie Fondamentale et Appliquée Université de Rennes 1
U. F. R. Sciences de la Vie et de l’Environnement
Agrocampus Ouest
Institut Supérieur des Sciences Agronomiques, Agroalimentaires, Horticoles et du Paysage
Variabilité des composés de surface de Propionibacterium freudenreichii
Mémoire présenté le 22 juin 2011 Par Vincent PETON
Encadrant : Gwénaël JAN
Stage effectué au laboratoire de Microbiologie UMR 1253 Science et Technologie du Lait de l’Œuf
INRA-Agrocampus Ouest
65, rue de St Brieuc – 35042 RENNES
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Présentation technique du stage
M
ASTER2 M
ICROBIOLOGIEF
ONDAMENTALE ETA
PPLIQUEEAnnée universitaire 2010-2011
Auteur : Vincent PETON
Encadrant : Gwénaël JAN
Laboratoire : UMR 1253 STLO (Sciences et Technologies du Lait et de l’Œuf) 65, rue de St Brieuc
35042 RENNES Cedex
Tél : +33 (02) 23 48 53 22 ou 70 32 Fax : +33 (02) 23 48 53 50
Durée du stage : 3 janvier 2011 – 30 juin 2011 Remise du rapport : 10 juin 2011
Présentation orale : 22 juin 2011
Variabilité des composés de surface de
Propionibacterium freudenreichii
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Remerciements
Je tiens à remercier Sylvie LORTAL, directrice de l’UMR STLO, de m’avoir accueilli au sein du laboratoire, ainsi que Yves LE LOIR, qui m’a permis d’effectuer ce stage dans son équipe.
Des remerciements particuliers pour Gwénaël JAN sont de rigueur pour ses conseils, ses enseignements et son encadrement tout au long de ce stage. Il a pris énormément de son temps pour structurer, relire et corriger ce mémoire dans une période déjà bien chargée en travail pour lui.
Merci à Caroline LE MARECHAL, pour ses conseils, ses relectures et ses critiques.
Merci à Paulette AMET et Jessica MUSSET pour leur aide et leur empressement à répondre à des demandes parfois farfelues.
Je remercie également Fabien COUSIN, Marion DALMASSO et Victoria CHUAT, l’équipe de choc, pour leur aide occasionnelle et leur bonne humeur au moment des pauses café.
Merci à Valérie GAGNAIRE, Florence VALENCE, Antoine BOUCHOUX et Fanny GUYOMARCH pour leur aide au cours des différentes expériences.
Enfin, un grand merci à toute l’équipe B2ISI et tous les autres membres du STLO que je n’ai pas pu citer pour leur accueil et leurs discussions.
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Sommaire
Liste des figures et tableaux Liste des abréviations
Préambule ... 1
Introduction ... 1
I- Les Maladies Inflammatoires Chroniques de l’Intestin sont en augmentation ...1
II- Certaines bactéries sont capables de moduler l’inflammation ...3
III- Les produits laitiers fermentés sont une source de bactéries Gram positif ...3
IV- Des constituants de la paroi sont immunomodulateurs ...4
a. Exopolysaccharides ...4
b. S-Layer ...5
c. Acides teichoiques/lipoteichoiques ...5
d. Peptidoglycane ...6
e. GroEL...7
V- Contexte et objectifs du stage ...7
Matériel et méthode ... 9
I- Portoir de bactéries...9
II- Extraction des protéines de surface au chlorure de guanidine ...9
III- Marquage des protéines de surface à la cyanine 5 et extraction ...9
IV- Séparation des protéines...10
A- Préparation des gels 1D ...10
B- Préparation des gels 2D ...10
C- Analyse des gels ...11
D- Prélèvement des bandes ou des spots sur les gels ...12
V- Analyse des extraits protéiques par spectrométrie de masse ...12
VI- Détection de la présence d’exopolysaccharides de surface par immunoagglutination ...13
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VII- Mesure du potentiel zêta des souches ...13
Résultats et discussion ... 15
I- Les protéines de surface extractibles sont variables en termes de nature et de quantité ...15 II- Les protéines de surface marquées à la cyanine 5 sont variées et souche
dépendantes ...17 III- La nature des composés de surface module les propriétés physicochimiques
des souches ...21
Conclusion et perspectives ... 23
Références bibliographiques ... 24
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Liste des figures et tableaux
Figure 1 : Les protéines de surface extractibles varient selon les souches de Propionibacterium freudenreichii. ... 14
Figure 2 : Les protéines de surface marquées à la cyanine 5 différent selon les souches. ... 16
Figure 3 : Le protéome de surface varie selon les souches. ... 18-19
Figure 4 : Les propriétés physico-chimiques de la surface des souches sont
corrélées à la présence de certains composants de surface.
...22
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Liste des abréviations
ACN : Acétonitrile
DHNA : Dihydroxy-2-naphtoic acid DMF : Diméthylformamide
DSS : Dextran Sodium Sulfate DTT : Dithiothréitol
emPAI : exponentially modified peptidic abundance index (Indice d’abondance peptidique modifié exponentiellement)
Gel 1D : Gel monodimensionnel Gel 2D : Gel bidimensionnel
GRAS : Generally Recognized As Safe (Généralement reconnu comme étant sûr) IL : Interleukine
MICI : Maladie Inflammatoire Chronique de l’Intestin MS : Mass spectrometry (Spectrométrie de masse) MS/MS : Spectrométrie de masse en tandem
PBMC : Peripheral blood mononuclear cell (cellules mononucléaires circulant dans le sang) pI : Point isoélectrique
Q : Quadripôle (un des composants de la MS/MS) SDS : Dodécylsulfate de sodium
SDS-PAGE : Electrophorèse acrylamide en conditions dénaturantes (Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis)
TFA : Trifluoroacétic acid
TOF : Time of Flight (Temps de vol, un des composants de la MS/MS) TNBS : 2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid
Tris : Trishydroxyméthylaminométhane
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Préambule
Nous mangeons beaucoup de bactéries Gram positives, utilisées comme levains dans des produits fermentés. Certaines de ces bactéries sont immunomodulatrices et ont un effet anti- inflammatoire sur les Maladies Inflammatoires Chroniques de l’Intestin (MICI). Leurs composés de surface sont très probablement impliqués dans la modulation de la réponse inflammatoire. Ils sont variables et restent peu connus, notamment chez Propionibacterium freudenreichii. Ce travail de recherche s’intègre dans un projet ANR et porte sur l’étude des composés de surface de P.
freudenreichii en vue de leur éventuel rôle immunomodulateur.
Introduction
VI- Les Maladies Inflammatoires Chroniques de l’Intestin sont en augmentation
Parmi les maladies en progression, les Maladies Inflammatoires Chroniques de l’Intestin constituent une problématique de santé qui se développe dans les pays industrialisés. Les MICI sont majoritairement représentées par la colite ulcérative et la maladie de Crohn mais comprennent également le syndrome du côlon irritable et la rectocolite hémorragique. Elles touchent environ 1%
de la population dans les pays industrialisés (39). Il semblerait que l’augmentation de leur incidence soit liée au mode de vie occidental, avec l’amélioration des conditions d’hygiène et les changements de régimes (55).
Les causes de ces pathologies sont encore mal connues. L’inflammation est de nature auto- immune : le système immunitaire du patient attaque son propre tractus digestif au point de causer une nécrose des tissus. Le plus souvent, cette inflammation est déclenchée par un agent pathogène.
Cependant, ce n’est pas la seule cause : il s’agit de maladies multifactorielles avec, bien souvent, une prédisposition du malade. En effet, des mutations telles que celles du gène CARD15 ou du gène du récepteur à l’IL-23 ont été mises en évidence dans ces maladies (11,28). Une dysbiose (déséquilibre du microbiote intestinal) peut causer une brusque intolérance envers les bactéries commensales, qui mène à un état inflammatoire chronique. La présence de certaines bactéries Gram négatives et notamment d’Escherichia coli « adherent-invasive » semble également corrélée au déclenchement de la maladie (6,57). Par ailleurs, il a été mis en évidence que la diminution de la biodiversité intestinale augmentait les risques de complications suite à une ablation d’une partie du côlon. Plus particulièrement, la diminution du nombre de Faecalibacterium prausnitzii, qui a des propriétés anti-inflammatoires, accroit les risques de réapparition de l’inflammation lors de la maladie de Crohn (62).
Cet état pathologique implique la production de cytokines pro-inflammatoires, la perturbation des fonctions immunitaires de la muqueuse et de la barrière intestinale, avec une
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modification des jonctions serrées (47). Une carence en bactéries ayant des propriétés anti- inflammatoires dans le microbiote intestinal pourrait favoriser la persistance de l’inflammation (62).
Les bactéries commensales sont capables d’interagir avec les cellules de la muqueuse intestinale. Elles permettent l’activation des cellules épithéliales intestinales ainsi que la maturation des cellules dendritiques qui sont capables de phagocyter les bactéries et de présenter les antigènes résultant à leur surface. Cela permet ensuite la maturation et la différenciation des lymphocytes T (LT), qui ont besoin pour cela de rencontrer des antigènes (55). Ils peuvent se différencier en LT auxiliaires, en LT cytotoxiques ou en LT régulateurs (LT reg). La présence de LT reg est un facteur essentiel, en effet une carence de ces lymphocytes semble liée au développement des MICI (26).
Certaines bactéries Gram positives sont capables d’avoir un effet anti-inflammatoire. Il est rapporté que des enfants qui ingèrent dès la petite enfance du lait non pasteurisé développent moins d’allergies que les autres (56). Elles induisent chez les PBMC (Peripheral Blood Mononuclear Cells : lymphocytes, monocytes et macrophages) une diminution de la production de cytokines pro- inflammatoires (33). Ces bactéries Gram positives sont essentiellement représentées par les bactéries lactiques, qui sont très étudiées dans des thématiques probiotiques.
Le terme de probiotiques a été inventé il y a une quarantaine d’année pour désigner une substance bénéfique produite par des microorganismes par opposition aux antibiotiques.
L’Organisation Mondiale de la Santé (OMS) et la Food and Agriculture Organization (FAO) ont défini plus clairement en 2002 ce terme de probiotique : il s’agit de « microorganismes vivants qui, lorsqu’ils sont administrés en quantité adéquate, confèrent un bénéfice santé à l’hôte » (15). Selon cette définition, les métabolites et les microorganismes tués ne sont pas intégrés dans les probiotiques. Cependant, des effets bénéfiques ont clairement été mis en évidence chez des souris suite à l’ingestion de bactéries lactiques lysées ou de composés de la paroi bactérienne. Le terme de paraprobiotiques a été proposé pour définir les microorganismes non viables ou les fractions cellulaires qui ont un effet probiotique (64). Les microorganismes probiotiques peuvent avoir trois modes d’action :
- Ils inhibent ou entrent en compétition avec les pathogènes
- Ils améliorent le fonctionnement de l’épithélium intestinal en tant que barrière, en modulant différentes voies de signalisation. Ceci induit la production de mucus et de défensines, améliore les jonctions serrées (tight junctions) et limite l’apoptose.
- Ils sont capables de moduler le système immunitaire de l’hôte, aussi bien au niveau local que systémique.
- Ils modulent le microbiote intestinal et/ou apportent une activité enzymatique (par exemple la β-galactosidase qui remédie à l’intolérance au lactose)
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VII- Certaines bactéries sont capables de moduler l’inflammation
Certaines bactéries ont démontré des capacités probiotiques, notamment dans la modulation de l’inflammation. Le VSL#3, un mélange de bactéries probiotiques lyophilisées qui peut se trouver en pharmacie, est constitué de 8 espèces bactériennes appartenant aux genres Bifidobacterium, Lactobacillus et Streptococcus. Des études cliniques indiquent que ce mélange est capable de réduire les symptômes de l’inflammation chez des patients atteints de MICI (19,21,63).
D’autres mélanges de bactéries contenant d’autres espèces bactériennes ont également prouvé leur efficacité (22,32) en rallongeant la durée des périodes de rémission entre les poussées inflammatoires.
Cependant, ces études cliniques restent minoritaires et la majorité des souches probiotiques en sont encore à la phase d’étude préclinique in vivo sur les animaux. Il semble que l’efficacité anti- inflammatoire soit prédite par le profil de cytokines souche-dépendant produit par les cellules immunitaires. Les interleukines (IL) sont des cytokines qui permettent la « communication » entre les cellules du système immunitaire et la régulation de la réponse inflammatoire. L’IL-10 est anti- inflammatoire tandis que l’IL-12 est pro-inflammatoire. La balance de ces deux cytokines permet de déterminer l’orientation de la réponse immunitaire (17).
Le genre Lactobacillus a démontré des effets prometteurs en atténuant des colites chez des souris incapables de produire de l’IL-10 (73). Lorsque la colite est induite artificiellement en injectant du TNBS (2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid) ou du DSS (Dextran Sodium Sulfate), les symptômes de l’inflammation sont réduits et la production de cytokines pro-inflammatoires diminue (17,18,24,43) suite à l’ingestion de certains probiotiques. Propionibacterium freudenreichii est également capable de réduire l’inflammation dans un modèle de colite induite au TNBS (16). Le DHNA (dihydroxy-2-naphtoic acid) produit par cette bactérie est capable de réduire l’inflammation chez des souris traitées par le DSS (50). Streptococcus thermophilus ainsi que le genre Bifidobacterium ont eu des résultats plus mitigés, notamment en augmentant la production de cytokines pro-inflammatoires chez le porc (4) mais ils sont également capable de prévenir le développement de l’entérocolite ulcéro-nécrosante chez des porcelets prématurés nés par césarienne (61).
VIII- Les produits laitiers fermentés sont une source de bactéries Gram positif
La majorité des bactéries citées précédemment sont retrouvées dans des produits laitiers fermentés (fromages, yaourts, laits fermentés) qui sont une source importante de bactéries Gram positives. Il a été démontré que la suppression de tout aliment fermenté dans la diète induisait un déficit de la réponse immunitaire innée et que la consommation de bactéries lactiques la rétablissait (51). Chaque année, 250 000 tonnes d’Emmental sont produites en France, ce qui correspond à une
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portion de 10g/personne/jour. Ceci représente une dose de Propionibacterium freudenreichii d’environ 1010 bactéries/personne/jour. Par ailleurs, cette dose peut être augmentée en consommant d’autres fromages à pâte semi-dure. En effet, P. freudenreichii est de plus en plus utilisée dans les fromages de type Morbier ou Raclette afin d’améliorer les qualités organoleptiques.
De ce fait, les produits laitiers fermentés, et plus particulièrement les fromages, sont de bons moyens d’administration de P. freudenreichii, d’autant plus que cette bactérie a le statut GRAS (Generaly Recognized As Safe) attribué par la Food and Drug Administration. De plus, le genre Propionibacterium a montré des potentiels probiotiques dans les de extrêmement variées, allant de la prévention du cancer colorectal, de l’immunomodulation et de la modulation du microbiote (5).
IX- Des constituants de la paroi sont immunomodulateurs
Les molécules de la paroi, qui sont les principales sources d’interaction avec le système immunitaire, sont des cibles de choix pour étudier leurs capacités probiotiques.Cependant, même si les principales macromolécules ont une structure similaire entre les espèces, de légères modifications sont à l’origine de propriétés probiotiques souches spécifiques (33). De par sa fonction d’absorption, l’épithélium intestinal présente une grande surface qui favorise le contact avec les bactéries, la flore intestinale constituant la majeure partie du microbiote humain. De plus, les bactéries peuvent également interagir avec les cellules dendritiques par le biais des PRR (Pattern Recognition Receptors), auxquelq appartiennent les TLRs (Toll-Like Receptors) qui permettent de détecter les MAMPs (Microorganism-Associated Molecular Pattern).
A- Exopolysaccharides
Les exopolysaccharides (EPS) sont des polymères d’oses exposés à la surface des parois. Ils sont généralement reconnus par le système immunitaire comme étant des antigènes au niveau des complexes majeurs d’histocompatibilité (CMH) de classe II.
Les EPS des bactéries probiotiques restent peu étudiés dans le cadre des interactions avec l’hôte, contrairement à ceux des espèces pathogènes. Leur principal intérêt provient de leurs propriétés fonctionnelles dans les produits laitiers fermentés, pour les caractéristiques rhéologiques des produits, et permettent d’améliorer leurs qualités organoleptiques (70). Chez les bactéries pathogènes, les EPS (ou les lipopolysaccharides) servent essentiellement à perturber leur reconnaissance par les cellules immunitaires et à empêcher la phagocytose par les macrophages et les neutrophiles en masquant des protéines de surface immunogènes.
Chez les bactéries probiotiques, les EPS sont également impliqués dans la modulation de la réponse immunitaire. Ainsi, chez L. rhamnosus GG, ils permettent de masquer les molécules de surface telles que les fimbriae (37) et sont capables de réduire la production d’IL-8 (pro-
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inflammatoire) induite par la présence de flagelline chez les cellules Caco-2 (40). Chez L. shirota, ils suppriment la réponse pro-inflammatoire chez les macrophages (74). Il a été démontré que les EPS de Bifidobacterium longum (BCRC 14634) induisaient la prolifération des macrophages in vitro et augmentaient la sécrétion d’IL-10 (cytokine anti-inflammatoire), alors que les LPS limitaient la prolifération de ces cellules et induisait la production de TNFα (71).
Par ailleurs, des bactéries Gram positives non lactiques ont également des exopolysaccharides capables de moduler la réponse immunitaire. Le polysaccharide A de Bacillus subtilis est essentiel pour le développement du système immunitaire chez des souris axéniques, en permettant la maturation des lymphocytes T helper et des tissus lymphoides (44) et permet de réduire les symptômes de l’inflammation lors de colites induites par Helicobacter hepaticus (45).
B- S-Layer
La S-Layer est retrouvée de manière souche-dépendante chez les procaryotes et peut représenter jusqu’à 10-15% des protéines totales de la cellule chez Lactobacillus sp (64). Elle est composée de sous-unités protéiques ou glycoprotéiques qui s’auto-assemblent pour former une structure paracristalline qui enveloppe la bactérie. La souche commerciale de Lactobacillus acidophilus NCFM possède une S-Layer composée d’une protéine SlpA de 45kDa. Cette protéine se fixe au DC-SIGN (dendritic cell-specific intercellular adhesion molecule-3-grabbing non- integrin), un récepteur présent sur les macrophages et les cellules dendritiques (34). L’incubation de Lb acidophilus NCFM avec des cellules dendritiques induit une augmentation de la production d’IL-10 dépendante de la concentration et une faible production de l’IL-12p70. Les bactéries se fixent aux cellules dendritiques au niveau des récepteurs DC-SIGN. Lorsque le gène de SlpA est muté, il n’y a plus d’adhésion des bactéries. De plus, la mutation de slpA provoque la production majoritaire de SlpB, une autre protéine de la S-Layer qui induit la production de cytokines pro- inflammatoires telles que l’IL-12p70, le TNFα et l’IL-1β.
C- Acides teichoiques/lipoteichoiques
Les acides teichoiques sont des polysaccharides retrouvés dans la paroi des bactéries Gram positives. Ils peuvent se lier de manière covalente au muramyl dipeptide ainsi qu’à des phospholipides (acide lipoteichoique) permettant ainsi l’ancrage de la paroi dans la bicouche lipidique. Ils interagissent avec le complexe hétérodimérique TLR2-TLR6 avec les protéines CD14 et CD36 comme co-récepteurs(49).
Comme ces molécules sont présentes de manière ubiquitaire chez les bactéries Gram positives, il est nécessaire que les cellules de l’épithélium intestinal aient développé des mécanismes de tolérance. En effet, elles produisent les récepteurs impliqués en faible quantité (46)
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et sur-expriment des inhibiteurs spécifiques des voies de signalisation des TLRs, tels que TOLLIP (Toll-interacting protein) (52). Cela signifie que les acides (lipo)teichoiques ne sont probablement pas des MAMPs majeurs au niveau des cellules épithéliales intestinales.
Cependant, les acides lipoteichoiques provenant de Lactobacillus johnsonii La1 et L.
acidophilus La10 sont capables d’inhiber la production d’IL-8 induite par la présence d’Escherichia coli ou de LPS. Il est possible qu’il y ait une compétition au niveau des co-récepteurs CD14 (68).
Des souches de L. casei et L. fermentum sont également capables de stimuler la production de TNF chez des macrophages via le TLR2, induisant une réponse pro-inflammatoire dépendant des lymphocytes Th2 (42). De plus la substitution de D-alanine à la place de L-alanine renforce ce type de réponse chez L. plantarum (20) mais ces effets n’ont pas été confirmés chez L. rhamnosus. Par ailleurs, l’absence de LTA chez une souche de L. acidophilus induit des profils cytokiniques anti- inflammatoires (48).
D- Peptidoglycane
Le peptidoglycane est le composant principal de la paroi et est parfois directement en contact avec le milieu extérieur chez les bactéries Gram positives. Pour interagir avec les PRRs, il est nécessaire qu’il soit fragmenté, lors de son renouvellement, de l’autolyse ou par l’action du lysozyme dans le tube digestif. Ces fragments sont alors capables de se fixer au complexe TLR2/CD14 à la surface des cellules épithéliales (60,66). De plus, la composition du peptidoglycane influence le type de réponse induit : il est plus facilement reconnu par le TLR2 si le troisième acide aminé de l’oligopeptide est l’acide diaminopimélique que s’il s’agit de la lysine. La modification de la structure du peptidoglycane pourrait être une stratégie d’adaptation des bactéries pour éviter l’induction de de la production de cytokines pro-inflammatoires et donc leur attaque par le système immunitaire.
Un second mécanisme de détection s’effectue au niveau des vésicules d’endocytose ou des phagosomes via les protéines NOD (Nucleotide-binding oligomerization domain) 1 et 2. NOD1 semble plutôt impliqué dans la reconnaissance de peptidoglycane contenant de l’acide diaminopimélique, essentiellement chez les bactéries Gram négatives, tandis que NOD2 reconnait le muramyl dipeptide, présent aussi bien chez les bactéries Gram positives que Gram négatives (3).
Au niveau de la face apicale des cellules épithéliales intestinales, le muramyl dipeptide est pris en charge par le transporteur PEPT1 et permet l’activation de plusieurs gènes par le facteur de transcription NF-κB (67). Cette protéine régule la transcription de nombreux gènes impliqués dans la survie de la cellule. Ce signal prévient l’apoptose de la cellule et permet la mise en place d’une réponse immunitaire anti-infectieuse, notamment en activant la transcription de gènes codant pour des cytokines (72). Des tissus touchés par une inflammation chromique ont souvent une
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augmentation de NF-κB. Cependant, l’inhibition de cette voie de signalisation peut également être nocive pour l’organisme et peut parfois déclencher l’inflammation au lieu de la réduire.
Les cellules dendritiques expriment également le TLR2 et NOD2. Le potentiel anti- inflammatoire de Lactobacillus rhamnosus est dépendant de l’expression de ces récepteurs à la surface des cellules dendritiques (17). Des souris reçoivent des cellules dendritiques préalablement exposées à L. rhamnosus et sont traitées avec du TNBS afin d’induire une colite expérimentale.
Celles ayant reçu des cellules qui présentaient les récepteurs à leur surface ont une inflammation du côlon moins importante que celles ayant reçu des cellules mutées pour les gènes des récepteurs. Il semblerait également que le TLR2 ait un rôle immuno-régulateur en présence de bifidobactéries alors qu’il a l’effet inverse en présence de lactobacilli et induit une réponse de type Th1 (75). Ceci explique pourquoi un microbiote riche en bifidobactéries prévient l’apparition d’allergies et favorise les réponses immunitaires de type Th2 au niveau de l’intestin.
Il a été proposé que les voies de signalisation cellulaire découlant de l’activation du TLR2 par le peptidoglycane étaient négativement régulées par l’activation de NOD2 (69). Il semblerait également que des allèles du gène NOD2 soient impliqués dans la maladie de Crohn. En effet, des mutations empêcheraient l’interaction de ce récepteur avec le peptidoglycane et pourraient contribuer à un déséquilibre des signaux TLR2/NOD2, provoquant un état pro-inflammatoire chronique (28).
E- GroEL
GroEL est une protéine chaperonne impliquée dans la protection du choc thermique. Elle est retrouvée à la surface de Lactobacillus johnsonii La1 et interagit avec les récepteurs solubles CD14 produits par les cellules épithéliales HT29 (2). Cette interaction induit l’augmentation de la production d’IL-8 (pro-inflammatoire) chez les cellules épithéliales et les macrophages. En revanche, GroEL provoque l’agrégation d’Helicobacter pylori mais pas de Lb johnsonii La1.
X- Contexte et objectifs du stage
Le projet ANR SURFING (Starter Surface against Gut Inflammation) vise à étudier deux espèces bactériennes (Propionibacterium freudenreichii et Lactobacillus delbrueckii) qui sont utilisées pour la production de produits laitiers fermentés. Du fait des propriétés anti-inflammatoires déjà observées chez quelques souches et des quantités dans lesquelles elles sont ingérées, ces bactéries pourraient jouer un rôle bénéfique dans la qualité de vie des personnes atteintes de MICI.
L’originalité de ce projet vient du fait que les produits laitiers fermentés sont étudiés pour leurs effets potentiels sur la santé humaine au travers des interactions bactéries/hôte, au lieu d’étudier leurs qualités nutritionnelles. Les produits laitiers dans lesquels sont retrouvées les
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bactéries sont consommés en grande quantité dans les pays occidentaux, et c’est justement dans ces pays que l’incidence des MICI est la plus élevée.
Vingt-trois souches séquencées de P. freudenreichii et 8 souches de L. delbrueckii sont étudiées suite au séquençage de leur génome. Une étude génomique, transcriptomique et protéomique est menée pour identifier leurs protéines de surface et leur diversité. En parallèle, les différentes souches sont testées sur des PBMC pour établir un profil cytokinique et sur des cellules HT-29 pour vérifier l’inhibition de la voie NF-κB. Ces différentes études seront croisées pour déterminer quelles sont les protéines qui sont impliquées dans l’immunomodulation. Une étude sera également menée sur les cellules épithéliales humaines pour connaître l’impact de la bactérie sur l’expression de leurs gènes. Des souches induisant un profil cytokinique anti-inflammatoire (plus d’IL-10 et moins d’IL-12) seront testées sur ces cellules. Des mutants (d’inactivation et de surexpression) pour les protéines candidates seront réalisés à partir de ces souches et testés à nouveau sur les cellules HT-29 afin de vérifier l’implication de ces protéines dans la modulation de l’inflammation.
Ce stage a débuté au moment du lancement de ce projet ANR et s’inscrit dans la partie d’identification des protéines de surface. Seule la souche CIRM-BIA 1 a déjà fait l’objet d’études protéomiques. Les objectifs de ce stage sont d’élargir l’identification des protéines de surface aux 23 souches de P. freudenreichii, en mettant en œuvre différentes techniques. En effet, plusieurs méthodes sont décrites dans la littérature pour étudier les protéines de surface. L’utilisation d’agents chaotropes à forte concentration est proposée pour extraire les protéines qui ne sont pas liées de manière covalente à la paroi, telles que celles qui constituent la S-Layer (1,54). Une méthode de marquage des protéines de surface avec une cyanine a été développée récemment au STLO, ce qui permet de différencier les protéines exposées en surface au sein d’un extrait des protéines totales.
L’utilisation de la trypsine in situ est également proposée pour raser les protéines qui dépasseraient de la surface bactérienne (10,65).
D’autres paramètres, liés à la physico-chimie de la surface seront également étudiés. La mesure du potentiel zêta permettra de mieux connaître les propriétés de surface, susceptibles de jouer dans les capacités d’adhésion de la bactérie aux cellules épithéliales intestinales. Par ailleurs, des études prometteuses mettent en œuvre de la microscopie à force atomique afin d’étudier également les forces d’attraction ou de répulsion à la surface des bactéries (12,13,31). A notre connaissance aucune de ces méthodes n’a été mise en œuvre sur les bactéries propioniques laitières et il s’agirait de les développer.
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La présence d’une capsule est également corrélée à l’accessibilité des charges ioniques et des protéines en surface des bactéries. Une méthode de détection a déjà été développée au STLO et sera appliquée à l’ensemble des souches (8).
Matériel et méthode
VIII- Portoir de bactéries
Les souches de Propionibacterium freudenreichii ont été fournies par le Centre International de Ressources Microbiennes – Bactéries d’Intérêt Alimentaire (CIRM-BIA). Au total, 23 souches provenant de levains industriels constituent le portoir utilisé lors de ce stage (Figure 4).
Les bactéries sont cultivées en routine en milieu Yeast Extract Lactate (YEL) ou en perméat d’ultra-filtrat de lait additionné de 50mM de lactate et de 5g/L de peptones de caséines (UF L50P5).
Elles sont inoculées à 1% V/V puis incubées à 30°C.
IX- Extraction des protéines de surface au chlorure de guanidine
Il s’agit d’extraire les protéines de surface qui ne sont pas liées de manière covalente, à l’aide d’un agent chaotrope à forte concentration.
Dix mL de culture de bactéries en début de phase stationnaire sont centrifugés (5 min, 8000g), rincés dans un volume équivalent de PBS puis centrifugées à nouveau (5 min, 8000g). Le culot est resuspendu dans un volume 5 fois plus faible d’une solution de chlorure de guanidine 5M et incubé 15 min à 50°C. Afin de séparer les bactéries des protéines extraites, la suspension est centrifugée 18 min à 21000g puis le surnageant est récupéré. Le chlorure de guanidine est éliminé par dialyse en utilisant des cassettes Slide-A-Lyzer (3-12 mL, 10 000 MCWO, ThermoScientific®) selon les consignes du fabricant. Les échantillons sont alors dialysés pendant 6h contre 10 L d’eau distillée puis une nuit contre 10 L d’une solution de SDS 1% afin d’éviter que les protéines ne précipitent dans les cassettes. L’extrait contenu est récupéré puis séparé sur des gels SDS-PAGE.
X- Marquage des protéines de surface à la cyanine 5 et extraction
Les protéines de surface sont marquées à l’aide de la cyanine 5 (Cy5, GE Healthcare). Cette cyanine est couplée à un groupement NHS-ester qui se lie de manière covalente au groupement amine ε des résidus lysine exposés en surface des bactéries.
Les manipulations suivantes sont réalisées sur glace, afin de limiter l’activité métabolique des bactéries et la sécrétion de protéines extracellulaires.
Dix mL de culture de bactéries en début de phase stationnaire sont centrifugées (5 min, 4000g, 4°C). Le culot est resuspendu dans 10 mL de PBS Tris 33 mM pH 8,5 et centrifugé à nouveau (5 min, 4000g, 4°C). A partir de cette étape, toutes les manipulations sont réalisées autant
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que possible dans l’obscurité. 100 µL de Cy5 à 4 mM dans du diméthylformamide sont ajoutés avant d’incuber sur glace pendant 30 min, à l’obscurité. Le marquage est arrêté par l’adjonction de 10 µL de lysine à 10 mM dans du tampon PBS-Tris pH 8,5, et incubé 10 min sur glace. Les cultures sont ensuite centrifugés (5 min, 4000g, 4°C) et le culot est rincé dans 10 mL de tampon PBS pH 7,4 puis centrifugé à nouveau. Le culot obtenu est resuspendu dans 1 mL de tampon de lyse (25 mM Tris-HCl (pH 7,5), SDS 0,3%, DTT 20 mM) avec 10% de PMSF 40 mM puis congelé et décongelé successivement trois fois avant d’être soniqué 4 min (Sonicateur Vibracell, Bioblock Scientific).
Le lysat est alors centrifugé dans des tubes eppendorf 1,5 mL 10 min, 12000g. Le surnageant contenant les protéines est conservé à -20°C en vue d’une analyse électrophorétique ultérieure.
XI- Séparation des protéines E- Préparation des gels 1D
Les gels SDS-PAGE sont réalisés sur un système Protean II xi Cell (Bio-Rad), selon le protocole décrit par Laemmli (36). La composition des gels est définie d’après le nomenclature de Hjerten (27), où T représente la concentration totale en monomères (acrylamide/bisacrylamide) et C le pourcentage de bisacrylamide par rapport à la quantité totale de monomère. La composition des gels est la suivante :
- Gel supérieur : T = 4%, C = 3,3%, tampon Tris 125 mM, HCl (pH 6,8), SDS 0,1%
- Gel inférieur : T = 14%, C = 3,3%, tampon Tris 375 mM, HCl (pH 8,8), SDS 0,1%
- Tampon de migration : tampon Tris 25 mM glycine 152 mM (pH 8,3), SDS 0,1%
- Tampon échantillon : tampon Tris 1,25 M HCl (pH 6,8), SDS 4%, DTT 0,6%, glycérol 20%, Bleu de Bromophénol 0,01%
Avant le dépôt, les échantillons sont mélangés avec le tampon échantillon et chauffés au bain-marie 10 min à 100°C. Après retour à température ambiante, les échantillons sont déposés dans les puits préalablement rincés avec le tampon de cuve. Les marqueurs de masse moléculaire utilisés sont : l’α-lactalbumine (14,4 kDa), l’inhibiteur de la trypsine (20,1 kDa), l’anhydrase carbonique (30 kDa), l’ovalbumine (45 kDa), la sérum albumine bovine (66 kDa) et la phosphorylase b (97 kDa). La migration s’effectue jusqu’à la sortie du front de migration selon une tension de 70 à 120V et un ampérage non limitant.
F- Préparation des gels 2D
L’électrophorèse bidimensionnelle associe une étape de séparation des protéines selon leur point isoélectrique avec une étape de séparation selon le poids moléculaire par une électrophorèse classique de type SDS-PAGE.
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Le volume d’échantillon nécessaire à la réalisation d’un gel 2D (équivalent de 3x le volume utilisé pour un gel 1D) est traité avec le kit 2D-Clean Up (GE Healthcare). Il est ensuite réhydraté dans 100 µL de tampon Destreak (GE Healthcare) dans lequel 60 µL d’IPG Buffer pH 4-7 (GE Healthcare) ont été ajoutés.
La focalisation isoélectrique s’effectue sur des bandelettes linéaires Immobiline DryStrip Gels de 18 cm, de gradient de pH 4-7 (GE Healthcare) sur un système Multiphore II (Pharmacia Biotech). Ces bandelettes sont préalablement réhydratées une nuit dans 450 µL de tampon Destreak additionné d’IPG Buffer pH 4-7. Les échantillons sont déposés sur le tiers acide des bandelettes à l’aide de cupules. La migration s’effectue en 22h30 à 32h30 selon un programme permettant une augmentation progressive de la tension et une accumulation de 60 kVh (29).
A la fin de la focalisation, les bandelettes sont incubées sous agitation successivement dans les solutions d’équilibration I et II (50 mM de Tris-HCl pH 6,8 ; 6M d’urée ; 30% de glycérol ; 1%
de SDS, avec 0,3% de DTT pour la solution I et 4,5% d’iodoacétamide et une pointe de spatule de bleu de bromophénol pour la solution II) pendant 10 min. Cette étape permet de dénaturer davantage les protéines en réduisant les ponts disulfures avec le DTT et en alkylant les fonctions SH libérées avec l’iodoacétamide. Cela permet également de complexer les protéines avec le SDS et d’éliminer certains constituants de la première dimension.
La bandelette est adaptée en haut d’un gel SDS-PAGE et immobilisée avec de l’agarose de pontage (100 mM de Tris-HCl pH 6,8 ; 10% de SDS ; 1% d’agarose) qui servira également de gel de concentration. La seconde migration est réalisée dans un système Ettan DALTtwelve (Amersham Bioscience) permettant de faire migrer 12 gels SDS-PAGE simultanément. Les cassettes en verre dans lesquelles les gels sont coulés sont utilisées spécifiquement pour la fluorescence.
G- Analyse des gels
Les images en fluorescence sont obtenues grâce à une G:Box (Ozyme) pour les gels 1D, en utilisant les LED de lumière rouge et le filtre FRLP (Far Red Large Pass) pour l’observation de la cyanine 5 (excitation à 633 nm, émission à 670 nm). Cet appareil est doté d’une caméra CCD grand angle à haute définition, refroidie à -70°C par effet Peltier. Les images des gels 2D sont réalisées à l’aide d’un scanner Typhoon9400 (plateforme de protéomique sur le campus de Beaulieu) aux mêmes longueurs d’ondes que précédemment. Les gels ne sont pas démoulés et sont observés directement dans leur cassette.
Les gels sont ensuite rincés à l’eau distillée puis fixés dans une solution de fixation (10%
d’acide acétique glacial et 30% d’éthanol). Ils sont à nouveau rincés dans de l’eau distillée (3 fois 5 min) puis ils sont colorés avec une solution colloïdale de bleu de coomassie Bio-Safe (Bio-Rad)
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selon les instructions du fabricant. Les gels sont enfin décolorés dans de l’eau distillée (plusieurs bains peuvent être nécessaires). Les images sont obtenues avec un scanner ImageScanner III (GE Healthcare). Elles sont ensuite analysées avec le logiciel ImageMaster 2D Platinum (GE Healthcare). Les images en florescence et les images au bleu de coomassie sont superposées afin de pouvoir relier un spot observé en florescence avec le spot correspondant au bleu de coomassie.
H- Prélèvement des bandes ou des spots sur les gels
Les bandes ou les spots sont excisés et digérés par trypsinolyse « in gel » (23). Les fragments de gels contenant les protéines d’intérêt sont découpés au scalpel (gels 1D) ou prélevés à l’aide d’un emporte pièce (gels 2D). Les fragments provenant de gels 1D sont réduits avec 50 µL de DTT (10 mM) puis alkylés avec 50 µL d’iodoacétamide (55 mM), cette étape ayant déjà été réalisée lors de l’équilibration des strips pour spots provenant des gels 2D. Les fragments de gels sont rincés à deux reprises avec de l’acétonitrile (ACN) à 50% (v/v) dans du tampon CH5NO3 (50 mM). A ce stade tous les échantillons sont traités de la même façon.
Les fragments sont rincés deux fois 15 min dans 100 µL d’une solution à 50% d’acétonitrile dans du tampon CH5NO3 50mM et sont séchés 15 min au SpeedVac avec chauffage (les gels doivent devenir blanc, opaques). Les gels sont ensuite réhydratés avec 2 µL d’une solution de trypsine soluble (0,1 µg/µL dans du tampon CH5NO3 50 mM) puis 25 µL de tampon CH5NO3. Les tubes sont incubés une nuit à 37°C et la réaction de trypsinolyse est arrêtée en ajoutant 3 µL d’acide trifluoroacétique à 5%.
XII- Analyse des extraits protéiques par spectrométrie de masse
Les solutions de peptides obtenues après digestion trypsique sont séparées et analysées par spectrométrie de masse en tandem (NanoLC-ESI-Q/TOF). Les peptides sont séparés en nano chromatographie liquide de phase inverse (Nano RPLC, Dionex-U3000-RSLC) avec une phase stationnaire C18. La phase mobile est constituée d’un mélange de deux tampons (Tampon A : H2O 98% ; ACN 2% ; HCOO- 0,08% ; TFA 0,01% ; Tampon B : H2O 5% ; ACN 95% ; HCOO- 0,08% ; TFA 0,01%). Un gradient faisant varier le mélange de 10% de tampon B à 40% en 40 min permet d’éluer les peptides fixés à la colonne. Pour la détection en MS/MS (Q-Star, Applied Biosystem), les peptides sont ionisés par électrospray (ESI) pour être séparés une première fois selon leur rapport masse/charge (m/z) par l’analyseur quadripolaire (Q), qui permet de sélectionner les peptides les plus intéressants et de les laisser passer dans la chambre de collision pour les fragmenter. Les fragments de peptides sont séparés et analysés par l’analyseur à temps de vol (Time of flight : TOF), ce qui permet de connaître leur rapport m/z et d’obtenir des spectres de peptides.
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En comparant ces spectres à des banques de peptides déjà séquencés, on peut en déduire la séquence en acides aminés des peptides fragmentés.
L’identification des peptides est faite par comparaison avec une base de données (Swiss- Prot) à l’aide du moteur de recherche MASCOT. Dans le cadre de notre étude, nous avons ajouté à cette base les séquences protéiques prédites à partir du génome de la souche CIRM-BIA 1 (14).
XIII- Détection de la présence d’exopolysaccharides de surface par immunoagglutination Il s’agit de détecter la présence d’exopolysaccharides (EPS) en surface des souches de P.
freudenreichii en utilisant un sérum polyclonal anti-(1-3,1-2)-β-D-glucane de Streptococcus pneumoniae (9). Lorsque ces EPS sont reconnus par les anticorps, les bactéries s’agglutinent.
Vingt µL de suspension de bactéries en début de phase stationnaire sont déposés sur une lame de verre avec 5 µL de sérum puis recouverts par une lamelle. Des témoins sont réalisés en utilisant milieu de culture stérile à la place du sérum. La suspension est incubée 30 min à 4°C puis observée au microscope optique (Olympus BX51, x1000). A chaque fois, la suspension avec le sérum est comparée avec celle qui a reçu le milieu stérile, certaines souches ayant tendance à s’agglutiner naturellement.
XIV- Mesure du potentiel zêta des souches
Le potentiel zêta est la différence de potentiel entre la couche dense de Stern et la couche diffuse à la surface d’une particule. Dans le cas des bactéries, celles-ci sont chargées négativement, elles ont donc une couche dense de Stern constituée d’ions positifs qui adhèrent fortement à la surface et une couche diffuse constituée principalement d’ions positifs qui adhèrent moins fortement. Le potentiel zêta est mesuré en combinant une électrophorèse en capillaire et une mesure de la mobilité des particules par laser doppler. Cette méthode permet de mesurer à quelle vitesse une particule se déplace dans un liquide lorsqu’un champ électrique est appliqué. En connaissant la viscosité de la solution et la valeur du champ électrique, il est possible de déterminer le potentiel zêta par application de la loi de Henry.
Une culture bactérienne en début de phase stationnaire est centrifugée, remise en suspension dans un volume équivalent de tampon (10 mM KH2PO4, 140 mM NaCl, pH 7) puis diluée au 1/20e dans le même tampon. La suspension est transférée dans une cuve spéciale à capillaire (Disposable capillary cell, Malvern Instruments) en veillant à éviter les bulles. La mobilité électrophorétique est mesurée à l’aide d’un ZetaSizer Nano ZS (Malvern Instruments) en imposant une tension de 50V et en réalisant à chaque fois 2 séries de 3 mesures à 20°C.
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Résultats et discussion
IV- Les protéines de surface extractibles sont variables en termes de nature et de quantité
Les protéines de surface liées de manière non covalente à la paroi ont été extraites et séparées sur un gel SDS-PAGE à 14% de monomère (acrylamide/bisacrylamide). Les profils de migration indiquent qu’il y a une variabilité des protéines entre les souches (Figure 1A). Les protéines observées ne sont pas les mêmes chez toutes les souches, certaines d’entre elles présentent une diversité tandis que d’autres ne semblent pas en avoir. De plus, pour une même identification (Figure 1B), la taille des bandes peut varier légèrement enter des souches, ce qui laisse penser qu’il existe un polymorphisme des gènes correspondants. Par ailleurs, chez une même souche, plusieurs bandes de tailles variables peuvent présenter une même identification. C’est le cas pour la souche BIA-118, une première bande très intense est observée à 58 kDa et identifiée comme étant la SlpA, ce qui correspond à la masse théorique attendue, mais 5 autres bandes de tailles inférieures (48, 43, 40, 36 et 34 kDa) sont également identifiées comme SlpA. Ceci qui laisse penser qu’il y a une protéolyse. Ce phénomène fait partie des mécanismes de renouvellement des composés de surface.
De manière générale, les protéines de surface sont peu diversifiées. Ce sont toujours les mêmes qui sont identifiées et on en retrouve trois principales : SlpA (SL), LspA (LS) et InlA (IN).
SlpA est une protéine qui s’auto-assemble pour former une structure paracristalline : la S-Layer. Sa présence valide la méthode d’extraction car elle a déjà été observée chez les souches CNRZ722 (=BIA 508, (41)) et CNRZ721 (=BIA 118, (16)). Elle est présente chez 7 souches/23, généralement en grande quantité. Ceci laisse penser que la bande SlpA identifiée chez la souche BIA456 proviendrait en fait de la souche BIA508 qui se trouve juste à côté sur le gel. LspA n’est pas mentionnée dans la bibliographie comme étant une protéine de surface mais sa séquence porte un domaine impliqué dans la biosynthèse du peptoglycane ainsi qu’un domaine glucosaminidase. Cette protéine serait donc impliquée dans le renouvellement de la paroi cellulaire. InlA a été nommée ainsi à cause de son homologie avec l’internaline A de Listeria monocytogenes. Il s’agit d’une adhésine, permettant l’interaction avec les cellules épithéliales de l’intestin, pas directement impliquée dans des processus infectieux. De part sa fonction, il est logique de la retrouver en surface de la bactérie.
D’autres protéines minoritaires ont été identifiées : DnaK1 (DN), Cys2 (CY), CspA (CS), RpsN1 (RP) et une protéine impliquée dans un complexe transporteur ABC (TR). Dans plusieurs cas, l’identification MS/MS est réalisée à partir d’un seul peptide. Ceci donne généralement un score et un emPAI faibles, remettant en cause la fiabilité de l’identification. Sur les gels, il apparait que ces protéines sont moins abondantes par rapport aux autres. Toutefois, comme les transporteurs
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ABC sont transmembranaires, il semble logique que certaines de ces protéines puissent se retrouver en surface de la bactérie. De plus, CspA a déjà été identifiée à la surface de Streptococcus salivarius et des prédictions à partir de sa séquence la situent en surface (38). DnaK1 est une heat-shock protein, elle serait impliquée dans la protection et le bon repliement des protéines de surface. Elle a déjà été localisée en surface chez Mycobacterium tuberculosis et L. monocytogenes (25,59). RpsN1 est une protéine ribosomale et il a été démontré que certaines de ces protéines pouvaient se retrouver en surface chez Lactobacillus plantarum (1). Tjalsma et al. (65) ont suggéré qu’il pouvait s’agir des protéines provenant de la lyse d’une partie de la population. Aucune référence concernant la localisation de Cys2 en surface n’a été trouvée dans la littérature.
Afin de vérifier que le manque de fiabilité de l’identification provient bien de la faible quantité de protéines, et non pas d’un artéfact de manipulation, il faudrait réaliser à nouveau les gels en augmentant le volume d’extraits déposés. De plus, s’il y a un risque que certaines bandes correspondant à SlpA apparaissent sur les pistes situées à côté de souches qui ont cette protéine en abondance, il faudrait confirmer la présence ou l’absence de cette protéine en déposant les échantillons dans un autre ordre.
V- Les protéines de surface marquées à la cyanine 5 sont variées et souche dépendantes
Les protéines de surface des 23 souches de P. freudenreichii ont été marquées in situ à la cyanine 5 (Figure 2A). Des tests avaient déjà été effectués afin de vérifier que le marquage était bien spécifique et ne permettait pas de marquer les protéines intracellulaires. Seules les protéines possédant au moins un domaine extracellulaire peuvent être marquées.
Les extraits protéiques totaux séparés sur des gels SDS-PAGE observé en fluorescence indiquent que les protéines de surface marquées varient selon les souches (Figure 2B). La bande correspondant à la S-Layer est clairement visible en coloration au bleu de coomassie (Figure 2C) mais beaucoup moins en fluorescence. Cette absence de marquage ne provient pas de la séquence de la protéine, car elle comporte bien des lysines, mais cela pourrait venir de la structure paracristalline de la S-Layer. La structure de cette couche pourrait bien empêcher la fixation des Cy5.
La piste 1D correspondant à la souche BIA 125 est peu visible au bleu de coomassie mais très fluorescente. Lors du marquage, une partie du culot a été perdue, ce qui a augmenté le rapport cyanine/bactérie. De ce fait, la cyanine est en trop forte concentration et le marquage n’est pas spécifique.
Malgré le fait que des différences soient observables entre les souches, il est nécessaire de séparer les extraits protéiques totaux sur des gels 2D.
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Les 23 souches ont été analysées en électrophorèse bidimensionnelle (tous les résultats ne sont pas présentés dans ce rapport). Quatre ont été ensuite sélectionnées, BIA 1, 118, 138, et 527, selon la qualité de la première électrophorèse et la présence ou l’absence d’une capsule exopolysaccharidique et des protéines SlpA, LspA et InlA (Figure 3A). Ceci permet de vérifier que les préparations électrophorétiques se sont bien déroulées.
La comparaison des différents profils indique qu’il y a une diversité des protéines de surface marquées à la Cy5. La souche BIA 1 présente un marquage de qualité égale aux autres souches, donc la présence de la capsule ne perturbe pas la diffusion de la cyanine.
Les identifications des spots fluorescents en spectrométrie de masse MS/MS (Figure 3B) confirment celles obtenues lors des extractions des protéines de surface. Les protéines extractibles sont bien retrouvées sur les gels 2D, exceptées InlA et RpsN1. Ceci semble normal pour RpsN1 car selon les données prédictives, le pI théorique de cette protéine est de 11,29 et ne rentre donc pas dans la gamme de séparation des strips. Par contre, InlA a un pI théorique de 5,23 et devrait donc se trouver sur le gel. Au vu de la taille importante de cette protéine (146 kDa), il est possible qu’elle n’ait pas pu sortir de la strip dans les conditions d’électrophorèse utilisées. Dans ce cas, en augmentant le temps de migration lors du SDS-PAGE ou en utilisant d’autres tensioactifs, il serait éventuellement possible de la visualiser. Un exemple de ce cas de figure est la protéine B3AT des érythrocytes. Cette protéine est hydrophobe et a une masse moléculaire importante (100 kDa).
Suivant les détergents utilisés (CHAPS, Brij96 ou dodécyl maltoside), qui permettent de solubiliser plus ou moins les protéines, la quantité de ces dernières retrouvées sur le gel 2D varie (53). Une autre hypothèse est que la méthode de sélection des spots, qui consistait à ne sélectionner que les plus fluorescents, ne permet pas de la voir. InlA peut être faiblement marquée par la cyanine, à l’instar de SlpA, mais l’abondance de cette dernière permet de la visualiser alors qu’InlA est en plus faible quantité. En vérifiant la séquence d’InlA, on peut constater la présence de lysines, ce qui laisse supposer qu’elle est bien marquée. Toutefois, il est possible que certaines protéines exposées en surface, notamment celles de taille importante et hydrophobes, ne soient pas marquées.
Les protéines très abondantes peuvent perturber la détection d’autres protéines. Par exemple, chez la souche BIA 118, SlpA est tellement abondante qu’il est impossible de distinguer les spots correspondants à DnaK ou GroEL qui se trouvent pourtant dans la même zone. Plusieurs bandes protéiques sont visibles mais l’analyse en spectrométrie de masse ne permet pas d’identifier d’autres protéines dans ce secteur.
La plupart des protéines est bien identifiée, avec des scores corrects. Cependant, certaines protéines apparaissent comme très fluorescentes alors qu’elles sont peu visibles au bleu de coomassie. Il s’agit de protéines en faible abondance qui fixent beaucoup la cyanine. Pour ces protéines, les identifications manquent de fiabilité. Globalement, les masses moléculaires
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expérimentales (M exp) correspondent aux masses théoriques (M th) donc les identifications semblent bien correspondre. Cependant, dans le spot 33, la protéine SlpA est identifiée à 113 kDa au lieu de 57 kDa. Il s’agit probablement de dimères de SlpA. En effet, le traitement au DTT et à l’iodoacétamide lors de l’équilibration des strips pourrait bien être insuffisant pour une telle abondance de protéines. Sur les gels SDS-PAGE classiques, l’échantillon est chauffé à 100°C pendant 10 min dans le tampon échantillon qui est plus dénaturant que les solutions d’équilibration, ce qui explique qu’on ne voit qu’une seule bande en 1D.
De nombreuses protéines identifiées (figure 3B) sont impliquées dans le métabolisme des acides aminés (AlaS, Asd, Cys1 et Cys2) ou dans le métabolisme carboné central (Ppdk, Pgk, Mdh, Gab, Gpm2). Plusieurs protéines chaperones (ClpC, ClpB, DnaK1, GroL, Hsp20 1 et Hsp20 2) sont retrouvées en surface. La présence de certaines d’entre elles a déjà été identifiée en surface de Lactobacillus rhamnosus GG (35). Elles sont probablement responsables du maintien de la structure des protéines de surface et leur protection contre les différents stress que la bactérie peut rencontrer.
Une autre protéine, SufB, peut aussi être impliquée dans la formation des ponts disulfures et le repliement des protéines de surface. Deux facteurs d’élongation de la transcription (Ef-Tu et Ef-Ts) sont également identifiés. Ef-Tu a déjà été identifié en surface de Streptococcus gordonii (7).
Selon les logiciels de prédiction, la majorité des protéines identifiées sont localisées dans le cytoplasme. Il est probable que certaines de ces protéines sont localisées au niveau de la membrane ou dans le cytoplasme mais qu’elles possèdent un domaine extracellulaire. C’est le cas pour AtpD, la sous unité F1 de l’ATP synthase, qui est ancrée dans la membrane mais possède un domaine extracellulaire important. Il est également possible que la bactérie sécrète ces enzymes, cela lui permettrait de ne pas avoir à effectuer toutes les réactions chimiques dans son cytoplasme. Le fait de produire des enzymes dans le milieu lui permet également de dégrader la matrice fromagère et d’absorber directement les nutriments qui lui sont le plus profitable. Il est également possible de retrouver des moonlighting proteins qui peuvent avoir une fonction bien définie dans le cytoplasme et une autre dans le milieu extracellulaire (30).
VI- La nature des composés de surface module les propriétés physicochimiques des souches
Des tests de détection des exopolysaccharides de surface par immunoagglutination ont déjà été menés au laboratoire STLO. D’après ces tests, environ 35 % des souches portent une capsule (9). L’utilisation d’un sérum anti-(1-3,1-2)-β-D-glucane de S. pneumoniae se justifie par le fait qu’une majorité des souches produisent des EPS de structure similaire. Dans le cadre de cette étude, 8 souches sur 23 (34,7 %) ont été détectées comme possédant une capsule, ce qui correspond aux résultats attendus (Figure 4A et C).
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Les potentiels zêta ont été mesurés à pH 7 car cela correspond aux conditions physiologiques rencontrées par la bactérie dans le côlon. Les mesures des potentiels zêta indiquent qu’il y a une variabilité entre les souches (Figure 3B). Plusieurs groupes de souches peuvent être observés, ce qui correspond à ce qui a déjà été observé chez Lactobacillus (58).
Les données de séparation et d’identification des protéines extractibles permettent également de définir deux profils de souches : celles qui possèdent SlpA et InlA et celles qui possèdent une capsule et LspA, avec environ 1/3 des souches qui ne sont pas classables (Figure 4C). Les souches qui portent SlpA et InlA ont un potentiel zêta inférieur à -8mV. Ces protéines ont un pI de 4,72 et 5,23 respectivement. Les mesures ayant été réalisées à pH 7, elles étaient alors fortement chargées négativement, ce qui explique potentiel zêta fortement électronégatif de ces souches. Celles qui ont une capsule exopolysaccharidique sont moins électronégatives, ce qui provient certainement du fait que les charges des composés de surface, notamment les phospholipides membranaires et les protéines, sont masquées par les polysaccharides qui ne portent pas de charges ioniques.
Conclusion et perspectives
Ces travaux sont encore préliminaires, mais s’inscrivent dans un projet de recherche ANR s’étalant sur trois ans.
Les protéines de surface extractibles de Propionibacterium freudenreichii ont été séparées et identifiées. La localisation en surface de ces protéines a été confirmée par des données de littérature pour la majorité des protéines identifiées. La protéine Cys2, qui est normalement prédite comme étant cytoplasmique, est probablement localisée en surface également car elle est aussi marquée par la cyanine et retrouvée sur les gels 2D. Les identifications des protéines fluorescentes à partir de ces gels indiquent que des protéines des voies métaboliques telles que la synthèse des acides aminés, des lipides ou bien la glycolyse sont partiellement localisées en surface de la bactérie. Des expériences de rasage des protéines exposées en surface avec de la trypsine immobilisée sur des billes d’agarose ou de la trypsine soluble sont en cours au STLO.
Les protéines qui ont une même identification présentent des tailles différentes en fonction des souches, ce qui laisse penser qu’il y a une faible conservation des gènes correspondants au sein de l’espèce. Les études de génomique comparative prévues dans ce projet ANR devraient être à même de répondre à cela. Par ailleurs une étude de transcriptomique comparative pourrait expliquer pourquoi ces mêmes protéines sont exprimées différentiellement.
Certaines protéines de surface sont impliquées dans les propriétés physicochimiques de la surface. Les protéines SlpA et InlA semblent corrélées à un potentiel zêta très électronégatif. Des tests statistiques sont prévus afin de confirmer cette tendance.
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Actuellement, un partenaire de l’ANR SURFING étudie les 23 souches afin de déterminer leur profil cytokinique, en dosant l’IL-10 et l’IL-12. Cela permettra de voir s’il existe un lien entre la présence de certaines protéines et le potentiel immunomodulateur des souches.
Cette étude a permis d’identifier des protéines qui pourront être utilisées pour l’étude des interactions entre P. freudenreichii et l’hôte. Il est prévu dans SURFING de supprimer ou de surexprimer ces protéines pour valider ces hypothèses par rapport à l’immunomodulation. En effet, il a été démontré que, chez des souches de P. freudenreichii immunorégulatrices, l’extraction de la S-Layer induisait une diminution de la production de l’IL-10 (anti-inflammatoire) par les PBMC (16). Il est également prévu de tester l’effet immunomodulateur des protéines purifiées sur des cellules épithéliales HT-29.
L’utilisation de la microscopie à force atomique pourrait donner des indications intéressantes quant au comportement des souches vis-à-vis de l’épithélium intestinal. En effet, cet appareil permet de mesurer les forces d’attraction ou de répulsion à la surface des bactéries. Cela permettrait également de tester l’impact de la délétion d’une protéine intéressante sur les propriétés physicochimiques de la surface.
En comprenant mieux l’activité anti-inflammatoire d’une protéine ou d’une combinaison de protéines purifiées, il serait possible de sélectionner une ou plusieurs souches qui auraient les séquences génétiques d’intérêt comme ingrédients dans des matrices alimentaires. Si la protéine seule démontre une efficacité suffisante, il faudrait développer des procédés permettant sa production et sa purification à grande échelle. Cela permettrait de l’utiliser dans des compléments alimentaires dans le but de réguler l’inflammation.
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