pH dependence of propeptide inhibition
63 CONCLUSIONS DU CHAPITRE 3
Dans cette première étude, nous avons étudié l’influence des différents sites de N-glycosylation du précurseur sur le processus d’activation du zymogène proDer p 1. Ainsi, nous avons pu confirmer que le site 52 est le site majoritairement glycosylé et que la glycosylation du site situé dans le propeptide pourrait empêcher l’activation du zymogène recombinant exprimé chez P. patoris. Lors de la maturation à pH acide, nous avons mis en évidence l’apparition de deux intermédiaires : un premier intermédiaire, déjà identifié par Takai et al. correspondant à la perte de la première hélice du propeptide et un second intermédiaire, identifié pour la première fois lors de cette étude et correspondant à la perte de la seconde hélice du propeptide.
L’expression indépendante du propeptide de Der p 1 indique qu’à pH neutre, le propeptide agit comme un inhibiteur puissant du domaine catalytique, expliquant ainsi l’absence d’activité du précurseur. La comparaison de l’inhibition de la protéase, glycosylée ou non, nous a permis de montrer que la glycosylation du site 52, diamétralement opposé au site catalytique, n’influence pas l’association et la dissociation du propeptide. De plus, l’analyse de l’interaction entre le propeptide et la protéase a été étudiée par Résonance Plasmonique de Surface et nous a permis de déterminer pour la première fois la constante de dissociation du complexe protéase/propeptide ; non pas en variant la concentration en inhibiteur, mais celle de la protéase. Cette approche correspond à l’approche inverse de celle utilisée enzymatiquement. Ces deux types d’approche nous ont permis d’obtenir des valeurs similaires et de proposer que l’association du propeptide et de la protéase sous forme d’un complexe se déroule selon un mécanisme à deux étapes.
L’étude du potentiel inhibiteur du propeptide dans différentes conditions montre que son interaction avec le domaine catalytique est pH dépendante. Celle-ci diminue avec le pH pour devenir nulle à pH 4, valeur optimale pour l’activation du précurseur. Parallèlement, nous avons étudié l’activité protéolytique de Der p 1 à ces différents pH et démontré qu’à pH 4, la protéase possède toujours 15%
de son activité maximale et que cette activité pourrait être suffisante pour pouvoir dégrader le propeptide lors du processus d’activation. Enfin, nous avons pu montrer que la perte du potentiel inhibiteur du propeptide à pH acide conduit à sa dégradation rapide par le domaine catalytique, confirmant la possibilité pour Der p 1 de réaliser des clivages à l’intérieur de son propeptide.
L’analyse du potentiel inhibiteur des propeptides tronqués suggère que l’entièreté du propeptide est nécessaire afin d’obtenir une bonne inhibition du domaine catalytique et que la perte des 18 premiers résidus du propeptide conduit à la perte totale du potentiel inhibiteur du propeptide.
L’étude structurale du propeptide par différentes techniques spectroscopiques nous a permis de montrer que la perte du potentiel inhibiteur du propeptide à pH acide est reliée à un changement de la conformation du domaine N-terminal du propeptide. Ce changement structural est caractérisé par une perte d’une partie de la structure tertiaire et le maintien des structures secondaires conduisant à une augmentation de la flexibilité du propeptide. Ces données, additionnées aux informations relatives à la spécificité protéolytique de Der p 1, confirment que les sites clivages identifiés pour chacun des intermédiaires correspondaient à des zones pauvres en structures secondaires et donc plus sensibles à la protéolyse.
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