Etude de l'activité antibactérienne de quelques fractions d'un extrait éthanolique et chlorofornique d'une espéce de lichen et effet de leurs association avec les antibiotiques

Ministère de L'Enseignement Supérieur et de la Recherche Scientifique

Université Mohamed -Seddik Benyahia -

Faculté des Sciences de la Nature et de la Vie

Département de Microbiologie Appliquée ..

et Science Alimentaire ---

Mémoire de fin d'étude

En vue de l'obtention du diplôme : Master Académique en Biol Option : Microorganismes et Patbogénécité

Thème

~tuâe tû î activité antibactérienne tû que(ques fractWns âun extrait étfi.anoîUfue et

c/i(qyof ormUfue d'une espèce tû îicfien et effet tû Ceur associatron avec Ces antibiotiaues

Membre de jury :

Présidente : Dr LAGGOUNE S.

Examinateur : M RAHMOUNE Y.

Encadrant : Mme BEKKA F.

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Année UniveFsitaire : 2015-2016

Présenté par :

Mlle BOUHLASSA Dalila Mlle BESSIKRI Asma

N°d' ordre : ... .

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P.n premier fieu, nous tenons à remercier notre jlLL}IJ{, notre créateur fe tout puissant, pour nous avoir donnée [a force pour accompfir ce travail

:Nous tenons à notifier un remerciement spécia[ à ^9vf_me ŒP.1('1()1._. P

pour son aide et ses consei/S durant tout [a période de [a

réa[isation de notre projet.

:Nous e~rimons nos remerciements à :

./ L 'ensem6[e de mem6res de jury ^9vf_eme Laggoune. S et ^9v1.er 1?.}tJ[9vf.OV:NE pour avoir accepté de juger notre travai~

./ î{oute {'équipe de fa6oratoire de [a 9vf.IC1?JXBIOLOÇJIP.

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:Nous derniers remerciements et ce ne sont pas moindres, vont

à tous cetl.:( qui ont contri6ué de prés ou de [oin pour réa[iser ce travail

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Liste des tableaux Liste des abréviations

Introduction ... 01

SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE CHAPITRE I : Généralités sur les lichens et l'espèce Evernia prunastri I. Généralités sur les lichens ... 03

I.l. Définition des lichens ... 03

I.2. Ecologie et répartition ... 04

1.3. Morphologie et anatomie des thalles lichéniques ... 04

I.4. Constituants du thalle lichéniques ... 05

1.5. Reproduction des lichens ... 06

1.6. Domaine d'utilisation des lichens ... : ... 07

I.6.1. Bioindicateurs de l'air ... 07

I.6.2. Utilisation pharmaceutique ... 07

I.6.3. Utilisation traditionnelle ... 08

II. Evernia prunastri ... 08

11.1. Classification ... 08

II.2. Identification de l'espèce ... 08

II.3. Ecologies et répartition ... 10

CHAPITRE II: Les substances bioactives lichéniques I. Les métabolites lichéniques ... 11

I. l. Les métabolites primaires ... 11

I.2. Les métabolites secondaires ... 11

1.2.1. Les composés phénoliques ... 12

CHAPITRE III: Les antibiotiques et la résistance bactérienne I. Généralités sur les antibiotiques ... 18

I.1. Définition ... 18

1.2. Classification des antibiotiques ... 18

II. Résistance bactérienne aux antibiotiques ... 21

II.1. Mécanismes de résistance bactérienne ... 21

II.2. Types de résistance ... 24

11.2.1. Résistances naturelles ... 24

II.2.2. Résistances acquises ... 24

11.2.2.1. Mécanismes génétiques de la résistance acquise ... 25

II.2.2.2. Exemple de bactéries résistantes ... 26

11.3. Utilisation des antibiotiques en association ... 27

PRTIE EXPERIMENTALE MATERIELS ET METHODES I. Matériels utilisés ... 28

I. l. Matériel végétal et antibiotiques ... 28

I.2. Matériel biologique ... 28

I.3. Matériel du laboratoire ... 29

II. Méthodes ... 30

II.1. Cinétique de croissance bactérienne ... 30

11.1.1. Courbe d'étalonnage ... 30

11.1.2. Courbe de croissance ... 30

II.2. Activité antibactérienne ... 31

II.2.1. Antibiogramme des souches testées ... 31

11.2.2. Aromatogramme sur milieu solide ... 30

II.2.3. Etude de l'association fractions/ antibiotique par la méthode des disques ... 31

11.2.4. Détermination des Concentration Minimale Inhibitrice (CMI) des fractions par la méthode de microdilution en milieu liquide ... 32

11.2.5. Cinétique de croissance en présence des fractions actives ... 33

II.3. Etude statistique ... 33

RESULTATS ET DISCUSSION 1. Cinétique de croissance ... 34

1.1. Courbe d'étalonnage ... 34

1.1.1. Courbe d'étalonnage d' Escherichia coli ... 34

1.1.2. Courbe d'étalonnage de SARM ... 34

I.2. Courbe de croissance ... 35

1.2.1. Courbe de croissance d'Escherichia coli ... 35

1.2.2. Courbe de croissance de SARM ... 36

II. Activité antibactérienne ... 3 7 II. l. Antibiogramme de vérification des souches testes ... 3 7 11.1.1. Antibiogramme d 'Escherichia coli ... 3 7 II.1.2. Antibiogramme de SARM ... 38

II. 2. Aromatogramme sur milieu solide ... 39

II.2.1. Aromatogramme d' Escherichia coli ... 39

11.2.2. Aromatogramme de SARM ... 40

III. Effet de l'association fractions/ antibiotique sur SARM ... 41

111.1. Effet de l'association fractions chlorofo1miques I FOX ... 41

111.2. Effet de l'association fractions d'acétate d'éthyle/ FOX ... 42

111.3. Effet de l'association fractions chloroformiques / OX ... 43

111.4. Effet de l'association fractions d'acétate d'éthyle/ OX ... 44

IV. Aromatogramme en milieu liquide ... 46

IV.1. Aromatogramme en milieu liquide de SARM ... 46

IV.2. Effet des fractions chloroformiques et d'acétate d'éthyle actives sur la cinétique de croissance de SARM ... 48

Conclusion Glossaire Annexes

Listes bibliographiques

Résumé

Figure 1 : Schéma des Principaux types de thalles lichéniques ... 05

Figure 2 : La forme des isidies et sorédies ... 07

Figure 3: Evernia prunastri avec leur différente couleur ... 07

Figure 4: Evernia prunastri (fruticuleux) poussant à partir d'un Flavoparmelia caperata (foliacé) .. 10

Figure 5 : Voies de biosynthèse des métabolites secondaires lichéniques ... 13

Figure 6: Structure chimiques des composés phénoliques ... 14

Figure 7: Mode d'action des antibiotiques sur le métabolisme intermédiaire ... 21

Figure 8: Principaux mécanismes bactériens de résistance aux antibiotiques ... 22

Figure 9 : Courbe d'étalonnage d' Escherichia coli ... 34

Figure 10: Courbe d'étalonnage de SARM ... 35

Figure 11: La courbe de croissance d'Escherichia coli ... 35

Figure 12: La courbe de croissance de SARM ... 36

Figure 13: Photos présentant !'antibiogramme de vérification de la souche d'Escherichia coli ... 38

Figure 14 : Résultats de l'aromatogramme des fractions ... 39

Figure 15: Résultats de l'activité des fractions chloroformiques sur SARM ... .40

Figure 16: Résultats de l'activité des fractions d'acétate d'éthyle sur SARM ... .41

Figure 17 : Résultats de l'association fractions chloroformiques /FOX ... .42

Figure 18: Résultats de l'association fractions d'acétate d'éthyle /FOX ... .43

Figure 19 : Résultat de l'association fractions chloroformiques /OX ... .44

Figure 20: Résultat de l'association fractions d'acétate d'éthyle /OX ... .45

Figure 21 : Résultats des CMis des fractions chloroformiques de SARM ... 45

Figure 22: Résultats des CMis des fractions d'acétate d'éthyle de SARM ... .45

Figure 23 : La courbe de croissance de SARM en absence des fractions étudiées (témoin +) ... .48

Figure 24 : Effet de la fraction K sur la cinétique de croissance de SARM ... .49

Figure 25: Effet de la fraction 8 sur la cinétique de croissance de SARM ... 50

Figure 26 : Effet de la fraction 10 sur la cinétique de croissance de SARM ... 50

LISTE DES TABLEAUX

Tableau I : Voies biosynthétiques impliquées dans la synthèse des substances de lichen ... 13

Tableau II : Distribution des composés phénoliques de lichen dans le thalle d' E. prunastri ... 17

Tableau III: Caractéristiques des souches testées ... 28

Tableau IV: Résultats de l'antibiogramme de vérification de la souche d' Escherichia coli ... 37

Tableau V: Résultats de !'antibiogramme de vérification de la souche de SARM ... 38

Allélopathie: C'est un phénomène où de nombreuses espèces végétales synthétisent des molécules capables d'agir sur le développement des plantes avoisinantes.

Antagonisme: Phénomène démoé-cologique par lequel les populations d'une espèce s'opposent à l'installation de celles d'une autre espèce dans leur habitat

Antinociceptive: Toute substance qui inhibe le nociception

Antipyrétiques : est un médicament utilisé dans le traitement de la fièvre

Ascolichen: Un lichen dans lequel le composant est un champignon ascomycète. Une classe de lichens, caractétisé par la production d'ascii semblables à celles produites par les ascomycètes.

Chemiosyndrome: Syndrome témoignant d'une lésion unilatérale de la moelle épinière

Crustacés: Forment des thalles ressemblant à des croûtes, ils adhèrent au support sur toute leur surface ; ils ne peuvent en être détachés.

Foliacés : Forment des thalles en forme de lames ou de feuilles, ils sont faiblement appliqués au substrat et sont facilement détachables par endroits.

Fruticuleux : Présentent des formes barbues ou en lanière et sont fixés en un seul point au support.

Gélatineux: Lichen dont le thalle est noir, rigide et cassant à l'état sec, mais qui gonfle en présence d'eau, devenant ainsi mou et gélatineux.

Squamuleux: composés d'écailles bien appliquées sur le substrat et peu facilement séparables de celui ci.

Synergie : Association de plusieurs facteurs ou de plusieurs méthodes avec la même action

physiologique.

LISTE 'D'ES

ADN: Acide Desoxyrebonucliéque AMC: Amoxyclav

AT: Aztreonam ATBs: Antibiotiques

BLSE: P-Lactamines à Spectre Elargi BN : Bouillon Nutritive

CAZ: Ceftazidime CIP: Ciprofloxacine

CMI: Concentration Minimale Inhibitrice CTX: Céfotaxime (Cephotaxime)

DO: Densité Optique FOX: Céfoxitine GN: Gélose Nutritive Mii: Mueller Hinton

mecA: methicillin resistant gene OX: Oxacilline

PBP: Penicillin Binding Protein PG: Peptidoglycane

PLP : Protéines Liant la Pénicilline

SARM : Staphylococcus aureus Résistant à la Méthicilline SCC: Staphylococcal Cassette Chromosome

UFC: Unité Formant Colonie UV: Ultra-violet

UV-B: Ultra- Violet B

Introduction

Introduction

Récemment le développement de la résistance microbienne aux antibiotiques, a conduit les scientifiques à chercher des substances naturelles dotées d'activité antimicrobienne. Tels, les lichens qui peuvent présenter de nouvelles sources significatives de substances bioactives.

En effet, les métabolites secondaires font et restent l'objet de nombreuses recherches in vivo comme in vitro, notamment la recherche de nouveaux constituants naturels tels que les composés phénoliques (Karithikai Devi, 2011 ; Javeria et al., 2013; Ebongue et al., 2015).

L'utilisation des lichens comme matière odorante naturelle remonte aux civilisations anciennes. Les Egyptiens, se servaient de la mousse de chêne (Evernia prunastri) pour parfumer les objets les plus divers, pour la fabrication du pain et l'embaumement des corps.

Au moyen âge, cette mousse est employée pour la préparation de poudres odorantes et dans le traitement des voies respiratoires. Son efficacité comme médicament peut s'expliquer par sa teneur en composés phénoliques (Lessard, 1990).

Les activités biologiques multiples des polyphénols sur la santé humaine a poussé les chercheurs à étudier les activités antimicrobiennes de ces substances extraites de nombreux lichens et l'optimisation de l'utilisation des antibiotiques impose la recherche d'une efficacité maximale, de conséquences écologiques minimales sur l'évolution des flores bactériennes, d'une moindre toxicité, et du meilleur rapport cout/ bénéfice. Dans le but d'augmenter la bactéricidie, d'élargir le spectre antibactérien, voire de prévenir l'émergence de mutants résistants, les antibiotiques sont souvent utilisés en association. L'apparition de molécules dotées de Concentrations Minimales Inhibitrices(CMI) plus basses ou d'un spectre plus élargi n'a cependant pas conduit les cliniciens a remettre en cause l'intérêt des associations (Auboyer et al, 2000).

Dans ce contexte s'inscrit ce présent travail de recherche, dont le but principal est d' :

• étudier l'activité antibactérienne des fractions chloroformiques et d'acétate d'éthyle issues du fractionnement sur colonne d'un extrait éthanolique d'une espèce de lichen Evernia prunastri de la région de Jijel sur deux souches multirésistantes qui sont : Staphylococcus aureus résistant à la méthicilline (SARM) et Escherichia coli productrice de

à Spectres Elargi (BLSE);

• étudier l'association des fractions actives avec les antibiotiques auxquels résistent

les deux souches.

De ce fait nous avons commencé par une étude bibliographique qui consiste à donner un aperçu général sur les lichens et les substances bioactives et plus précisément les polyphénols, suivis d'une partie sur les antibiotiques et la résistance bactérienne.

Pour la partie expérimentale nous avons essayé de traiter les étapes suivantes :

o Antibiogramme de vérification pour les souches d 'Escherichia coli et Staphy/ococcus aureus résistant aux antibiotiques ;

o Etude de la cinétique de croissance des souches en milieu liquide (courbe d'étalonnage et courbe de croissance) ;

o Recherche de l'activité antibactérienne de diverses fractions par la méthode des disques (aromatogramme sur milieu solide);

o Détermination des Concentrations Minimales Inhibitrices (CMis) par la méthode en microdilution (aromatogramme en milieu liquide);

o Etude de l'association de diverses fractions actives avec les antibiotiques auxquels résistes les souches ;

o Etude de l'effet des fractions actives sur la cinétique de croissance bactérienne.

SY!NTJf'ES'E

'BI'BLIO{i'R:A.PJfIQ,U'E

sur Ces (îcfiens et t' ^e~èce

Evernfa _prunastri

Chapitre l Généralités sur les lichens et l'espèce Evernia prunastri 1. Généralités sur les lichens

Les lichens sont probablement les premiers colonisant du terrestre, avec des disques fossiles de 400-600 millions d'ans. Ces fossiles montrent des associations symbiotiques entre les mycètes et les photo-autotrophes avant l'évolution des plants vasculaires. Il y a environ 300 genres et 18000 espèces de lichens actuellement identifiés (Stojanovié et al, 2011).

Environ 25.000 espèces de lichens se trouvent approximativement dans tous les écosystèmes terrestres et s'étendent vers le Nord des régions tropicales et des plaines aux plus hautes montagnes. En France, environ 2500 espèces de lichens ont été répertoriées (Mitrovié et al, 2014; Kosanié et al, 2014). Ces organismes sont historiquement utilisés comme traitement pour les maladies humaines, nourriture, colorants, dans la production de l'alcool et dans l'industrie de parfum (Alpsoy et al, 2015; Karithikai Devi et al, 2011). Les lichens sont également très sensibles aux évolutions climatiques (température, humidité, .. . ), de ce fait , ils peuvent constituer des bioindicateurs très intéressants de changements climatiques (Shamoff, 2001 ).

1.1. Définition des lichens

Les lichens qui sont intégrés dans le règne fongique, résultent de l' association symbiotique d'un champignon, le mycobionte (du grec mykes : champignon ; bios : vie) et d' un partenaire photosynthétique : cyanobactérie ou algue, le photobionte (du grec photo : lumière ; bios : vie) (Genevès, 1990 et Suie Ozturk, 2015). Le mycobionte appartient généralement au groupe des Ascomycètes (98%) et plus rarement au groupe des Basidiomycètes (2%) (Sammer et al, 2014). A la différence des plantes supérieures, ils ne possèdent ni racine, ni tige, ni feuille, mais un appareil végétatif simple : le thalle (Gaudillere, 2001). Les espèces lichéniques se différencient par la morphologie de leur thalle , leur partie reproductive et par les conditions environnementales qui déterminent quel photobionte va s'exprimer (Pauline, 2013).

1.2. Ecologie et répartition

Les lichens sont répandus à travers presque toutes les régions du monde : des zones les plus extrêmes, vers les pôles, jusqu'aux sommets, à la limite des neiges éternelles, dans les déserts rocheux et représentent environ 8 % de la couverture terrestre (Mitrovié et al., 2011).

3 )

La nature du substrat et les conditions environnantes (température, humidité) déterminent les espèces lichéniques qui y vivent {Genevès, 1990). Ils peuvent supporter de très grosses variations de température. Aussi, les lichens sont capables de reviviscence, c'est-à-dire de passer rapidement, réversiblement et répétitivement de l'état sec à l'état hydraté (Gaudillere, 2001 ), en particulier en haute montagne. Ils tolèrent une dessiccation extrême et une exposition intense aux ultraviolets (UV) grâce à la présence en particuliers de pigments corticaux qui piègent ou empêchent la fmmation de radicaux libres. Le lichen est aussi s'adapte au substrat auquel il s'accroche. Que la roche soit calcaire ou siliceuse ou que l'écorce d'un arbre soit plus ou moins acide, cela influence fortement l'apparition de telle ou telle espèce {Keller, 2010).

1.3. Morphologie et anatomie des thalles lichéniques

Le mycobionte joue le rôle le plus déterminant dans la morphologie et la structure du lichen. Le thalle de multiples lichens atteint un développement important dans diverses régions humides, climat doux, ou encore tropical {Genevès, 1990). Le thalle porte les éléments nécessaires à la reproduction et est caractérisé par une grande diversité de formes et de couleurs qui définit sept principaux types de lichens (figure 1) {Pauline, 2013; Bellenfant et aL, 2010). Les différentes morphologies de thalles sont de type gélatineux (cassants à l'état sec et gélatineux à l'état humide), foliacés, complexes, crustacés (encroutés), squamuleux, lépreux (comme de la poudre) ou fruticuleux {Pauline, 2013).

a b c

Chapitre l Généralités sur les lichens et l'espèce Evernia prunastri

d e f

J

Figure 1 : Principaux types de thalles lichéniques (Bellenfant et al., 2010)

(a) : squamuleux (b): foliacés (c) : fruticuleux (d): composites (e) : gélatineux (t) : lépreux (j) : crustacés

1.4. Constituants du thalle lichéniques

Au sein du lichen, le thalle porte des apothécies circulaires, organes de reproduction sexués du champignon chacun produit des asques pendant plusieurs années (Genevès, 1990), le champignon joue un rôle important dans la morphologie et assure la reproduction sexuée, par la production de spores. Près de 18 500 espèces de lichens sont décrites, et dans 99 % des cas, le mycobionte fait partie des ascomycètes ; le lichen est alors appelé ascolichen. Les spores internes sont formées dans des asques et sont libérées par rupture du sommet de l'asque ou par désintégration de la paroi. Les rhizines qui relient le thalle au substrat, sont des hyphes, simple ou ramifiés, ou des faisceaux serrés de filaments, dont les parois sont soudées (Genevès, 1990).

1.5. Reproduction des lichens

Les lichens sont capables de se reproduire selon deux modes : soit par reproduction

végétative, soit par reproduction sexuée (rencontre des spores fongiques avec un photobionte).

Chez la majorité des lichens, la reproduction sexuée est très largement prédominante ; par exemple, 90 % des lichens de Grande Bretagne et d'Irlande produisent des organes reproducteurs, alors que seuls 29 % se reproduisent par fragmentation (Keller, 2010).

• Multiplication par voie sexuée

Les organes portant la sexualité sont les apothécies. En forme de coupe, elles contiennent les asques (la plupart des lichens sont des Ascomycètes) (Keller, 2010).

• Multiplication végétative

Le processus de lichénisation a fait apparaître des structures particulières, telles que les isidies, les rhizines, les soralies et les sorédies, organes fournissant des caractères utiles pour l'identification des genres et des espèces. La multiplication végétative est le plus souvent assurée au moyen de sorédies ou d'isidies. Les sorédies sont des organes internes qui contiennent les phytobiontes entourés des hyphes du champignon. Les sorédies s'échappent du thalle par des ouvertures nommées soralies. Chez d'autres espèces, ce sont les isidies qui assurent cette fonction. L'isidie est une protubérance du thalle, sa forme est allongée, elle fmit par se détacher d'un seul coup et fonctionne alors comme propagule (figure 2) (Keller, 2010).

Figure 2 : La forme des isidies et sorédies (Keller, 2010).

1.6. Domaine d'utilisation des lichens

Parmi des lichens, Evernia prunastri est l'espèce la plus utilisée de lichens dans

l'industrie de parfum (Kosanié et al, 2014; Alpsoy et al, 2015). En raison de ses propriétés

fixatives et d'arôme boisé, la mousse de chêne est employée intensivement en parfumerie en

tant que fragrance naturelle, en particulier pour les produits masculins tels que lotions de

Chapitre 1 Généralités sur les lichens et l'espèce Evernia prunastri

rasage , produits cosmétiques et fins parfums (Legaz et Vicente, 1983). Elle est employée aussi comme fourrage pour l'animal et par les Egyptiens pour préparer du pain. Des études sur les composés de cette espèce montrent qu'elle présente des activités biologiques intéressantes (Sammer et aL, 2014; Manach et aL, 2004).

1.6.1. Bioindicateurs de l'air

Les lichens dépendent donc fortement de la qualité de l'air et sont généralement très sensibles à la pollution atmosphérique, notamment au dioxyde de soufre (Sharnoff, 2001 ). De manière générale, plus l 'air est pollué, moins la variété d'espèces est grande. La présence d'une grande variété de flore lichéniques et son abondance témoignent généralement d'une bonne qualité de l'air (croissance plus ou moins rapide ... ). En outre, la sensibilité des lichens à la pollution varie selon les espèces : certaines espèces souffrent de la présence de certains polluants (dioxyde de soufre, ammoniac . . . ) tandis que d'autres résistent, par exemple, à la pollution par les oxydes d'azote (espèces nitrophiles, souvent de couleur grise ou orangée vive) . En tant que bioindicateurs, les lichens présentent également l'avantage d' avoir une croissance continue, une grande longévité et d'être observables toute l'année et pratiquement partout (Loppi et Frati, 2006).

1.6.2. Utilisation pharmaceutique

Les lichens produisent de très nombreux composés chimiques qui leur sont propres et qm sont susceptibles d'avoir des applications pharmaceutiques. Ainsi, certaines de ces molécules ont une activité antibiotique ou anti-inflammatoire marquée ou bien encore des propriétés Qhoto rotectrices (Karithikai Devi, 2011; Alpsoy et aL, 2015).

1.7. Evernia prunastri

Figure 3: Evernia prunastri avec leur différente couleur

' y)

1.7.1. Classification

• Domaine : Biota

• Règne : Fungi

• Phylum : Ascomycota

• Sous-Phylum : Pezizomycotina

• Classe : Lecanoromycetes

• Sous-Classe : Lecanoromycetidae

• Ordre : Lecanorales

• Famille : Parmeliaceae

• Genre : Evernia

• Espèce : Evernia prnnastri

1.7.2. Identification de l'espèce

Evernia prnnastri (Oakmoss, Mousse du chêne) vit sur toutes les espèces d'arbres (feuillus et résineux) et se développe principalement sur l'écorce des arbres de chêne, mais également dans une certaine mesure sur des sapins et des arbres de pin et dans des atmosphères humides

très humides (Loppi et Frati, 2006). Ce lichen est sensible

la pollution de l'air (Alpsoy et al, 2015).

a) Morphologie

Thalle à aspect buissonnant formé de lanières plates, de 3 à 10 cm de hauteur, de type arbustif formant des rameaux en lanières. Cette espèce est bicolore présentant une face supérieure de couleur gris verdâtre à vert et une face inférieure grisâtre à blanchâtre, souples, pendantes, attachées en un seul point sur le support. Des sorédies sont observés sur les bords du thalle et un peu sur la face supérieure. Il se développe sur des arbres de toutes sortes, plus rarement sur des roches, en ombre ou soleil, buissonnants et souvent finement découpés et dressés (Bellenfant et aL, 2010; Karabulut et Suie Ozturk, 2015).

L ~

Chapitre/ Généralités sur les lichens et l'espèce Evernia prunastri

b) Reproduction

• Reproduction sexuée

Seul le champignon, intervient en produisant des filaments sexuellement différenciés qui , en se rencontrant au sein même de l'organisme, va produire des spores. Après leur libération, ces spores germent et donnent des hyphes dont le premier rôle est de capturer des algues terrestres libres afin de redonner un nouveau thalle lichénique. Les hyphes vont aller en voler à un autre lichen déjà présent, ce qui peut amener à des complexes lichéniques originaux (Agnello, 2011).

Figure 4 : Evernia prunastri (fruticuleux) poussant à partir d'un Flavoparmelia caperata (foliacé) (Agnello, 2011).

• Reproduction végétative (asexuée)

Ce mode de reproduction ne se fait pas par dissémination de spores, mais du complexe

lichénique entier dans lequel sont présents à la fois le photosymbiote et le mycosymbiote. Les

lichens sont capables de subsister longtemps à l'état sec, ils deviennent alors cassants et les

fragments dispersés par le vent ou les animaux engendrent de nouveaux individus. Des

structures plus organisées peuvent également se former mais contenant toujours le

mycosymbiote et le photosymbiote : Les isidies se trouvent en surface du thalle qui émet ces

petits bourgeons (sphériques, cylindriques, ramifiés ... ) contenant les algues et les hyphes .

Recouvertes par le cortex (couche supérieure du thalle), elles sont en général de la même

couleur que le thalle. Ces isidies, plus lourdes que les sorédies, ne peuvent être transportées

aussi loin, elles assurent plutôt une colonisation du substrat (Agnello, 2011).

1.8. Ecologie et répartition

Le lichen se développe principalement au dessus de l'écorce des arbres de chêne, mais

également dans une certaine mesure sur des sapins et des arbres de pin. Neuf mille tonnes de

lichens d'Evernia prunastri sont recueillies annuellement dans le sud d'Europe, en France

(autrefois dans les forêts autour de Fontainebleau), aussi bien de Calabre, la Bohême, le

Maroc, l'Algérie, et la région de !'anciennes Yougoslavie et Bulgarie (Bernard et al, 2003).

C3ût.PI'f'lt'E II: Les substances bioactives

Cicliéniques

1. Les métabolites lichéniques

Les lichens produisent une ' large variété de composés organiques divisés en deux groupes principaux : les métabolites primaires et les métabolites secondaires.

1.1. Les métabolites primaires l

Les métabolites primaire sont des protéines, des lipides, des hydrates de carbone et d'autres composés organiques impliqués dans le métabolisme et la structure des lichens (Mitrovié et al., 2011) .

1.2. Les métabolites secondaires

Les métabolites secondaires sont des substances originales divisées en plusieurs familles et sont principalement responsables de l'aptitude des lichens à se développer dans des conditions extrêmes. Ils sont de faible poids moléculaire, à caractère hydrophobe et retrouvés dans les fractions apolaires ou moyennement polaires. Ils représentent en moyenne 5 à 10 % de la masse sèche du thalle (jusqu'à 20 %) et sont généralement excrétés des cellules fongiques pour former des cristaux à la surface du thalle. Ils peuvent également être accumulés au niveau de la médulle, du cortex supérieur ou d'organes spécialisés tels que les fructifications. Ils sont essentiellement produits par le mycobionte, mais la majeure partie provient exclusivement de l'action synergique des deux partenaires dans le lichen (Pauline, 2013).

Les métabolites secondaires dont font partie les composés phénoliques contiennent des

substances très recherchées par les industries de cosmétiques, de la pharmacie et de la

phytothéra ie (Orzechowski et al., 2002). Jusqu'à maintenant plus de 2000 métabolites

secondaires, dont la structure a été élucidée, sont connus chez les lichens et parmi eux plus de

800 sont trouvés dans la nature. Ces métabolites sont nécessaires pour la pigmentation, la

croissance, la reproduction, la résistance aux microbes pathogènes et pour beaucoup d'autres

fonctions des lichens (Naczk et Shahidi, 2004).

Chapitre li Substances bioactives lichéniques

1.2.1. Les composés phénoliques

Les polyphénols sont définis comme des composés aromatiques portants plus d'une

fonction hydroxyle sur un noyau benzénique qui peuvent être méthylés, acylés ou glycosyl és.

Ainsi, ils constituent une vaste famille de métabolites secondaires comprenant plusieurs groupes contenant chacun quelques dizaines à plusieurs milliers de molécules diff érentes. (Garcia-Pérez et al., 2008 ;Ojeil et al., 2010).

a) Voies biosynthétiques des composés phénoliques

La formation de ces composés peut être issue de trois voies distinctes : la voie des acétates polymalonates ou polycétide synthèse, la voie des mévalonates et la voie de l'acide shikimique (figure 4, tableau 1) (Shukla et al., 2010; Pauline, 2013) . La plus courante est celle de l'acide shikimique qui utilise comme précurseur les acides aminés aromatiques. Cette voie biosynthétique conduit aux acides benzoïques, acétophénones, lignanes, lignines et coumarines. L'autre voie, celle des mévalonates, qui utilise comme précurseur l'acide acétique activé sous forme d'acétyl-s-coenzyme A. Plusieurs activités de ces molécules lichéniques , principalement celles issues de la voie des acétates polymalonates, ont un intérêt pour la

cosmétique (Shukla et al., 2010; Pauline, 2013).

Polysaccharides

Cycle pentose phosphate

1

Sucres Acide

l

1

•

Acide phénylpyruvique

- ACIDE MËVA~ONIQUE

1

Diterpène - Triterpène Stéro·1de Caroténoide

Acétyl-CoA " ' .

1

/ Anthraquinones

Xanthoncs - - - -chromoncs ACËTATE POLYMALONATE

/ \

\ - - . . _ Acide aliphatique Méthylphloroacétophénonc Acétyméthyl p1'orogl uci nol

/ "

/"---

Acide pulvinique dérivés

et homologue

~/

Para_ _ Tridepside depsides Depsidone

Diphényl-éther Dibcnzofurane Benzyle ester Méta-depside

Figure 5 : Les voies de biosynthèse des métabolites secondaires lichéniques (Pauline, 2013).

Tableau 1 : Voies biosynthétiques impliquées dans la synthèse des substances de lichen (Chicita et Culberson, 1963 ; Shukla et a!.,2010).

Voie biosynthétiques Substances des lichens

Depsides, Depsidones, Chromones, Xanthones, Voie des Polymalonate Dibenzofuranes, Emodines, Anthraquinones et

Androcrocines

Voie de l'acide shikimique Dérivées de l'acide pulvinique, Terphénylquinones Voie de l'acide mévalonique

Terpènes

•Voie de Polymalonate

Les Métabolites secondaires du lichen synthétisés par l'intermédiaire de la voie de polymalonyl, appartiennent à la classe unique des composés chimiques principalement, depsides et depsidones. Ces composés sont synthétisés par l'associé fongique, seulement quand il est en association avec les algues (symbiose du lichen). Ces composés jouent un rôle important dans l'association symbiotique réussie des lichens (Chicita et Culberson, 1963 ; Shukla et a!.,2010; Javeria et al., 2013).

•Voie de l'acide Shikimique

Les substances de lichen sont synthétisées par l'intermédiaire de la voie de shikimate principalement l' acide pulvinique et terphénylquinone. Ces composés sont obtenus par la fusion de deux unités de phénylpyruvate (Chicita et Culberson, 1963 ;Shukla et al.,2010).

• Voie de l'acide Mévalonique

La voie de l'acide Mévalonique a principalement comme conséquence la synthèse des

terpènes. Des sesquiterpènes n'ont pas été rapportés dans les lichens encore. Les diterpènes

sont également rares jusqu'à maintenant. L'hydroxycuarène et le néoprène sont trouvés dans

les lichens. Les triterpènes sont abondants dans les lichens (Chicita et Culberson,

1963 ;Shukla et a!.,2010).

Chapitre Il Substances bioactives lichéniques

b) Structure chimique des composés phénoliques

La structures chimique de ces composés sont semblables et leur identification est souvent très difficile (Boustie et al., 2011).

Acide geroforique

~~o~

CH3 COOCH3

Atranorlne (1)

f.Ae-J3-()rsillinate

Et-J3-()rsillinate

CH3

Acide Usinique (2)

Acide Difractique (3)

Figure 6: Structures chimiques des composés phénoliques (Honda et al., 2010;Boustie et al.,2011 ).

c) Activités des polyphénols

Les métabolites secondaires exercent une variété remarquable des effets biologique : antivirale, antibactériens, antifongique, antiprotozoaire, antiherbivore, antimutagénique, antioxydant, antitumorale, antiulcérogenique, antinociceptive, antipyrétique et anti- inflammatoire. Ces effets sont exploités dans la médecine traditionnelle pour le traitement de divers états (blessures externes, brulures, gastrite, froid, asthme, tuberculose, etc.) chez l'Homme et des animaux depuis les périodes égyptiennes (Mitrovié et al., 2011; Karabulut et Suie Ozturk,2015 ;Mitrovié et al., 2014 ;Alpsoy et al.,2015).

Beaucoup de métabolites secondaires de lichen présentant de diverses fonctions

biologiques ont été rapportés et qui sont produites en réponse aux divers facteurs

environnementaux. Certains d'entre peuvent être de légers filtres qui protègent contre des

rayonnements intenses ou d'agents préventifs contre les dommages provoqués par le pâturage

herbivore et les effets mortels des micro-organismes pathogènes sur les animaux (Manach et

al., 2004; Sammer, 2014). Il existe plusieurs types de molécules bioactives, en particulier les

polyphénols qui sont réputés pour leurs excellentes propriétés antioxydantes, anti- inflammatoires et anticancérigènes (Garcia-Pérez et al., 2008).

• Photoprotection

Les lichens emploient un certain nombre de stratégies pour protéger les symbiotes d'algues sensibles à la lumière contre des niveaux élevés de la lumière et des effets préjudiciables du rayonnement UV, par exemple., criblage et protection contre UV légers par des composés de lichen. Plusieursmétabolites secondaires (y compris atranorine, calycine, acide pinastrique, rhizocarpicacid, acide us inique, acide vulpinique) ont des capacités d'absorption fortes des UV et pourraient fonctionner comme des filtres pour les radiations UV excessive (Molnar et Farkas, 2010).

• Allélopathie

Les métabolites secondaires de lichen peuvent affecter le développement et la croissance des lichens voisins, des mycètes, des mousses et des plantes vasculaires, aussi bien des microorganismes. La concurrep.ce se produit entre les thalles de lichen pour l'espace et la lumière sur une variété de substrats, et joue des rôles importants en déterminant la structure des communautés de lichen et la distribution des différentes espèces (Molnar et Farkas, 2010).

•Activité antimicrobienne

Atranorin, acide fumarprotocetrarique, acide gyrophorique, acide lecanorique, acide protocetrarique, acide physodique, acide stictique et acide usinique ont montré des effets antimicrobiens relativement forts vis-à-vis les micro-organismes résistants aux antibiotiques (Boustie et Grube, 2005; Molnar et Farkas, 2010).

• Activité antiherbivore

Les lichens sont frôlés par des herbivores, par exemple : insectes, acarides, escargots,

lingots. Cependant, l'influence des herbivores sur des lichens est rare, vraisemblablement dû à

leur basse qualité alimentaire, dispositifs structuraux spécifiques et production des composés

Chapitre li Substances bioactives lichéniques

de défense. Les produits naturels dérivés des plants ont un impact moins nuisible sur l'environnement que les produits chimiques synthétiques, et les substances de lichen pourraient être ainsi de bons candidats pour de nouveaux pesticides (Molmir et Farkas, 2010).

•Activité cytotoxique, antitumorale, et antivirale

Beaucoup de métabolites secondaires de lichen présentent des propriétés cytotoxiques et antivirales et pourraient être des sources potentielles des produits chimiques pharmaceutiquement utiles. L'acide usinique diminue la prolifération des cellules du cancer du sein humain et le cancer du poumon sans provoquer l'endommagement del ' ADN.(Boustie et Grube, 2005 ;Molnar et Farkas, 2010).

•Allergie aux substances de lichen

Les substances de lichen peuvent être des allergènes de contact (par exemple : atranorine, acide lobarique, acide stictique). Elles peuvent causer la dermatite de contact allergique professionnelle dont l'eczéma de sylviculture et de travailleurs, aussi bien que la dermatite allergique non professionnelle de cause pendant toutes sortes d'activités en plein air (bois de découpage de chauffage, la chasse, ... ) et pendant l'utilisation des produits de beauté (les parfums, lotions après-rasage) qui contiennent des métabolites de lichen (Molnar et Farkas, 2010).

d) Distribution des composés phénoliques de lichen dans le thalle d' E. prunastri

Les quatre phénols principaux composant le chemiosyndrome de E. prunastri incluent

l'atranorine et l'acide evemique qui sont situé principalement dans le cortex et le

chloroatranorin et l'acide usnique qui sont les plus abondants dans la médulle (Millanes et

al., 2003; Louis de Schreyer, 2009).(Tableaux ID.

Tableau II : distribution des composés phénoliques de lichen dans le thalle d'E. Prunastri (Louis de Schreyer, 2009).

Distribution en composés phénoliques dans le thalle d' E. prunastri Phénols Cortex (mg de phénols /g"

thalle sec) Médulle (mg de phénols /g-

thalle sec)

Atranorine 2.40 ± 0.19 0.15 ± 0.01

Chloroatranorine 1.29 ± 0.14 0.44 ± 0.05

Acide evemique 1.70 ± 0.15 0.08 ± 0.01

Acide usinique 1.08 ± 0.16 0.90 ± 0.10

C3-f..'API'I''R'E III: Les

antibiotiques et Ca

résistance bactérienne

1. Généralités sur les antibiotiques

L'utilisation des antibiotiques en tant que médicaments chez l'Homme et l'animal est considérée comme l'un des progrès majeurs de la médecine car il permet de réduire de nombreuses maladies infectieuses bactériennes (Doublet et al., 2012).

1.1. Définition

Les antibiotiques (du grec anti : contre, biotikos : concernant la vie), sont des substances chimiques organiques, produites par des moisissures (Penicillium , Cephalosporium) mais aussi par les Actinomycétales du genre Streptomyces et exerçant une action toxique envers d' autres microorganismes dont principalement les bactéries. Cette action peut être seulement inhibitrice de la croissance, elle est alors bactériostatique et réversible mais elle peut aussi être létale et dans ce cas elle est bactéricide et irréversible (Bousseboua, 2002 ; Muylaert et Maînil, 2012).

Les antibiotiques sont définis par une activité antibactérienne (spectre d'activité), une toxicité sélective (mode d'action), une activité en milieu organique (pharrnacocinétique) et une bonne absorption et diffusion dans l'organisme (Yala et al., 2001).

1.2. Classification des antibiotiques

Les antibiotiques peuvent être classés selon plusieurs critères :

• Origine: élaboré par un organisme (naturel) ou produit par synthèse (synthétique ou semi synthétique) ;

• Mode d' action : paroi, membrane cytoplasmique, synthèse des protéines, synthèse des acides nucléiques ;

• Spectre d'activité : spectre étroit ou large ;

• Nature chimique: très variable, elle est basée souvent sur une structure de base (ex : cycle

~

lactame) sur laquelle il y a hémi synthèse. La classification est adaptée selon le mode

d' action. Deux grands lieux d' action (la paroi et le cytoplasme) et cinq modes d'action

sont distingués : (1) sur la synthèse du peptidoglycane ; (2) altération de la paroi ; (3) sur

Chapitre Ill Les antibiotiques et la résistance bactérienne

des acides nucléiques ; (5) sur le la synthèse des protéines ; (4) sur la synthèse

métabolisme intermédiaire (Yala et al., 2001).

1.2.1. Classification selon le mode d'action .fJ

» Action sur la synthèse du peptidoglycane (PG)

• p-Lactamincs (Pénicillines, Céphalosporines, Carbapénèmcs, Monobactamcs) - Fixation aux PLP « Protéines Liant la Pénicilline », enzymes (transpeptidase) de la membrane cytoplasmique impliquées dans la phase terminale de l'assemblage du

peptidoglycane ;

- Inhibition de la transpeptidation ;

- Activation des autolysines (élimination ou inactivation d'un inhibiteur de ces enzymes, qui sont les hydrolases) (effet bactéricide).

• Glycopeptides (Vancomycine, TeicopJanine)

Inhibition de la synthèse du peptidoglycane en fo1mant des complexes avec les résidus peptidyl D-Ala-D-Ala des précurseurs du PG lorsqu'ils émergent la membrane cytoplasmique (effet bactéricide).

• Fosfomycine

Action sur la pyruvate-N-acétylglucosamine- transférase, enzyme permettant de constituer les précurseurs du PG (effet bactéricide). (Lavigne, 2007).

» Altération de la paroi

• Polymyxines

Destruction de la membrane (effet bactéricide). (Lavigne, 2007).

» Action sur la synthèse des protéines

• Macrolides et apparentés

Liaison de façon réversible à la sous unité SOS des ribosomes (site P) en inhibant la

transpeptidation et la translocation (effet bactériostatique).

• Aminosides

Fixation sur la sous-unité 30S du ribosome. À concentration subthérapeutique, l'antibiotique provoque l'erreur de lecture et à concentration thérapeutique l'inhibition de l'élongation de la chaîne peptidique en bloquant le complexe d'initiation (effet bactéricide).

• Chloramphénicol

Attachement à la sous-unité SOS (au site A) empêchant l'attachement des Amino- acyltRNA au site A du ribosome (effet bactériostatique).

• Tétracyclines

Fixation réversible à la sous-unité 30S des ribosomes empêchant l' attachement des Aminoacyl- tRNA au site A du ribosome (effet bactériostatique). (Lavigne, 2007).

~

Action sur la synthèse des acides nucléiques

• Quinolones/Fluoroquinolones

Inhibition de la réplication de l 'ADN en antagonisant la sous-unité de la gyrase A (effet bactéricide). (Lavigne, 2007).

~

Action sur le métabolisme intermédiaire

• Cotrimoxazole

Inactivation d'enzymes impliqués dans la synthèse des purines et de certains acides

aminés essentiels (effet bactéricide) (figure 6) (Lavigne, 2007).

Chapitre Ill Les antibiotiques et la résistance bactérienne

Acide p-aminobenzoique +

~-droptéridioe

Dihydro fobte synthétase - _{s uHamidés}

~ f

Acide dihydrofolique

Cotrimoxazole

Dihyd rofobte-réductase . _{' ,} triméthoprime Acide té trahy drofolitique

(acide folinioue)

Cofacteur nécessaire à la synthèse des purines, de la thymidine et de quelques acides aminés

Figure 7: Mode d'action des antibiotiques sur le métabolisme intermédiaire (Lavigne, 2007).

II. Résistance bactérienne aux antibiotiques

Selon la définition microbiologique du terme, une souche est dite résistante lorsqu'elle se cultive en présence de concentration plus élevée en antibiotique comparativement à d' autres souches qui lui sont phylogénétiquement liées. Selon la définition clinique, une souche est qualifiée de résistante lorsqu'elle survit à la thérapie antibiotique mise en place (Muylaert et Mainil; 2012). La résistance bactérienne n'est pas un phénomène stable dans le temps. L'évolution des résistances est extrêmement variable selon les antibiotiques et selon les germes (Thierry, 1994).

11.1. Mécanismes de résistance bactérienne

Les bactéries résistantes peuvent exprimer leur résistance aux antibiotiques à des niveaux de concentration différents. Leur résistance se manifeste par un ou plusieurs mécanismes, ces mécanismes pouvant être, pour un même antibiotique, différents d 'une bactérie à l ' autre (figure 8). Les divers mécanismes impliqués dans la résistance bactérienne

aux antibiotiques sont les suivants :

• Modification de la perméabilité cellulaire défavorable à l'antibiotique;

• Altération du site de réception bactérien de l'antibiotique de manière à le rendre non fonctionnel ;

• Production d'enzymes capables d'inactiver l'antibiotique par son hydrolyse ou sa dénaturation chimique ;

• Développement d'une voie métabolique annexe permettant de contourner la vme inhibée par l'antibiotique (Bousseboua, 2002).

Figure 8 : Principaux mécanismes bactériens de résistance aux antibiotiques (Doublet et al., 2012).

)- Inhibition enzymatique

Le micro-organisme produit des enzymes qui détruit ou inactive l'antibiotique. La production enzymatique peut être induite par un facteur externe (un autre antibiotique) ou constante (non affectée par stimuli externes). On appelle inductible une résistance qui se produit à la suite d'une exposition à un agent d'une classe pharmacologique donnée et constitutive lorsque les gènes à l'origine de la résistance s'expriment en permanence, même en l'absence de tout antibiotique (Doublet et al., 2012).

)- Réduction de la perméabilité cellulaire

La réduction de la perméabilité cellulaire se produit par diminution de l'entrée de

l'antibiotique sur son site, provoquée par une modification de la perméabilité de la membrane

Chapitre Ill Les antibiotiques et la résistance bactérienne

interne ou externe de la bactérie. Une altération des ponnes dans la paroi des bactéries à Gram négatif peut réduire ou bloquer la pénétration de l'antibiotique jusqu' à son site d'action. Cette forme de résistance s'exerce généralement à l'endroit de plusieurs antibiotiques appartenant à plus d'une classe, étant donné que de nombreux médicaments différents peuvent emprunter la même porine (Muylaert et Maînil, 2012).

Altération (ou modification) des sites de liaison

Phénomène engendré par des chromosomes ou des plasmides, ce mécanisme de résistance produit une faible affinité de l'antibiotique pour son site d'action.

a) Altération des protéines de liaison aux pénicillines (PLP) aussi connues sous PBP (Penicillin Binding Protein). Ce phénomène réduit l'affinité de la cible (PLP) pour les B- lactamines soit par une mutation des gènes chromosomiques, soit par l'acquisition de gènes supplémentaires exprimant de nouvelles PLP. Ce mécanisme de résistance est important chez les cocci à Gram positif, comme le Staphylococcus aureus et le Streptococcus pneumoniae, alors qu'il serait beaucoup plus rare chez les bactéries à Gram négatif.

b) L'altération intracellulaire de la sous-unité ribosomale ciblée dans la bactérie peut atténuer les effets antibactériens des macrolides, de la clindamycine, des aminosides ou du chloramphénicol. Cette altération cause l'incapacité d'inhiber la synthèse protéique et la croissance bactérienne pour les antibiotiques qui ne peuvent plus se lier au site ribosomal.

• Altération de l' ADN-gyrase et de la topoisomérase. L' ADN gyrase est une enzyme nécessaire à l'activité des quinolones. Des mutations spontanées d'un seul acide aminé de

l'ADN gyrase engendre la résistance. Il en est

de même pour les mutations de la topoisomérase IV.

Altération des précurseurs cibles de la paroi cellulaire bactérienne. Ce phénomène peut être induit par l'utilisation de la vancomycine, comme pour l'entérocoque résistant à la vancomycine (Doublet et

al., 2012).

... .

);>-

Pompes (transporteurs) à efflux

L'antibiotique ne peut atteindre son site d'action par pompage actif de l'antibiotique à

l'extérieur de la bactérie (efflux). Les transporteurs d'efflux de plusieurs médicaments sont

des composants normaux des cellules bactériennes et contribuent pour une large part à la

résistance intrinsèque des bactéries à de nombreux agents antibactériens. L' exposition aux

antibiotiques favorise une surexpression par mutation de transporteurs, entraînant une hausse de la résistance bactérienne. Il est également possible qu'une résistance par efflux apparaisse à cause de l'exposition à un antibiotique d'une autre classe (Doublet et al., 2012).

11.2. Types de résistance

11.2.1. Résistances naturelles

La résistance naturelle ou intrinsèque est un caractère spécifique de l'espèce qui touche toutes les bactéries de l'espèce considérée. Elle est stable, transmise à la descendance (elle a pour support génétique le chromosome bactérien) mais elle n'est pas ou peu transmissible sur un mode horizontal (d'une bactérie à l'autre au sein d'une même espèce ou entre espèces différentes) (Lozniewski et al., 2010). Il s'agit d'une propriété préexistante chez le germe.

11.2.2. Résistances acquises

Il s'agit d'un caractère qui ne concerne que quelques (ou parfois de nombreuses) souches d'une espèce donnée. La résistance acquise est moins stable, mais elle se propage souvent de façon importante dans le monde des bactéries. Elle résulte d'une modification du capital génétique de la bactérie, lui permettant de tolérer une concentration d'antibiotique plus élevée que celle qui inhibe les souches sensibles de la même espèce. L'apparition et la diffusion de la résistance aux antibiotiques résulte de deux types de modification du génome bactérien: la mutation chromosomique et l'acquisition de plasmides R (Bousseboua, 2002;

Lozniewski et al., 2010).

11.2.2.1. Mécanismes génétiques de la résistance acquise

Le potentiel génétique d'une bactérie est constitué du chromosome et d' un ou de plusieurs génophores facultatifs et extra-chromosomiques, les plasmides. Des gènes sont également portés par des éléments génétiques transposables et par des intégrons . Une bactérie peut ainsi acquérir une résistance aux antibiotiques par deux grands mécanismes génétiques.

L'un a pour support le chromosome et définit une résistance chromosomique, l'autre a pour support les plasmides ou les éléments transposables ou les intégrons et ils définissent une résistance extra-chromosomique (Lozniewski et al., 2010).

a) Résistance chromosomique

Chapitre Ill Les antibiotiques et la résistance bactérienne

Elle résulte d'une mutation, c'est un phénomène rare et qui est du à l'hasard. Il n'est pas provoqué par la présence de l'antibiotique mais ce dernier révèle la mutation en sélectionnant les bactéries mutantes résistante (ou plus exactement, en détruisant les autres bactéries de l'espèce, celles restées sensibles à l'action de l'antibiotique). C'est un phénomène indépendant : l'apparition d'une mutation ne favorise pas l'apparition d'autres mutations de résistance à d ' autres antibiotiques. La probabilité de deux mutations simultanées est donc très faible. Elle est transmissible, permanente et présente donc un caractère héréditaire (transmission sur un mode vertical de bactérie-mère à bactéries-filles) (Lozniewski et al., 2001).

b) Résistance extra-chromosomique

Une bactérie peut devenir résistante à un antibiotique par mutation survenant au niveau du gène codant pour la cible de l'antibiotique au sein du chromosome. Elle peut également acquérir du matériel génétique étranger par incorporation de segments d' ADN libre dans leur chromosome (transformation). Des gènes de résistance peuvent aussi être transférés lors d'une infection par un bactériophage (transduction) et lors de phénomène de conjugaison de transposons conjugatifs et de plasmides. Le terme général élément transposable désigne une séquence d' insertion, ou un transposon qu'il soit composite, complexe ou conjugatif, ou un bactériophage transposant, ou encore un intégrons (Muylaert et Mainil, 2012).

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11.2.2.2. Exemple de bactéries résistantes

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)- Staphylococcus aureus résistant à la méthicilline ' \ ... ~ ^... ~ ~/

Le Staphylococcus aureus résistant à la méthicilline (SARM) est une bac éric;.a Gr • positif pouvant causer des infections nosocomiales graves. Le SARM devient résistant à la méthicilline par l'acquisition d'un gène produisant une modification de la protéine liant la pénicilline (PLP2a). Cette protéine est codée par le gène mecA localisé sur un élément génétique mobile. Elle agit comme transpeptidase, reliant les peptidoglycanes essentiels à la structure membranaire de la cellule bactérienne (Carle, 2009).

)- Escherichia coli résistant aux P-lactamines

Le principal mécanisme de résistance acquis aux P-lactamines chez les bacilles Gram

négatif est la production des P-lactamases (Medboua , 2011). Le niveau de résistance des

souches de l'espèce E. coli s'est considérablement modifié avec l'apparition dans les années 2000 de souches productrices de bêta-lactamases à spectre élargi (BLSE) de type TEM, SHV et surtout CTX-M rendant les souches résistantes aux céphalosporines de troisième génération (Denamur et Picard, 2012). Contrairement aux BLSE de type TEM et SHV, les mécanismes de diffusion de CTX-M semblent plus complexes, mettant en jeu la diffusion des plasmides et/ou d'autres éléments génétiques. Certaines d'entre elles sont évoluées par mutation (ponctuelle ou non) générant un haut niveau de résistance à la ceftazidime telles les enzymes CTX-M-15, CTXM-16, CTX-M-19, CTX-M-23 (Medboua, 2011).

11.3. Utilisation des antibiotiques en association

L'optimisation de l'utilisation des antibiotiques impose la recherche d'une efficacité maximale, de conséquences écologiques minimales sur l'évolution des flores bactériennes, d'une moindre toxicité et du meilleur rapport coût/ bénéfice.

Les objectifs d'une association est d'élargir le spectre du traitement des infections polymicrobiennes à flore mixte aéro-et anaérobie et d'obtenir un synergique qui résulte d'une interaction positive entre deux antibiotiques dont l'action antibactérienne conjointe est supérieure à la somme des actions de chacun des deux antibiotiques pris isolement.

Une synergie ou un antagonisme observé in vitro ne sont pas toujours extrapolables en

clinique. En effet, les conditions d'action in vivo de deux antibiotiques peuvent être

influencées par des paramètres pharmacocinétiques et pharmacodynamiques mal pris en

compte in vitro (Auboyer et al., 2000).

M.'E'TJf01J'ES

Matériels et Méthodes

1. Matériels utilisé

1.1. Matériel végétal et antibiotiques

Notre étude a porté sur quatorze fractions chloroformique (1-14) et vingt et une fractions d'acétate d'éthylique (A-U) (fractionnement sur colonne Gel 60) d'un extrait éthanolique d'un lichen de la région de Jijel qui est: Evernia prunastri et qui est identifié par

Slimani Samira de l'Université de Jijel.

Huit disques d'antibiotique sont utilisés pour réaliser l'antibiogramme. il s'agit de:

• Ceftazidime (CAZ

(Céphalosporine de

génération)

• Cefotaxime (cephotaxime) (CTX

(Céphalosporine de

génération)

• Oxacillin (OX

(Pénicilline M)

• Cefoxitin 30 meg (FOX

(Céphalosporine de 2eine génération)

• Amoxyclav (AMC

(Penicilline +Acide Clavinalique)

• Ciprofloxacin (CIP

(Quinolone)

• Aztreonam (AT

(Monobactame)

1.2. Matériel biologique

Notre étude est portée sur deux souches bactériennes multirésistantes, qm sont : Staphylococcus aureus résistant à la méthicilline SARM (code 019) et Escherichia coli résistant aux

à Spectre Elargi BLSE (CTX-15) (code 87) appartenant à la collection du laboratoire d'Ecologie Microbienne de l'Université de Bejaia et qui sont caractérisées génétiquement (PCR) en France. Les caractéristiques de ces souches sont reportées dans le tableau ci-dessous.

Tableau III : Caractéristiques des souches testées

Caractère

Souches testées La résistance Origine

bactériologique S. aureus résistant à la Résistance à la Gram+, Mec A,

Enfant de 6 an méthicilline (SARM) (019) Méticilline PVL+ , SCC mec IVe (pus) Escherichia co/i résistant à P- Résistance aux

CTX-15 Animaux (Chat)

Lactamine à Spectre Elargi BLSE

(CTX-15) (87)

1.3. Matériel du laboratoire

• Appareillage

Le matériel utilisé tout au long du travail est le suivant : - Etuve (37°C et 30°C)

- Autoclave

- Plaque chauffante agitatrice - Incubateur agitateur

- Microcentrifugeuse - Spectrophotomètre - Microscope à caméra - Bain marie

- Balance - Bec Bunsen - Vortex - pHmétre

- Microscope optique

• Les milieux de culture (composition chimique, Annexe) Les milieux de culture utilisés sont :

- Gélose Mueller Hinton (GMH);

- Bouillon Mueller Hinton (BMH) ; - Gélose nutritive (GN);

- Bouillon nutritive (BN).

• Produits chimiques, réactifs et tampons

Au cours de notre travail, nous avons utilisé :

Matériels et Méthodes

- Violet de Gentiane, lugol, alcool, fuschine et l'huile à émersion pour la coloration de Gram ;

- Eau physiologique stérile ; - Eau distillée stérile ;

- NaOH (0,1 N) et HCl (0, 1 N) pour ajuster le pH;

- Tampon 4 et tampon 7 pour calibrer du pH mètre ;

Il. Méthodes

11.1. Cinétique de croissance bactérienne

11.1.1. La courbe d'étalonnage

Une longueur d'onde maximale de 580 nm (Rasooli et Mirmostafa, 2003) pour la souche à tester est introduite dans le spectrophotomètre et une suspension bactérienne initiale correspondant à une absorbance de 0,65 pour E. coli et 0,604 pour le SARM est préparée.

A partir de cette suspension d'autre suspension diluées sont préparées et qui sont de dilutions 0,36; 0,13 et 0,065 pour E. coli et 0,34; 0,158 et 0,08 pour le SARM.

A partir de ces suspensions bactériennes une série de dilutions décimales est effectuée (10-

10·

10-

10

10·

10-

10-7). 0,1 ml de chaque dilution servent ensuite pour l'ensemencement de deux boites de la gélose Nutritive à l'aide d'un râteau étaleur. Un dénombrement est alors effectué après incubation à 37°C pendant 24 heures.

11.1.2. La courbe de croissance

Ensemencer! OO ml du bouillon Mueller Hinton par 9 ml de la culture bactériennes fraiche. Incuber à 37°C avec agitation modérée.

Dans des conditions aseptiques, prélever 2ml du milieu de culture avant incubation (TO) puis après chaque 15 min du temps d'inoculation (Tl, T2, T3, .. . ), sur une durée d ' environ 24 heures pour E. coli et 48 heures pour SARM

Mesurer la densité optique des échantillons à 580 nm, après avoir mesuré la valeur du

blanc dans le spectromètre (bouillon Mueller Hinton). Représenter les courbes de la DO en

fonction du temps.