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République Algérienne Démocratique et Populaire
Ministère de !'Enseignement Supérieur et de la Recherche Scientifique
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Université Mohammed Seddik Benyahia - Jijel -
Faculté des Sciences de la Nature et de la Vie Département : Microbiologie Appliquée et
Sciences Alimentaires
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Mémoire de fin d'études
En vue de l'obtention du diplôme : Master Académique en Biologie Option : Microorganismes & Pathogénicité
r Etude de la charge microbienne des végétaux commercialisés
r
-
dans le marché locale : cas de la laitue
Membre de Jury
Président: M". Laib Esaid
Examinatrice : M18. Boucbefra Amina Encadreur : M". Boudjerda Djamel
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Année Universitairê2015-2016 ---
Présenté par :
Mettai Imane Ramoul Imene
Numéro d'ordre !bibliothèque) :
Liste des figures Liste des tableaux Liste des photos Liste des abréviations
Introduction... 01
Partie 1. Synthèse bibliographique 1.1. Les végétaux 1.1.1. Définition des végétaux... 02
1.1.2. Classification des végétaux... 02
1.1.3. Les végétaux consommés crus... 02
1.1.3.1. Les fruits . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 02
1.1.3.1.l. Définition... 02
1.1.3.1.2. Classification... 03
1.1.3.2. Les légumes... 03
1.1.3.2.l. Définition... 03
1.1.3.2.2. Importance et la valeur nutritionnelle des légumes dans l'alimentation humaine 03 1.1.3 .2.3. Classification . . . .. ... . . ... . . . .. . . ... ... . . ... ... 05
1.1.3.2.3.1. Les légumes à feuilles... 05
1.1.4. La laitue... 05
1.1.4.1. Origine et définition... 05
1.1.4.2. Les variétés cultivés... 06
1.1.4.3. Les facteurs déterminants la qualité de la laitue... 07
1.1.4.4. Quelques maladies touchant la laitue... 07
1.1.4.4.1. Les maladies fongiques... 07
1.1.4.4.3. Les maladies virales... 08
1.1.5. Les fruits et les légumes en l'Algérie... 08
1.2. La charge microbienne des végétaux consommés crus . . . ..•....•..••...•••.•...• .. 09
1.2.1. Les facteurs influençant la croissance et la survie des microorganismes . . . .. 09
1.2.2. Les sources de la contamination des fruits et des légumes . . . 10
1.2.2.1. Les eaux utilisées... 10
1.2.3. Mesures pour la réduction de la charge microbienne... 11
1.2.4. Les différents germes de la contamination des légumes et des fruits... 11
1.2.4.1. Les champignons... 11
1.2.4.2. Les virus... 12
1.2.4.3. Les bactéries... 12
1.2.5. Principaux bactéries pathogènes et toxinogènes pour l'homme .. . . .. .. .. . . .. .. .. .. ... .. 12
1.2.5.1. Les entérobactéries et les autres bacilles à Gram négatif non exigeants... 12
1.2.5.1.1. Escherichia coli... 12
a. Définition et historique... 12
b. Classification . . . ... ... ... ... ... . ... ... . .. . . . ... .. 13
c. Les Aliments associés ... . 13
d. Les Facteurs de risque . ... .. . . ... . . . ... . . . ... .. ... ... 13
1.2.5.1.2. Salmonella... 14
a. Définition et Historique... 14
b. Classification... 14
c. Salmonellose humaine... 15
1.2.5.1.3. Shigella... ... ... 15
a. Définition... 15
b. Classification et caractères... 15
1.2.5.1.4. Klebsiella... .. ... ... ... ... ... ... ... 15
a. Définition . . . 15
b. Classification et caractères... . . . .. 16
1.2.5.2. Les coques à Gram positifs... 16
1.2.5.2.1. Les Staphylocoques... 16
1.2.5.2.2. Toxi-infection alimentaire... 16
Partie II : Matériel et méthodes
But de travail. . . 18
11.1. Matériel. . . ... . . . ... . . ... . ... ... . .. . . .. . . . .. . . 18
11.1.1. Milieux de cultures... 18
11.1.1.1. Milieux de cultures solides... 18
11.1.1.2. Milieux liquides... 18
11.1.1.3. Les produits chimiques et réactifs.... . . .. 19
11.1.1.4. Les Appareillages... 19
11.1.1.5. Les disques des antibiotiques... 19
11.4. Méthodes... 19
11.5. 1.Les analyses microbiologiques... 20
11.5.1. Dénombrement... 20
11.5.2. Recherche des germes totaux aérobies... 20
11.5.2.1. Recherche des entérobactéries pathogènes... 21
A. Enrichissement en milieux sélectif. . . 21
B. Isolement sur gélose sélective... 22
C. Purification... 22
D. Identification... 22
E. Examen macroscopique... 22
F. Examen microscopique... 22
G. Identification biochimique... 22
11.5.3. Test d'hémolyse . . . 26
11.5.4. Recherche des coques Gram positifs du genre Staphylococcus... ... 27
A. Enrichissement en milieu sélectif... 27
B. Isolement... 27
C. Purification...... 27
D. Identification... 27
E. Identification microscopique... 27
F. Recherche de la catalase... 27
11.5.5. Test de sensibilité aux antibiotiques... 28
ill.1. Les analyses microbiologiques... 30
ill.1.1. Recherche des germes totaux aérobies ... 30
III.1.2. Isolement, purification et identification des entérobactéries pathogènes . . . . . . . . . . . . . 31
ill.l.3. Teste d'hémolyse des bactéries à Gram négatifs isolées... 35
ill.1.4. Recherche des bactéries pathogène à Gram positif: cas de genre Staphylococcus 35 III.l.5. Teste de sensibilité aux antibiotiques... 37
ill.l.5.l. La sensibilité des entérobactéries pathogènes isolées... 37
111.1.5.2. La sensibilité des coques Gram positif de genre Staphylococcus... .. 38
Discussions générale... 40
Conclusion... 41 Références bibliographiques
Annexes
Figure 01 : Deux types de laitue au stade récoltent : à gauche laitue beurre, à droite laitue 06 batavia (Photo Maisonneuve)
Figure 03 : Symptôme de Sclérotiniose sur laitue 08
Figure 04 : API20E 26
Figure 13 : Profil d'identification des souches J5, T3 (Staphylococcus) 36
Tableau 1 : La valeur nutritionnelle des légumes 04 Tableau II : Résumé de la distribution des échantillons selon les régions 20 Tableau III : Représente la moyenne de la charge microbienne globale des 30 échantillons selon les régions et les résultats de test d' ANOV A
Tableau VI : La fréquence des différentes souches isolées à partir des légumes à 31 feuilles (la laitue)
Tableau V: Identification des souches isolées 32
Tableau IV: Résultats de l'antibiogramme réalisé pour les souches isolées 37 Tableau IIV: Résultats de l'antibiogramme des souches de Staphylococcus 38
Photo 02 : Photos de laitues de 3 cultigroupes.a: laitue beurre et b : laitue batavia 07 (Photos de L. Jean). C : feuille de chêne et d : laitue romaine (Photo de
Maisonneuve)
Photo 05 : Aspect des colonies de Salmonella arizonae 33
Photo 06 : Aspect des colonies de Shigella spp 33
Photo 07 : Aspect des colonies d' E. coli 33
Photo 08 : Aspect des colonies de Klebsiella spp 33
Photo 09 : Aspect des colonies d' Enterobacter spp 33
Figure 10: Résultats d'observations microscopiques après la coloration de Gram 33 des Entérobactérie
Photo 11 : Représentant les résultats du test d'hémolyse 35
Photo 12 : Aspect des colonies sur gélose Chapman 36
Photo 14: Résultat de !'antibiogramme pour les souches isolées 38
Photo 15 : Montre les zones d'inhibition pour les souches isolées du genre 39
Staphylococcus
Introduction
Les fruits et légumes constituent une part essentielle du régime alimentaire humain. Au cours des vingt dernières années la recherche en nutrition humaine a prouvé qu'un régime équilibré, riche en fruits et légumes, garantit une bonne santé et peut réduire les risques de certaines maladies (Meng et Doyle,2002).
La laitue est un légume populaire dans le monde avec une production de plus de 21 millions de tonnes cultivées chaque année. Malheureusement, plusieurs difficultés sont présentes dans le domaine de la laitue car elle peut véhiculer des microorganismes, si les conditions de l'hygiène ne sont pas respectées (Thicoïpé, 1997).
Bien que la microflore de cet aliment soit dominée par des bactéries d'altération, des levures et des moisissures susceptibles de nuire aux qualités organoleptiques et commerciales de ces produits, de nombreuses bactéries pathogènes, des parasites et des virus ont également été isolés à partir de la laitue (Meng et Doyle ,2002).
On a choisi l'étude de la partie aérienne de la laitue pour identifie la présence ou l'absence de la charge bactériennes pathogènes à la surface qui peut provoquer des risques sanitaires. Ainsi que l'évaluation de la qualité hygiénique de cet aliment.
Notre travail est divisé en deux parties, une partie bibliographique et une partie expérimentale qui a pour objectif principal (i) le dénombrement de la flore de surface totale, (ii) l'isolement et l'identification des germes pouvant être véhiculés et transmis passivement aux consommateurs de la laitue et qui largement cultivée et utilisées dans la région de Jijel et même dans l'ensemble des régions du territoire national et en fin (iii) déterminer la sensibilité des germes isolées envers les molécules d'antibiotiques.
A la lumière des résultats retrouvés, ce travail devrait répondre aux questionnements relatifs à
!'hygiènes et la contamination des légumes et fruits consommés crus par des bactéries qui pourront bien être pathogènes pour l'homme et les animaux.
Page 1
Partie 1
Synthèse
bibliographique
1.1. Les végétaux
1.1.1. Définition des végétaux
Le terme végétal ou plante fait référence à l'ensemble des êtres vivants comprenant des racines, des tiges, des feuilles et généralement des fleurs, dont la matière est composée de Cellulose.
Les végétaux sont capables de produire eux-mêmes des sucres, grâce à la photosynthèse, en utilisant des éléments minéraux et gazeux (Roland, 2008).
1.1.2. Classification
Chez les végétaux, la classification se fait en fonction de leur structure cellulaire et de leur complexité d'organisation, ce qui permet de distinguer:
- les végétaux procaryotes : bactéries et cyanobactéries
-les végétaux eucaryotes: chez lesquels on distingue trois grands types d'organisation .
./ Les thallophytes (algues, lichens, champignons) caractérisées par un thalle, appareil végétatif peu différencié .
./ Les bryophytes (mousses et hépatiques) où l'appareil végétatif commence à se différencier en tige et feuille .
./ Les tracheophyta (ou cormophytes, «végétaux supérieurs ») avec leur appareil végétatif bien différencié en tige, feuille et surtout vaisseaux conducteurs de sève (pWoème et xylème) (Espitalier ,2010).
1.1.3. Les végétaux consommées crus
Les végétaux utilisés comme aliments. Une façon simple de classifier les légumes consiste à les regrouper selon la partie de la plante qui est consommée. Les fruits sucrés des plantes constituent une autre catégorie d'aliments (fruits) (Corbeil et Archambault ,2004).
1.1.3.1.les fruits 1.1.3.1.1. Défmition
Les fruits sont définis d'une façon générale comme « parties d'une plante qui soutiennent des graines ». Une telle définition inclut les fruits tels que le citron, les pommes et des poires, et les fruits composés tels que les baies. La définition inclut des tomates, des olives, des piments, le poivron,
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l'aubergine, le gombo, des pois, des haricots, la courge, bien que pour des buts culinaires, un certain nombre de ces fruits soient classifiés comme légumes ou épices (Les tomates, les olives, les concombres, et les tandis que l'aubergine, le gombo, les pois, les haricots, la courge, les piments, et le poivron) (Roberts et aL,2005).
1.1.3.1.2. La classification des fruits
Il est maintenant nécessaire de distinguer deux types de fruits :
• D'une part, les fruits à croissance hormonale naturelle « climatériques » comme les tomates, les pêches et autre fruits, capables de générer l'éthylène, l'hormone requise pour le mûrissement même lorsque le fruit est détaché de la plante mère ; ces fruits sont autonomes du point de vue du mûrissement et les changements dans le goût, l'arôme, la couleur et la texture.
• D'autre part, les fruits à croissance végétale directe« non climatériques» comme les poivrons, les citrons et autres légumes où la maturité commerciale est obtenue seulement sur la plante mère (Andrés et Lopez Camelo, 2007).
Il y a quelques fruits climatériques qui se stockent pendant de longues périodes. En revanche, certains fruits non climatériques ont tendance à avoir une durée de vie plus longue avec moins de pertes post-récolte pendant le stockage et le transport, mais les fruits non climatériques qui sont très périssables sont également trouvés (par exemple fraise) (Saladié et al.,2015).
1.1.3.2. Les légumes 1.1.3.2.1. Déf"mition
Le terme « légume » désigne un ensemble de végétaux de natures botaniques différentes : des feuilles, des racines, des fruits, des tiges, des fleurs, que l'Homme s'est approprié, a cultivé, travaillé, et consommé. La majorité des populations consomment des légumes.
Les légumes représentent une part importante, à la fois quantitativement et qualitativement, de notre alimentation (Depezay ,2007).
1.1.3.2.2. L'importance et la valeur nutritionnelle des légumes dans l'alimentation humaines Les légumes tiennent une place importante dans l'alimentation humaine. Selon le FAO, pour un régime alimentaire équilibré, la consommation de légumes doit être de200 g/pers/j, soit environ 75 kg/pers/an (Abak, 1992).
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Actuellement, les maladies non transmissibles (MNT), notamment les maladies cardiovasculaires, les cancers, l'obésité et le diabète de type 2, provoquent chaque année plus de décès que toute autre cause de mortalité. Quatre facteurs dans l'épidémiologie de ces maladies ont une importance immense en santé publique: la mauvaise alimentation, le manque d'exercice physique, le tabac et l'alcool (FAO/OMS, 2014). Les nutritionnistes recommandent de manger au moins cinq portions de fruits et légumes par jour afin de se protéger au maximum contre l'apparition de diverses pathologies chroniques (Nwankwo et al.,2015).
Les fruits et les légumes fournissent une source d'énergie abondante et bon marché, des substances nutritives de croissance, des vitamines et des minéraux (Tableau 1). Leur valeur nutritive est supérieure lorsqu'ils sont frais, mais ce n'est pas toujours possible d'en faire une consommation immédiate (James et Kuipers ,2003).
Tableau 1 : la valeur nutritionnelle des légumes (Dupin et al., 1992).
Les sources Légumes
Teneur en eau 90 % en moyenne
Les vitamines hydrosolubles Vitamine C (choux, légumes a feuilles, tomates), provitamine A ou bêta-carotène (partie colorée des plantes : légumes a feuilles vertes, carottes ... ) et vitamines du groupe B.
Potassium. Calcium (surtout dans les choux), du magnésium, Les minéraux du fer et du cuivre (légumes a feuilles type épinard), du soufre (choux, oignons, ail, poireaux, navets, radis) et de nombreuses autres matières minérales.
Les fibres Les fibres des plantes se composent surtout de cellulose, d'hémicellulose et de matière pectique.
Les glucides modérés 1 à 6 % pour les parties aériennes des plantes (salades, épinards, courgettes, tomates ... ) et 9 % environ pour les racines (carottes, céleri ... ).
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1.1.3.2.3. Classification des légumes
Il existe de multiples distinctions entre légumes, selon les espèces, les parties utilisées ou les modes alimentaires. De nos jours, la distinction d'après les organes consommés est renforcée par les préoccupations d'ordre sanitaire, concernant les résidus de pesticides ou l'accumulation d'éléments toxiques. On distingue les légumes feuilles et légumes fleurs des légumes fruits, des légumes tiges, racines, tubercules ou bulbes (Kahane et aL,2005).
1.1.3.2.3.1.les légumes à feuilles
Le terme « légumes feuilles » comprend non seulement les légumes cultivés pour la feuille, mais également des plantes spontanées de brousses ou de foret, des plantes adventices, ou encore des plantels vivrières dont on consomme la feuille. Le terme « légumes feuilles « en globe donc une vaste gamme de végétaux (Colin et Heyd ,1991).
Les légumes feuilles jouent un rôle important dans les régimes alimentaires de toutes les populations du monde (Kahane et al.,2005).
1.1.4. La laitue
1.1.4.1. Origine et Définition
La laitue serait d'origine méditerranéenne et sa découverte serait survenue avant J.-C. La laitue romaine aurait été introduite en France en 1389. Ensuite, sa culture se serait poursuite en Europe du Nord, et en Amérique du Nord, puis en Australie vu les nombreuses croisières européennes. On peut aussi retrouver des laitues en Asie, en Afrique et en Amérique du Sud (Thicoïpé ,1997 ; Ryder, 1999).
La laitue (Lactuca sativa) est une plante qui appartient à la famille des Astéracées (ex composées), division des magnoliophytes, et la classe des magnoliopsides (Pitrat et Foury, 2004).
Le genre Lactuca est très vaste, avec plus de 1 OO espèces recensées à travers le monde, Il est caractérisé par la présence de « lait », le lactarium, liquide blanc collant qui s'écoule des blessures des feuilles ou tiges, qui lui a donné son nom. Toutes les Lactuca ont des feuilles sur les tiges florales, des capitules pauciflores (7-15 fleurons) à fleurs toutes ligulées (pétales soudés). Elles sont toutes diploïdes et en majorité autogames. Néanmoins, la pollinisation croisée n'est pas totalement exclue (Maisonneuve
et al.,1999).
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Lactuca Sativa est une plante herbacée annuelle avec deux phases bien distinctes :
- La phase végétative, formant une pomme plus ou moins fermée, est le stade utilisé pour la commercialisation (Fig. 01). Un cycle de culture est effectué entre 10 et 15 semaines selon la variété et la région de production.
Figure 01 : Deux types de laitue au stade récolte : à gauche laitue beurre, à droite laitue batavia.
- La phase reproductrice, au cours de laquelle la tige centrale s'allonge(montaison), aboutit à la floraison et à la production de graines. La montaison est plus ou moins rapide selon les conditions climatiques et les génotypes. Elle est favorisée par des jours longs et de hautes températures. A la fin de la montaison, les plantes peuvent mesurer de 1 àl ,Sm de haut et portent de nombreux capitules de 10 à 15 fleurons dont le développement est quasi synchrone. L'inflorescence ne s'ouvre qu'une fois, le matin, après le lever du soleil. A l'écartement des ligules, le style s'allonge et le stigmate se charge de pollen engendrant l'autopollinisation de la fleur. Si les conditions climatiques sont bonnes, dans les minutes suivantes, le capitule se referme et l'unique ovule de chaque fleuron est fécondé. La graine, un akène nu, va grossir et reste enfermée dans les bractées sur la plante (Maisonneuve et aL,1999).
1.1.4.2. Les variétés cultivées
La laitue est la première des salades consommées en l'Algérie sous le vocable laitue se retrouvent divers cultigroupes commerciaux définis selon la forme de la pomme, de la forme et de la texture des feuilles:
-Les laitues pommées comprenant les laitues beurres appelées couramment laitue, et les laitues batavia - Les laitues à couper où l'on trouve les variétés« Feuille de chêne» ou« Lollo rossa».
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- Les laitues romaines qui présentent une pomme allongée.
- Les laitues grasses qui sont des laitues pommées à feuilles épaisses, assez craquantes et à nervures pennées.
- Les laitues tige ou laitues asperges ou celtuce surtout consommées en Asie (Pitrat et Foury , 2004).
Figure 02: Photos de laitues de 3 culti groupes. a: laitue beurre et b: laitue batavia (Photos de L. Jean).
C : feuille de chêne et d : laitue romaine (Photos de B. Maisonneuve).
1.1.4.3. Les facteurs déterminants la qualité de la laitue
La qualité de la salade (laitue) a toujours été un enjeu important, notamment parce qu'il s'agit d'un légume consommé en frais et non stockable. La fraîcheur, la qualité visuelle, le calibre, le choix de la variété étaient et sont toujours au centre des préoccupations des différents acteurs de la filière
(Navarrete et al.,2010).
1.1.4.4. Quelques maladies qui touchant la laitue 1.1.4.4.1. Les maladies fongiques
• Sclérotiniose
Sur salades et notamment laitue, les attaques, causées principalement par les espèces Sclerotinia.
Sclerotiorum et Sclerotinia. Minor, occasionnent une pourriture sur les parties de la plante au contact du sol, notamment les feuilles sénescentes, pour finalement envahir d'autres feuilles et le collet. Elles aboutissent en général à une destruction totale de la plante (Bardin et al., 2013).
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Figure 03: Symptôme de sclérotiniose sur laitue.
1.1.4.4.2. Les maladies bactériennes
• Pourriture du pied de la laitue (Pseudomonas fluorescens = Pseudomonas marginalis)
Les symptômes de cette maladie sont notamment l'apparition d'une pourriture noire à verte et ferme, qui peut se propager depuis les tiges infectées, le long des nervures des feuilles inférieures. La maladie peut même gagner les racines. L'infection par des organismes secondaires peut entraîner le flétrissement ou l'affaissement de la plante (Elmhirst ,2006).
1.1.4.4.3. Les maladies virales
• Mosaïque de la laitue (Jlirus de la mosaïque de la laitue, LMV)
Virus de la mosaïque de la laitue (LMV) est l'agent causal de la laitue mosaïque, la maladie virale la plus dévastatrice de la laitue (Lactuca saliva) dans le monde. LMV appartient au genre Potyvirus, au sein de la famille Potyviridae (Krause-Sakate et al., 2002).
Ce virus peut avoir des répercussions importantes sur la taille et la qualité de la laitue (Elmhirst ,2006).
1.1.5. Les fruits et légumes en l'Algérie
La consommation des légumes et des fruits a beaucoup augmenté en Algérie à la suite de l'essor démographique et à la relative amélioration des niveaux de vie (Baci ,2000).
La production algérienne de fruits et légumes est faible au regard des potentialités du pays.
Bien qu'il n'existe aucun chiffre précis, on peut estimer que globalement, !'Algérien consomme annuellement 1 OO kg de fruits, 1 OO kg de pommes de terre et 150 kg de légumes.
Malgré les réformes qui se succèdent depuis 40 ans. La production algérienne peut être estimée à 4 millions de tonnes de fruits et à plus de 10 millions de tonnes de légumes. La faible productivité du secteur des fruits et légumes en Algérie est imputable aux conditions climatiques et à la désorganisation de la filière (Anonyme, 2015).
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I .2. La charge microbienne des végétaux consommés crus
La contamination des végétaux incriminés lors des épidémies s'effectue souvent avant leur récolte bien que des contaminations secondaires aient également été rapportées. De plus, certaines transformations, comme la germination, peuvent favoriser la multiplication des bactéries pathogènes potentiellement présentes dans les produits et augmenter le risque d'apparition d'épidémie, surtout lorsqu'elles sont effectuées à une échelle industrielle (Loukiadis ,2012).
1.2.1. Les facteurs qui influençant la croissance et la survie des microorganismes
~ Les microorganismes épiphytes
De nombreux microorganismes des légumes se développent pendant le stockage, même en conditions réfrigérées, ce qui concorde avec la forte proportion de microorganismes psychrotrophes trouvés dans plusieurs études (Szabo et al.,2000).
~ Mécanismes de défense des végétaux
Il existe à la fois des barrières contre les infections et des barrières induites en réponse aux infections.
Les enveloppes sont les premières barrières contre les microorganismes (cuticules, épidermes) la résistance des légumes aux infections peut s'expliquer par la présence de composés antimicrobiens préformés (composés phénoliques)
A noter également la synthèse de petites molécules appartenant à des groupes chimiques variés (phénoliques, terpénoïdes, alkaloïdes ), avec des propriétés antimicrobiennes appelées phytoalexines.
Dans beaucoup de légumes, la capacité de résistance aux microorganismes d'altération décroît pendant le stockage (Nguyen-the et Carlin, 2000).
Bien que le pH de nombreux légumes soit favorable à la croissance des bactéries pathogènes. Les levures et les moisissures ont un avantage compétitif sur les bactéries parce qu'elles sont capables de pousser dans les gammes de pH les plus faibles caractéristiques de nombreux produits (2.2-5.0) (Beuchat, 2002).
L'infiltration de pathogènes à l'intérieur des fissures, crevasses, et espaces intercellulaires des fruits et légumes a été démontrée par de nombreux chercheurs. L'infiltration de tomates par Salmonella et Elwinia carotovora, ainsi que celle de laitue, de pommes et d'oranges par E. co/i 0157:H7 ont été décrites. L'infiltration de pathogènes à l'intérieur des tissus des fruits et légumes dépend de la
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température, de la durée, de la pression et de la nature hydrophobe de la surface du produit (Beuchat, 2002).
1.2.2. Les sources de contamination des fruits et des légumes Les sources de contamination des fruits et des légumes sont :
./ Les bactéries pathogènes peuvent contaminer les fruits et légumes à tout moment dans tout le système de production .
./ Le sol, les matières fécales, l'eau d'irrigation, l'eau utilisée pour appliquer des fongicides et des insecticides, de la poussière, des insectes, insuffisamment composté fumier, animaux sauvages et domestiques, et la manipulation humaine, matériel de récolte, des conteneurs de transport, les insectes, l'eau de rinçage, de la glace, les véhicules de transport, et de l'équipement de traitement, les métaux lourds .
./ L'hygiène des travailleurs devraient être appliquées, et la gestion des déchets humains à sites de production doivent respecter les lois locales (Buck et al., 2003).
Parmi ces sources de contamination, les plus dangereux pour les fruits et légumes et même pour la santé humaine sont :
1.2.2.1. Les eaux utilisées
Les eaux utilisées sur les exploitations agricoles servent à de nombreux emplois, qu'il s'agisse de l'irrigation, de la dispersion des pesticides et des engrais, du refroidissement des cultures, des traitements antigel, ou encore, après la récolte. Ces eaux peuvent être la source d'une contamination directe et propager dans les cultures, sur les installations agricoles ou le long des filières de transport des micro- organismes jusque-là contenus dans un endroit limité de l'exploitation. Toute eau au contact de fruits et légumes crus est une source potentielle d'agents pathogènes (Anonyme ,1998).
);>- Risques microbiens liée à l'irrigation
L'eau peut propager de nombreux micro-organismes comme certaines souches pathogènes d'Escherichia coli, de Salmonelle, de Vibrio cholerae, de Shigella, de Cryptosporidium parvum, de Giardia lamblia, de Cyclosporacaye tanensis, de Toxoplasma gondii, ou encore les virus de l'hépatite A.
Selon la nature de l'agent pathogène, une contamination même mineure peut résulter en une intoxication alimentaire (Anonyme ,1998).
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1.2.3. Mesures pour la réduction de la charge microbienne
~ Cuisson
La cuisson des aliments est un excellent moyen pour réduire leur charge microbienne. Cependant, une cuisson incomplète n'est pas suffisante pour éliminer d'éventuelles bactéries pathogènes, notamment les E. co/i et les salmonelles qui pourraient s'y trouver (Mssa, 2007).
~ Réfrigération
La réfrigération réduisant de nombreuses espèces bactériennes, en arrêtant la croissance, est un bon moyen de conservation des aliments qui est d'autant plus efficace que la température est basse. Il est donc recommandé aux consommateurs de vérifier que la température est d'au plus 4°C dans la zone la plus froide de leur réfrigérateur (Carpentier et al., 2007).
~ Désinfection
Plusieurs molécules (hypochlorite de sodium, ozone, acide peracétique) sont susceptibles d'être utilisées comme auxiliaire technologique pour la désinfection des végétaux (Fukuyama et al, 2009) et paraissent efficaces. Ces usages d'auxiliaires technologiques sont soumis à autorisation et certains d'entre eux ont fait l'objet d'avis de l'Afssa. d'obtenir 2,4 réductions décimales d'E. Coli 0157 :H7 durant une immersion de 60 ou 90 secondes.
Le chlore est efficace sur Norovirus lors du lavage désinfection des salades (80 mg/l) si les virus sont en suspension dans l'eau (Fukuyama et al, 2009).
1.2.4. Les différents germes de la contamination des légumes et des fruits
Les aliments crus que nous consommons peuvent contenir des substances ou des agents pathogènes dangereux pour la santé (Buisson et al.,2008).
1.2.4.1. Les champignons
Les champignons appartiennent au règne Fungi.Ils ont la similitude et la différence des bactéries et des cellules végétales. A l'opposé des plantes les champignons ne contiennent pas de chlorophylle.
Les champignons ont une ergostérine dans sa membrane cytoplasmique au lieu de choléstérine qui se trouve dans les membranes humaines et animales (Zézérov, 2002).
A part quelques rares exceptions, les champignons parasites des végétaux crus sont des microorganismes dont les dimensions des spores se situent entre 10-1 OO microns (Corbaz ,1990).
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./ Les moisissures et les levures
Les mycotoxines sont les métabolites secondaires toxiques produits par mycètes filamenteux généralement des moisissures qui peuvent souiller des récoltes avec les conséquents impacts sur la santé publique et l'économie agricole (Baquiio ,2012)
1.2.4.1.1. Les virus
Au cours de la production, l'irrigation des cultures de fruits et légumes avec de l'eau de mauvaise qualité sanitaire est un facteur important de contamination virale (Morin et Picoche ,2008).
Les virus, dispersés dans l'environnement via les excréments humains, contaminent d'abord l'eau, puis certains aliments (Buisson et al.,2008).
1.2.4.1.2. Les bactéries
Les microorganismes des végétaux, mobiles ou immobiles telles que les bactéries sont des êtres unicellulaires qui possèdent les éléments essentiels à la vie cellulaire, elles se reproduisent par division transversale ou par spores (Pierre et Curie M, 2003).
1.2.5. Principaux bactéries pathogènes et toxinogènes pour l'homme 1.2.5.1. Les entérobactéries et autres bacilles à gram négatif non exigeants
./ Classification et déf"mition
Les entérobactéries sont une famille très hétérogène pour ce qui est de leur pathogénie et de leur écologie. La famille des Enterobacteriaceae est constituée de genres bactériens qui sont rassemblés en raison de leurs caractères bactériologiques communs :
- bacilles à Gram négatif (2 à 4 microns de long sur 0,4 à 0,6 microns de large) - mobiles avec ciliature péri triche ou immobiles
- poussant sur milieux de culture ordinaires - aérobies - anaérobies facultatifs
- fermentant le glucose avec ou sans production de gaz - réduisant les nitrates en nitrites
- oxydase négatif (Pierre et Marie, 2003).
1.2.5.1.1. Escherichia coti a. Déf"mition et Historique
Le genre Escherichia a été dénommé d'après le médecin allemand theodor escherich qui, en 1885, publia ses travaux sur un court bâtonnet à gram négatif aux extrémités arrondies, présent dans les matières fécales et l'intestin d'enfants (Maioil, 2003).
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• 1904: isolement de cette même bactérie dans un cas d'infection urinaire
• 1919: Castellani et Chalmers lui donnent son nom définitif en hommage à EschericH, Escherichia est ensuite devenu le genre-type de la famille des Enterobacteriaceae (Cohen et Karib ,2006).
E. coli mesure 2 à 3 µm de long et 0,6µm de large, c'est la bactérie là mieux étudiée et l'organisme expérimental de choix pour beaucoup de microbiologistes (Nataro, Kaper ,1998).
E. coli sont également fréquemment trouvés dans différents environnements et/ou centres serveurs secondaires alternatifs, tels que les tissus végétaux. Le style de vie de E. coli aux plantes est mal compris et a des implications potentielles pour la sûreté de nourriture (Angeles Dublan et aL, 2014; Cohen et Karib ,2006).
b. Classification
Actuellement, les souches impliquées dans des infections intestinales chez l'homme sont classées en six pathotypes : les EPEC (pour Enteropathogenic E.coli), les EHEC (Enterohaemorrhagic E.coli), les ETEC (Enterotoxigenic E. coli), les EIEC (Enteroinvasive E.coli), les EAEC (Enteroaggregative E.coli) et les DAEC (Diffusely adherent E. coli).En principe, ces pathovares sont à l'origine d'infections extra- intestinales. Ces souches ont récemment été regroupées sous le terme de ExPEC (pour Extra-intestinal pathogenic E. coli) (Russo et Johnson ,2000).
c. Aliments associés
Les fruits et les légumes crus et d'une façon minimum transformés contribuent de manière significative au fardeau de la maladie portée par les aliments. Tandis que l'introduction des agents pathogènes peut se produire à n'importe quelle étape de production par la consommation, contamination de pré récolte des verts feuillus a été identifiés dans un certain nombre de manifestations récentes.
(Moyne et a/.,2013).
d. Facteurs de risque
Des flambés de TIAC à EHEC sont de plus en plus fréquemment associées à la consommation de fruits et de légumes, la contamination pouvant être due au contact avec les déjections d'animaux domestiques ou sauvages, à un stade ou à un autre de la culture ou de la manipulation. La transmission hydrique a été signalée, à la fois par l'eau de boisson et au cours d'activités récréatives. Le contact interpersonnel est un mode important de transmission par la voie féco-orale. Le portage asymptomatique a été signalé, on ignore cependant la proportion des porteurs sains. (Cohen et Karib ,2006)
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1.2.5.1.2. Salmonella a. Déf"mition et Historique
Salmonella est une bactérie mésophile qui appartient à la famille des Enterobacteriaceae. Ce genre est caractérisé par des bacilles à coloration Gram-négative, non sporulant, la plupart du temps doués d'une mobilité propre grâce à des flagelles péri triches. La taille des bâtonnets varie entre 2 et 5 µm de longueur sur 0,7 à 1,5 µm de largeur. Ils sont aéro-anaérobies, réduisent les nitrates en nitrites, peuvent utiliser le citrate comme seule source de carbone, fermentent le glucose mais pas le lactose ni le sucrose et produisent du gaz à partir du glucose (sauf Salmonella Typhi) (Korsak et al.,2004)
Les salmonelles sont des bactéries pathogènes responsables des fièvres typhoïde et paratyphoïde et de gastroentérites qui constituent un problème très important en santé publique dans le monde (Virlogeux-Payant ,2012)
- En 1820, Bretonneau montra la contagiosité de la fièvre typhoïde qu'il appelait alors d' othiénentérite.
- En 1880, Eberth observa le premier le bacille dans les organes d'un malade mort de typhoïde.
- En 1884, Graffky réussit la culture de ce bacille.
- En 1896, Widal montra que le sérum de malades atteints de fièvre typhoïde agglutinait des cultures du bacille d'Eberth. C'était là le premier séro-diagnostic, technique dont on connaît le succès ultérieur pour l'aide au diagnostic des maladies infectieuses.
- En 1930, Kauffmann et White développèrent une classification des bactéries voisines du bacille d'Eberth basée sur l'identification de leur antigène.
- En 1939, Reilly montra le rôle du système neuro-végétatif dans la pathogénie de la typhoïde (Avril et al.,1992).
b. Classification
Le genre salmonelle est divisé en trois espèces, salmonella bongori et, salmonella subterranea, salmonella enterica (Joffin et joffin., 2010), et le dernier est divisé en six sous-espèces :
./ 1 pour un sérovar de S. enterica subsp. enterica . .,/ II pour un sérovar de S. enterica subsp. salamae ./ ma pour un sérovar de S. enterica subsp. Arizonae ./ IIlb pour un sérovar de S. enterica subsp. Diarizonae ./ IV pour un sérovar de S. enterica subsp. Houtenae
./ VI pour un sérovar de S. enterica subsp. Indica (Grimont, Weill ,2007).
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L'agglutination propriétés du 0 somatique, du H flagelle, et du Vi capsulaire des antigènes sont employés pour différencier plus de 2600 sérologiquement salmonelles distinctes (V elge et al.,2012).
c. Les salmonelloses humaines
Les Salmonelloses représentent toutes les maladies engendrées par les salmonelles. Chez l'homme, elles sont majoritairement de deux types : les gastro-entérites et les fièvres typhoïdes(S.typhi) ou paratyphoïdes (S.paratyphi A, B, C) (Virlogeux-Payant et al.,2012 ; Joffin et Joffm, 2010)
1.2.5.1.3. Shigella a. Défmition
C'est une bactérie Gram(-), anaérobie facultative. Dotée de propriétés invasives en particulier pour les cellules épithéliales de l'intestin (Zuliani, Garry, 2004), très proches de Escherichia coli .. Les Shigelles sont des bactéries strictement humain (Berche et al., 2003).
b. Classification et caractères
Le genre Shigella est divisé en 4 espèces, S. dysenterie, S.boydii, S.sonnei, S.flexneri. Toutes pathogènes pour l'homme. Elles sont responsables de la dysenterie, de gastro-entérites et diarrhées (Bourgereois ,1999).
Ces Shigellose sont habituellement transmis par inter contamination humaine, par des malades ou des porteurs chroniques elles peuvent aussi se transmettre par consommation de l'eau polluée ou des végétaux crus qui n'ont pas subi de traitement. La laitue a été identifiée comme source de plusieurs épidémies de Schigellose dues à S. Sonnei (Bourgereois ,1999).
1.2.5.1.4. Klebsiella a. Défmition
Les Klebsiella sont des bactéries très répandues dans la nature (l'eau, le sol, les végétaux, la flore fécale des animaux), sur la peau, les muqueuses et surtout les voies respiratoires supérieures de l'homme provoquant ainsi des pneumonies mortelles c'est pourquoi Friedlander les a appelés pneumobacilles (Freney et al., 2000).
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b. Classification et caractères
Le genre Klebsiella (Klebsielles) comporte cinq espèces dont l'espèce type est K.p (Bergogne- Berézin et Dellamonica, 1995). L'espèce K.p est subdivisée en 3 sous espèces: K. pneumoniae subsp pneumoniae, K. pneumoniae subsp ozaenae et K. pneumoniae subsp Rhinoscleromatis (Avril, Dabemat et al., 2000).
Les bactéries appartenant à l'espèce Klebsiella pneumoniae sont des bacilles à Gram négatif, immobiles, diplobacilles généralement capsulées, non sporulées, anaérobies facultatifs (El Fertas- Aissani et al.,2012).
Klabsiella. pneumoniae est une espèce ubiquitaire, et fréquemment isolée dans l'environnement à partir d'échantillons de sol, d'eaux de surface, d'eaux usées, de végétaux, et de muqueuses des mammifères, en particulier de la flore fécale (Baerwolf et al., 2002).
1.2.5.2. Coque à Gram positif 1.2.5.2.1. Staphylocoque
Le genre staphylococcus comprend des coques Gram positifs, de 0.5 àl .5 µm de diamètre, isolés, en paires ou en tétrades et de façon caractéristique, se divisant dans plusieurs plans pour former des amas irréguliers. Leur paroi contient du peptidoglycane et de l'acide teichoïque (Prescott et al., 2010)
~ Staphylococcus aureus
Cette bactérie, Gram+, est un aéro-anaérobie facultative, catalase (+),responsable d'intoxination par ingestion d'une entérotoxine. Cette toxine est détruite par la chaleur (supérieure à 60°C) ou le froid (inférieur à 7°C), sa dose infectieuse est très faible, de l'ordre de 1 ng. Il existe des porteurs sains de Staphylococcus aureus. Cependant cette souche peut être à l'origine d'auto-infections ou contaminer d'autres individus (Zuliani et Garryp.,2004).
1.2.5.2.1.2. To:xi-inf ections alimentaires
- Elles sont dues à l'ingestion d'entérotoxines (A et E), préformées dans l'aliment, résistant aux sucs digestifs et pour certaines à la chaleur, entraînant des troubles d'apparition précoce (moins de 3 heures) avec vomissements, diarrhée, déshydratation et absence de fièvre.
- La recherche de l'entérotoxine contenue dans les aliments ou produite par la souche isolée est possible dans des laboratoires spécialisés (Avril et al., 1992).
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1.2.6. Les pathologies engendrées
Plusieurs épidémies alimentaires d'envergure liées à la consommation de végétaux contaminés consommés crus ont été recensées récemment (Estelle et Loukiadis, 2012).
Trois types d'organismes peuvent présenter un risque pour la santé humaine sont susceptibles d'être véhiculés par les fruits et les légumes : les virus (hépatite A, par exemple), les bactéries (Salmonella spp., Escherichia coli, Shigella spp., et autres) et les parasites (Giardia spp., par exemple).
Dans la plupart des cas, les bactéries sont responsables de maladies associées à la consommation de fruits et légumes (Andrés et Lopez Camelo , 2007).
La consommation d'aliments avariés peut provoquer une contamination ou une intoxication. Il est question de contamination alimentaire, lorsqu'une personne consomme une grande quantité de microorganismes vivants au cours d'un repas. Ils se multiplient rapidement dans l'appareil gastro- intestinal et perturbent gravement le système digestif (Ife Fitz et Bas Kuipers ,2003).
Les intoxications alimentaires sont des maladies contractées à la suite de l'ingestion d'aliments contaminés par des agents pathogènes ou des substances néfastes pour la santé.
Le terme de toxiinfection est très souvent utilisé, soit comme synonyme d'intoxication alimentaire, soit comme infection d'origine alimentaire. Le sigle de TIAC, pour « toxiinfection alimentaire collective » reprend ce mot. On peut définir TIAC comme une intoxication alimentaire supposant au moins deux cas groupés imputables au même aliment avec des manifestations similaires dues à une contamination par un microorganisme ou une toxine (Joffin et Jofftn, 2010).
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L'intégralité de notre travail a été réalisée au niveau du laboratoire de la Microbiologie de l'Université de Jijel durant la période Mars-Juin de l'année 2016 .
./ But de travail
La laitue est un légume cosmopolite qui rentre dans la composition de l'alimentation humaine.
En effet, elle est connue pour ces vertus laxatifs et sa richesse en vitamines et en sels minéraux.
Cependant sa consommation n'est pas toujours sans risques, car elle peut véhiculer, si elle n'est pas bien nettoyée, différentes maladies parasitaires et même bactériennes. Dans le but de contribuer à la connaissance des germes qui peuvent être transporter et transmis passivement aux consommateurs de cette denrées alimentaire laq~ement cultivée et utilisées dans la région de Jijel et même dans l'ensemble des régions du territoire national, notre travaille s'articule sur le dénombrement de la flore et la recherche des germes potentiellement pathogènes se trouvant sur la surface des feuilles de cette plante ainsi que leur sensibilité aux antibiotiques.
II. 1. Matériels
II.1.1. Milieux de culture
II. 1. 1.1. Milieux de culture solides
• Gélose nutritive : pour le dénombrement des colonies et la conservation des souches.
• Gélose Hektoen : pour l'isolement et purification des Salmonelles.
• Gélose Chapman: pour l'isolement et la purification des Staphylocoques.
• Gélose au sang: pour mesurer l'activité hémolytique des bactéries à GRAM négatif.
• Gélose TSI incliné, Mannitol-Mobilité: pour l'identification biochimique des Entérobactéries (galerie classique).
• Gélose Mueller -Hinton : pour réalisation de l' antibiogramme.
II.1.1.2. Milieux Liquides
• Milieu « SFB » : pour l'enrichissement des bactéries Gram (-)
• Milieu« BHIB »:pour l'enrichissement des coque Gram(+) de genre Staphylococcus.
• Bouillon nutritif : l'utilisation comme milieu de revivification pour la détection des entérobactéries.
• Eau physiologique stérile pour la préparation de la solution mère.
• Milieu: LDC, ODC, ADH, Urée Indole, pour le teste d'identification biochimique des Entérobactéries
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Il.1.1.3. Produits chimiques et réactifs
• Violet de gentiane, fuschine, lugol, alcool, pour la coloration de Gram.
• Le réactif de KOVACS, VPl, VP2, TDA pour l'identification des Entérobactéries.
• Solution de HCL pour stérilisation des verriers.
• H202 (eau oxygénée pour la recherche de Catalase),
• L'eau distillée; pour la préparation l'eau physiologique, le lavage des tubes à essai et les flacons.
Il.1.1.4. Appareillages
Le matériel suivant a été utilisé tout au long du travail
• Four pasteur ( control)
• Autoclave pour la stérilisation (Phi brand).
• Microscopie optique(Olympus).
• Etuve (Memmert). (37C°)
• Bain Marie (Gerhardt Bonn)
• Réfrigérateur (ENIEM)
• Pipette graduée (10 ml)
• Pipette pasteur
• L'appareil pour le dénombrement (compteur des colonies)
./ Divers : Éthanol 70 % pour flambage, becs bunsen, boites de pétries, tubes et flacons stériles, anses, pinces, les cotons-tiges stériles.
Il.1.1.S. Disques des antibiotiques -Amoxicilline(AML25).
-Pénicilline (p 10).
11.2. Méthodes
./ Région d'échantillonnage
18 échantillons ont été récoltés de 3 région de la wilaya de Jijel ont été effectués dans les conditions de vente normales selon le programme et la fréquence résumé dans le tableau II.
L'ensemble des échantillons ont été acheminé le plus rapidement possible au laboratoire de microbiologie. Avant toute manipulation, les échantillons sont laissés à l'air libre pour un éventuel séchage.
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Tableau II : Résumé de la distribution des échantillons selon les régions
Régions Date Nombre des
échantillons
J1 22/04/2016
J2 24/04/2016
J3 27/04/2016
JUEL J4 02/05/2016 06
J5 07/05/2016
J6 09/05/2016
Kl 24/04/2016
K2 27/04/2016
K.3 02/05/2016
KAOUS K4 07/05/2016
K5 09/05/2016 07
K6 20/05/2016
K7 20/05/2016
Tl 22/04/2016
T2 24/04/2016
TARER T3 27/04/2016 05
T4 02/05/2016
T5 07/05/2016
Total 18
II.2.1. Les Analyses microbiologiques
Les analyses microbiologiques choisies sont en relations avec la nature des échantillons et les conditions de travail au sein du laboratoire. 3 grandes flores sont ciblées et qui sont : La flore Totale aérobique, les entérobactéries pathogènes et les bactéries du genre Staphylococcus.
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11.2.1.1. Dénombrement
11.2.1.1.1. Recherches des germes totaux aérobies
• But
Le but du dénombrement est d'évaluation du nombre de germes présents sur la surface périphérique et la surface interne des feuilles de la partie aérienne de la laitue (Carbonelle et al., 1987).
• Principe
Repose sur le transfert et la mise en culture sur gélose nutritive solide des germes présents sur une surface inerte, dans notre travaille les surfaces interne et périphérique de la partie aérienne de la laitue sujets à cette analyse (Carbonelle et al., 1987).
•Technique
La gélose nutritive est préalablement fondue puis coulée dans des boites de Pétri. Après gélification et refroidissement, une partie d'une feuille choisie au hasard est découpés en dise et qui doit être équivalent à la surface de la gélose coulée en boite de pétri. Les dises ainsi préparés de manière aseptique, sont déposés et légèrement accolés sur la surface des géloses sans les déformées pour assurer un bon transfert des germes sur la surface des géloses. En fin, les géloses ainsi cultivées sont incubées à 3 7°C pendant 24h.
•Lecture
Après incubation les colonies qui apparaissent sur les géloses représente une UFC (Unité Formant Colonie). Ces dernières sont considérées comme un germe présent sur la surface de la feuille de plante analysée.
11.2.3.1.2. Recherche des Entérobactéries pathogènes
Les entérobactéries potentiellement pathogènes peuvent être véhiculées par les différents produits alimentaires et particulièrement l'eau d'irrigation, de boisson ou de nettoyages et de lavage après la récolte des produits alimentaire d'origines végétale, d'où l'importance de leurs recherches sur la surface de ces produits.
•Technique
Elle comprend 4 étapes : enrichissement, isolement, purification et identification.
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A. Enrichissement en milieu sélectif
Avec une pince prélever une feuille de la laitue du 4 cm de longueur et de 4 cm de largeur et la placer aseptiquement dans un tube contenant le milieu « SFB », laisser le tube sur paillasse pendant 15 min, puis enlevée la feuille. Incuber à 37°C pendant 24h.
•Lecture
Les tubes présentant un trouble microbien sont considérés comme résultat positif (Bourgeois et Leveau, 1991).
B. Isolement sur gélose sélective
- Dans des boites de pétri, couler la gélose « Hektoen » déjà fondue et laisser prendre en masse.
- À l'aide d'une anse de platine stérilisée conformément, pendre une goutte à partir des tubes de
« SFB » positif et la déposer au bord de la boite préparée.
- Flamber l'anse de platine, laisser refroidir et faire un isolement par épuisement en surface.
- Incuber à 37C0 pendant 24 heures.
•Lecture
Pour notre travail, les boites présentant des colonies vert-bleu, jaune avec ou sans centre noirs sont considérées comme positive.
C. Purification
•Technique
La technique d'isolement par épuisement sur gélose Hektoen est adoptée de façon à obtenir des colonies bien isolées et pure. On incube la gélose 37±1°C pendant 24h±3h.
•Lecture
Les colonies bien isolées et présentant les caractéristiques souhaitées sont repiquées sur gélose nutritive inclinée puis soumises aux tests d'identification.
D. Identification des souches collectées (Lamouliatte et al, 1992).
L'identification des souches a porté sur une série de tests préliminaires (examen macroscopique et examen microscopique), tests biochimiques et un antibiogramme.
E. Identification macroscopique
L'aspect des colonies sur le milieu solide permet une orientation sur les colonies, leur couleur, la taille, la forme et la fermentation du lactose.
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