Phytostimulation du maïs par la bactérie Azospirillum lipoferum CRT1 : impact sur des communautés fonctionnelles du microbiote racinaire

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lipoferum CRT1 : impact sur des communautés fonctionnelles du microbiote racinaire

Sebastien Renoud

To cite this version:

Sebastien Renoud. Phytostimulation du maïs par la bactérie Azospirillum lipoferum CRT1 : impact

sur des communautés fonctionnelles du microbiote racinaire. Ecologie, Environnement. Université de

Lyon, 2016. Français. �NNT : 2016LYSE1143�. �tel-01433755�

THESE DE DOCTORAT DE L’UNIVERSITE DE LYON opérée au sein de

l’Université Claude Bernard Lyon 1 Ecole Doctorale N° 341

Evolution Ecosystèmes Microbiologie Modélisation Spécialité de doctorat : Ecologie Microbienne

Discipline : Biologie

N° d’ordre NNT : 2016LYSE1143

Soutenue publiquement le 12 Septembre 2016 par : Sébastien RENOUD

Phytostimulation du maïs par la bactérie Azospirillum lipoferum CRT1 : Impact sur des communautés

fonctionnelles du microbiote racinaire.

Devant le jury composé de :

ARSENE-PLOETZE Florence, Maître de conférences, Université de Strasbourg Rapporteur SPAEPEN Stijn, Chercheur, Institut Max Planck de Cologne Rapporteur VANDENKOORNHUYSE Philippe, Professeur, Université Rennes 1 Rapporteur RICHAUME-JOLION Agnès, Professeur, Université Lyon 1 Examinatrice

MOËNNE-LOCCOZ Yvan, Professeur, Université Lyon 1 Co-directeur de thèse MULLER Daniel, Maître de conférences, Université Lyon 1 Directeur de thèse

UNIVERSITE CLAUDE BERNARD - LYON 1

Président de l’Université

Président du Conseil Académique

Vice-président du Conseil d’Administration

Vice-président du Conseil Formation et Vie Universitaire Vice-président de la Commission Recherche

Directeur Général des Services

M. le Professeur Frédéric FLEURY M. le Professeur Hamda BEN HADID M. le Professeur Didier REVEL

M. le Professeur Philippe CHEVALIER M. Fabrice VALLÉE

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COMPOSANTES SANTE

Faculté de Médecine Lyon Est – Claude Bernard

Faculté de Médecine et de Maïeutique Lyon Sud – Charles Mérieux

Faculté d’Odontologie

Institut des Sciences Pharmaceutiques et Biologiques Institut des Sciences et Techniques de la Réadaptation

Département de formation et Centre de Recherche en Biologie Humaine

Directeur : M. le Professeur J. ETIENNE Directeur : Mme la Professeure C. BURILLON Directeur : M. le Professeur D. BOURGEOIS

Directeur : Mme la Professeure C.

VINCIGUERRA

Directeur : M. le Professeur Y. MATILLON Directeur : Mme la Professeure A-M. SCHOTT

COMPOSANTES ET DEPARTEMENTS DE SCIENCES ET TECHNOLOGIE

Faculté des Sciences et Technologies Département Biologie

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Observatoire des Sciences de l’Univers de Lyon Polytech Lyon

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Directeur : M. F. DE MARCHI

Directeur : M. le Professeur F. THEVENARD Directeur : Mme C. FELIX

Directeur : M. Hassan HAMMOURI

Directeur : M. le Professeur S. AKKOUCHE Directeur : M. le Professeur G. TOMANOV Directeur : M. le Professeur H. BEN HADID Directeur : M. le Professeur J-C PLENET Directeur : M. Y.VANPOULLE

Directeur : M. B. GUIDERDONI Directeur : M. le Professeur E.PERRIN Directeur : M. G. PIGNAULT

Directeur : M. le Professeur C. VITON

Directeur : M. le Professeur A. MOUGNIOTTE

Directeur : M. N. LEBOISNE

lipoferum CRT1 : Impact sur des communautés fonctionnelles du microbiote racinaire

Résumé

Le développement des plantes est conditionné par leurs interactions avec le microbiote racinaire, dont le fonctionnement repose sur des fonctions élémentaires partagées par plusieurs taxons, au sein de groupes fonctionnels. Certains de ces groupes incluent des PGPR (Plant Growth-Promoting Rhizobacteria), qui stimulent la croissance des plantes grâce à différentes fonctions phytobénéfiques. L’inoculation d’une PGPR peut avoir un impact sur la physiologie de la plante et sur les autres partenaires microbiens de la racine. D’ailleurs, une PGPR inoculée peut modifier la structure génétique du microbiote racinaire global, sans que l’on sache comment cet impact se concrétise au niveau de groupes fonctionnels particuliers. L’hypothèse de cette thèse est que les PGPR inoculées peuvent modifier la structure de communautés microbiennes fonctionnelles importantes pour le développement de la plante. Ces travaux ont évalué l’impact de l’inoculation de la PGPR Azospirillum lipoferum CRT1 sur la taille et/ou la diversité des diazotrophes, des producteurs d’1-aminocyclopropane-1-carboxylate (ACC) désaminase et des producteurs de 2,4-diacétylphloroglucinol (ainsi que de la communauté bactérienne totale) dans la rhizosphère du maïs cultivé en champ sous différents intrants azotés.

Nos travaux ont montré que diazotrophes et producteurs d’ACC désaminase pouvaient être co-

sélectionnés dans la rhizosphère du maïs, et que l’inoculation modifiait la composition

taxonomique de ces groupes fonctionnels. En conclusion, l’inoculation de PGPR module la

sélection rhizosphérique de taxons telluriques portant des fonctions phytobénéfiques, ce qui

pourrait contribuer aux effets phytobénéfiques observés.

lipoferum CRT1: Impact on functional communities in the root microbiota

Summary

Plant development is influenced by interactions established with root microbiota. Microbiota

functioning relies on individual functions carried out by functional groups, which often contain

multiple microbial taxa. Some of these groups include plant growth-promoting rhizobacteria

(PGPR), which stimulate plant growth thanks to several plant-beneficial functions. PGPR

inoculation may impact plant physiology and microbial partners of roots, and inoculated PGPR

can modify the genetic structure of the root microbiota. However, it is not known how this

impact materializes at the level of particular microbial functional groups. The hypothesis of this

thesis is that inoculated PGPR will also modify the structure/composition of microbial

functional groups important for plant development. This work assessed the impact of

inoculation with the PGPR Azospirillum lipoferum CRT1 on the size and/or diversity of

diazotrophs, 1-aminocyclopropane-1-carboxylate (ACC) deaminase producers and 2,4-

diacetylphloroglucinol producers (as well as the total bacterial community) colonizing the

maize rhizosphere in three fields and under different nitrogen fertilization regimes. Our work

showed that diazotrophs and ACC deaminase producers could be co-selected in maize

rhizosphere and that PGPR inoculation modified the taxonomic composition of functional

groups. To conclude, PGPR inoculation modulates rhizospheric selection of microbial members

of functional groups important for plant growth, which may mediate some of the plant-

beneficial effects of PGPR inoculants.

Tout d’abord, je tiens à remercier Florence ARSENE-PLOETZE, Stijn SPAEPEN et Philippe VANDENKOORNHUYSE d’avoir accepté d’évaluer ces travaux de these, ainsi qu’Agnès RICHAUME-JOLION de s’être joint à eux pour constistuer mon jury de these.

Mes premiers remerciements s’adressent bien sûr à mes directeurs de thèse Daniel MULLER et Yvan Moënne-Loccoz sans qui ces travaux n’auraient pas pu avoir lieu. Yvan, même si nous ne sommes pas toujours d’accord sur la façon d’aborder les choses, j’ai énormément de respect pour toi et tes qualités scientifiques mais aussi pour le bourreau de travail que tu es. Daniel, merci pour ton soutien tout au long de ces 3 années difficiles, pour ces discussions sur tout et parfois n’importe quoi, il faut bien dire que l’on a pas toujours parlé de science! Merci pour tes anecdotes historiques que seul toi peux nous sortir inopinément au milieu d’une conversation, preuve de ta grande culture générale. Dois-je te remercier pour tes jeux de mots et blagues douteuses? Sans doute, mais je trouve que tu as eu une mauvaise influence sur l’humour de mon cher collègue Vacheron!! Bref, à votre contact à tous les deux je suis sans nul doute devenu un scientifique plus complet et je vous en remercie. J’èspère avoir répondu à vos attentes lors de ces travaux. D’ailleurs ne croyez pas que c’est fini, il faut publier ces travaux maintenant!

Je n’oublie pas ma chef d’équipe et co-encadrante Claire PRIGENT-COMBARET pour son soutien pendant ces 3 années, pour son implication dans la vie et l’ambiance de l’équipe afin de favoriser un travail collaboratif. J’espère que tu arriveras à democratiser l’OwnCloud, le partage des protocoles et la gestion des stocks, ça ne sera pas facile! Merci de m’avoir fait participer à SymbioMaize et de souvent être à l’écoute des étudiants de ton équipe. Par contre il faut arrêter de prendre des Jordan dans l’équipe parce que sinon faudra en changer le numéro et devenir l’équipe 23 (les amateurs de basket comprendront!). Je remercie également tous les membres de l’équipe Rhizosphère pour les discussions scientifiques ou non, que l’on a pu avoir autour d’un petit Dèj! Je tiens particulièrement à remercier Jacqueline plus communément Jackline pour son aide lors du traitement de ces 1317 échantillons! On a eu plein de temps en grattant ces racines, pour philosopher sur la science, la place des techniciens et des étudiants et faire un peu les commères mais juste un tout petit peu! En tout cas je te souhaite de couler une douce retraite et plein de réussite dans tes projets de jeune retraitée

En parlant de grattage de racines, je remercie tous ceux qui ont pris pitié de moi lors de ces 439

heures de grattage et qui m’ont aidé ne serait-ce que pour quelques unes, Danis, Zazou, Yohan,

Jordan, Corinne et j’en oublie sans doute.

eu comme stagiaire et qui ont largement contribué à ces travaux, j’espère avoir réussi à vous transmettre ce que je savais et vous avoir fait apprécier les quelques mois passés ensemble.

Je remercie tous les arracheurs professionnels de pieds de maïs qui ont sévi à mes cotés dans les environs de Bourgoin en 2014 et 2015 qu’il pleuve, qu’il vente ou sous un soleil de plomb, pour certains jusqu’à devenir allergique au maïs! Je ne vais pas tous vous citer mais merci d’avoir répondu à l’appel du champ! Bien sûr, merci à toi Laurent de m’avoir intégré à l’aventure Azodure!

Je n’oublie pas l’équipe 4 et Agrobacterium tumefaciens, mes primo-formateurs qui m’ont initié à la recherche en Master. Un merci particulier à Ludovic pour m’avoir appris à jouer avec les génomes des bactéries et pour les discussions que l’on a pu avoir et que l’on aura encore j’espère. Par contre Dao, Biolay et Delherme c’est pas possible faut arrêter maintenant! Je continue avec le bureau 408, the bureau, le top du top au dessus c’est le soleil! Avec Daviiiiid Chapuilliot, technicien de chic et de choc, Thibauuuuuud Meyer, tout est dit dans son nom et Xaviiiiier Nesmes, un homme sans souchis! Merci à ce bureau ou règne la bonne humeur et un brin de folie qui permet de décompresser un peu. Merci à Céline mon encadrante de Master qui a toujours pris des news de moi et a continué de me tenir informé de l’évolution de la voie de dégradation de l’acide férulique! Promis je me mets sur le papier cet été!

Bien sûr, un immense merci à tous les étudiants du laboratoire pour cette formidable ambiance que nous avons entretenue et qui continuera je l’espère. Au premier rang duquel mon cher collègue et néanmoins amis, mon lapin, Jordan Vacheron!! Bon au début je voulais recopier tes remerciements mais bon je vais faire un effort-! Merci de partager une vision de la science similaire à la mienne et d’avoir souvent refait le monde avec moi lors de longues soirées d’hiver au coin de la PCR. Merci de toujours avoir été là quand j’ai eu besoin d’un coup de main, d’un protocole, ou d’une mise à jour sur la phylogénie des Pseudomonas, ou d’une bonne blague!

Non je déconne pour les blagues-. Cela fait maintenant depuis le Master que nous traversons

les épreuves de la science, comment je vais faire maintenant que tu pars en Suisse!! J’espére

pouvoir à nouveau travailler avec toi et concrétiser certains projets de recherche ou autres! Mais

déja le projet d’aller boire une bière me parait être une bonne idée. Je n’oublie pas les autres de

cette promotion de Master un peu délurée, qui sont aujourd’hui Docteurs: Flo, PA, Margaux,

Lorrie, et ceux qui vont le devenir avec Fiona et Yohan. Une grosse pensée à la plus Normande

des américaines j’ai nommée Marie Simonin avec qui ont a bien ri au sein de l’UMR!!! Je ne

sais pas si je dois te remercier ami Barbiche pour avoir fait de moi une légende mais je vais le

parlant d’acteur, merci à toi Yohan pour avoir si souvent égayé mes vendredis!

Merci à tous les autres thésards et thésardes, Zazou pour surveiller ma ligne en mangeant le chocolat que j’amène au labo et pour supporter mon humour douteux.Yohan pour tes coups de gueule. Lise pour rire à mes blagues et avoir accepté que je te bousille des kits ARN. Quentin (pas de t-shirt champignon pour ma soutenance) pour le duo footballistique. Aurélie, parce que travailler avec Larousseau ça n’a pas de prix. Rosa pour avoir une paillasse d’exception et un rire communicatif. Antoine pour tes ppt so Funk et ton investissement dans la vie du labo.

Benjamin Diel pour partager avec moi le lourd fardeau qui nous incombe…Julien pour ton attirance étrange envers ma personne. Guillaume pour t’occuper si bien de notre zone BET qui m’est si chère. Tous les deux je vous attends sur Elite Dangerous! Elodie pour me tenir informé des potins. Je vous souhaite également bon courage pour finir vos thèses et j’encourage tous les premières années, avec qui j’ai malheureusement eu moins d’intéractions, dans cette longue et périlleuse aventure dans laquelle ils se sont lancés.

Je remercie particulierement Audrey et Danis pour m’avoir accepté comme élève et avoir été des profs d’exception. Merci à Audrey pour avoir dompté acdS qui nous en aura fait baver, maintenant qui va boire le café du matin avec toi et te laver ta tasse!! Merci à Danis de m’avoir inculqué la culture stat (c’était pas gagné) et d’avoir répondu à mes nombreuses questions.

Merci à mes deux blondes préférées du Lwoff, c’est-à-dire Jeanne pour notre symbiose au billard qui nous a permis d’écraser nos adversaires! Et Mylène pour son accent et son humour!

Je remercie mes amis pour leur soutien, même si pour eux, à jamais, mon travail consiste à essayer de faire briller du maïs… J’ai nommé Johan ex coloc de choc, Alan le boucher de Bayonne, Nico l’homme des crémaillères, Justine ma Tati, Jonathan, Brice, Bart, Arnaud, Céline, Claire et tous les Jurassiens avec qui on va passer un bel été, je suis désolé si j’en oublie.

Bien sûr cette thèse n’aurait pu se réaliser sans le soutien inconditionnel de mes parents et de ma famille qu’il soit financier ou moral et pour les valeurs de persévérence et de détermination qu’ils m’ont inculquées. Une pensée pour un grand père parti un petit peu trop tôt pour me voir soutenir.

Attention Lyon 1 quand un Renoud quitte la Fac un autre arrive avec la couz! Un conseil, fais

toi plaisir, l’université c’est sympa! Après pour une thèse on en discutera!

d’être bien meilleure que moi en orthographe-. Vive le Jura

INTRODUCTION GÉNÉRALE 18

CHAPITRE 1 : S

PARTIE A : A

A

30

Abstract 31

Introduction 32

Plant responses to biotic and abiotic stress 33

Responses to biotic stresses 34

Responses to abiotic stresses 35

Plant stress alleviation by rhizobacteria 37 Rhizobaacteria able to reduce stress in plants 37 Azospirillum strain ability to reduce stress in plant 40

Main mechanisms of stress alleviation 43

Mechanisms recovered in Rhizobacteria 43

Mechanisms recovered in Azospirillum 49

Concluding remarks 53

Références 53

PARTIE B : L

75

Introduction 76

Construction du microbiote rhizosphèrique 77

Le sol : un réservoir microbien 77

Les plantes sélectionnent leur rhizomicrobiote 77

Influence du génotype de plante 80

Le rhizomicrobiote : dynamique et structure des communautés

fonctionnelles 82

Structure des communautés fonctionnelles de la rhizosphère 82

Dynamique des communautés fonctionnelles 84

Manipuler le rhizomicrobiote 85

Impact de l’inoculation d’organismes phytobénéfiques sur le

rhizomicrobiote. 85

Inoculation de consortia et microbiome 86

Références 88

RHIZOSPHERE

97

Préambule 98

Abstract 100

Introduction 101

Materials and methods 102

Results 107

Discussion 115

Acknowledgement 117

References 117

CHAPITRE 3 : E

-

A

1

RHIZOSPHERE

123

Préambule 126

Abstract 128

Introduction 129

Materials and methods 131

Results 137

Discussion 147

Acknowledgement 150

References 151

CHAPITRE 4 : E

A

1

FUNCTIONAL GROUPS IN THE RHIZOSPHERE

157

Préambule 159

Abstract 161

Introduction 162

Materials and methods 163

Results 167

Discussion 179

Acknowledgement 183

References 184

CHAPITRE 5 : D

190 Co-sélection des diazotrophes et producteurs d’ACC déaminase dans la rhizosphère

du maïs 192

Manipuler le rhizomicrobiote 195

Approches intégrées, vers la modélisation des interactions plantes micro-organismes 197

Conclusion 199

REFERENCES 201

ANNEXES 212

INTRODUCTION GÉNÉRALE

Figure 1 : Représentation de l’ensemble des micro-organismes de la rhizosphère 21

CHAPITRE 1 : S

B

PARTIE A : A

A

Figure 1: Main bacterial mechanisms involved in alleviation of biotic stresses in plants by

Azospirillum strains and other PGPR 47

Figure 2: Main bacterial mechanisms involved in alleviation of abiotic stresses in plants by

Azospirillum strains and other PGPR 50

PARTIE B : L

Figure 1: Modèle de sélection en deux étapes du microbiote racinaire 81

CHAPITRE 2 : C

-

nifH

acdS

Figure 1 : Comparison of the size of the acdS functional group in three field sites studied over

the four sampling times (A to D) 106

Figure 2 : Comparison of the size of the nifH functional group in three field sites studied over

the four sampling times (A to D) 108

Figure 3 : Correlation between the numbers of nifH and acdS genes 110 Figure 4 : Correlation between Shannon diversity indices of nifH and acdS (A) and between Simpson diversity indices of nifH and acdS (B) 110 Figure 6 : Comparaison of nifH (A), acdS (B) and rrs (C) diversity between sites P, BV and FV

by between class analysis 112

Figure 7 : Co-inertia analysis between acdS and nifH (A), rrs and nifH (B), rrs and acdS (C)

bacterial diversity 114

Figure S1: Rarefaction curves for nifH (A), acdS (B) and rrs (C) genes 121

LIPOFERUM

CRT1

Figure 1 : Effect of seed inoculation with A. lipoferum CRT1 on the composition of the nifH functional group in the maize rhizosphere at 6 leaves at three field sites P (A), BV (B) and FV

(C), in 2015 140

Figure 2 : Effect of seed inoculation with A. lipoferum CRT1 on the composition of the acdS functional group in the maize rhizosphere at 6 leaves at three field sites P (A), BV (B) and FV

(C), in 2015 142

Figure 3 : Effect of seed inoculation with A. lipoferum CRT1 on the composition of the total bacterial community in the maize rhizosphere at 6 leaves at three field sites P (A), BV (B) and

FV (C), in 2015 144

Figure 4 : Effect of seed inoculation with A. lipoferum CRT1 on the composition of diazotrophs (nifH) (A), ACC deaminase producers (acdS) (B)and total rhizobacteria (rrs) (C) over three sites

by inter-class analyses 146

Figure S1: Rarefaction curves for nifH (A), acdS (B) and rrs (C) genes 156 CHAPITRE 4 : E

A

1

Figure 1 : Effect of seed formulation of A. lipoferum CRT1 on the size of nifH, acdS and phlD functional groups at two sampling times of maize in three fields 171 Figure 2 : Effect of seed formulation of A. lipoferum CRT1 on the composition of the diazotroph community (nifH) as indicated by inter-class analyses on each soil studied 174 Figure 3 : Effect of seed formulation of A. lipoferum CRT1 on the composition of the ACC deaminase producers (acdS) as indicated by inter-class analyses on each soil studied 176 Figure 4 : Effect of seed formulation of A. lipoferum CRT1 on the composition of the total bacterial community (rrs) as indicated by inter-class analyses on each soil studied 179 Figure S1: Rarefaction curves for nifH (A), acdS (B) and rrs (C) genes 188 CHAPITRE 5 : D

Figure 1 : Définir le core-microbiote 194

Figure 2 : Vers une agriculture de nouvelle generation 197 Figure 3 : Analyse en réseau sur la cooccurrence des taxons microbien détectés dans des sols gérés de manière conventionnelle ou biologique, par séquençage ADN haut-débit sur des

marqueurs ribosomiques 199

CHAPITRE 1 : S

B

PARTIE A : A

A

Table 1: List of microbes identified for their ability to alleviate plant stress 38

CHAPITRE 2 : C

-

nifH

acdS

Table S1 : Physicochemical characteristics of sites P, BVand FV 121 CHAPITRE 3 : E

-

A

CRT1

Table 1. Effect of seed inoculation with A. lipoferum CRT1 on the size of the nifH, acdS and phlD functional groups in the maize rhizosphere at 6 leaves and flowering at three field sites P, BV

and FV, in 2014 and 2015 136

Table 2. Diversity indices of nifH and acdS functional groups and the rrs bacterial

community 138

Table 3. Effect of A. lipoferum CRT1 on root and shoot parameters of maize at 6 leaves on three

sites 147

Table S1 : Physicochemical characteristics of sites P, BVand FV 157

CHAPITRE 4 : E

PGPR

A

CRT1

Table 1: Effect of seed formulation of A. lipoferum CRT1 on root and shoot parameters of maize

grown at three field sites 168

ACC : 1-aminocyclopropane-1-carboxylique acide ADN/DNA : Acide DesoxyriboNucléïque

ANOVA : Analysis Of Variance

ANR : Agence Nationale de la Recherche ARN/RNA : Acide RiboNucléïque BCA : Between Class-Analysis

BLAST : Basic Local Alignment Search Tool CIA : Co-Inertia Analysis

DAPG : 2,4-diacetylphloroglucinol

DGGE : Denaturing Gel Gradient Electrophoresis

FAO : Food and Agriculture Organization of the United Nations HCN : Cyanure d’Hydrogène

LSD : Least Square Difference

NCBI : National Center for Biotechnology Information NO : Oxyde nitrique

OTU : Operational Taxonomic Unit PCRq : Polymerase Chain Reaction

PGPR : Plant Growth Promoting Rhizobactéria RV : Rapport de Vraisemblance

T-RFLP : Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism

INTRODUCTION GENERALE

“I

’

”

N

M

La Terre est un environnement hétérogène, où la vie se développe, se diversifie et évolue de manière dynamique depuis près de 4 milliards d’années (Line, 2002), formant une biosphère complexe. Le vivant a colonisé l’ensemble de la planète, des déserts aux océans, de l’équateur jusqu’aux pôles (Kasting and Siefert, 2002; Reysenbach and Shock, 2002; Gorbushina and Broughton, 2009; Wong et al., 2009; Orcutt et al., 2011). La colonisation de l’ensemble de ces environnements se traduit par une diversité d’organismes remarquables avec pour base trois domaines : les eucaryotes, les procaryotes et les archées (Pace, 1997). Chacune de ces branches du vivant se ramifie en une multitude d’ordres, familles, genres et espèces qui peuvent souvent coexister dans un même environnement. Les individus ne vivent pas isolés les uns des autres, mais interagissent constamment ou épisodiquement entre eux, quelle que soit la distance génétique qui les sépare et, dans une certaine mesure, l’environnement dans lequel ils évoluent (Brown et al., 2001; Gómez et al., 2010). Les interactions aussi multiples et diversifiées soient- elles semblent ainsi être une caractéristique majeure de l’évolution du vivant. La plupart des grandes catégories d’interactions biotiques peut être illustrée au niveau intra-spécifique, inter- spécifique ou encore inter-domaine (Gómez et al., 2010). Cette interconnexion à tous les niveaux du vivant participe largement au dynamisme et à l’activité des écosystèmes (Newman and Banfield, 2002; Wardle et al., 2004; Van Der Heijden et al., 2008a; Harris, 2009; Agler et al., 2016). Ainsi au sein d’un biotope, on peut retrouver des interactions à caractère conflictuel comme la compétition, l’antagonisme et la prédation, mais aussi des interactions à caractère bénéfique comme le commensalisme, la coopération et le mutualisme (Zilber-Rosenberg and Rosenberg, 2008).

Les interactions eucaryotes-procaryotes sont remarquables par leurs diversités et leurs rôles écologiques, comme dans le cycle du carbone ou de l’azote (Falkowski et al., 2008;

Jackson et al., 2008; Canfield et al., 2010; Gougoulias et al., 2014). Ces interactions plus ou

moins spécifiques nécessitent souvent la mise en place d’échanges d’informations entre les

partenaires, ce qui peut conduire à un processus de coévolution (Lambers et al., 2009). C’est

notamment le cas des interactions entre les végétaux et des micro-organismes qui leur sont

associés dans la rhizosphère, la zone du sol sous l’influence des racines. L’ensemble des micro-

organismes qui colonise les racines de la plante constitue le microbiote racinaire ou

rhizomicrobiote (Figure 1).

Figure 1 : Représentation de l’ensemble des micro-organismes de la rhizosphère (Mendes et al 2013). La taille des cercles (sauf pour les virus) est proportionnelle au nombre moyen de gènes dans les génomes présents dans les espèces représentatives de chaque groupe d’organismes. La gamme de taille de leurs génomes est indiquée entre parenthèses et leurs abondances approximatives sont indiquées entre crochets. Les micro-organismes endophytes ne sont pas incluent.

Ce microbiote est soumis à plusieurs facteurs biotiques et abiotiques qui affectent la diversité,

l’abondance et l’activité des taxons qui le compose (Turner et al., 2013; Lakshmanan et al.,

2014; Hacquard et al., 2015). Ainsi, le génotype de la plante va avoir un effet important sur la

structure taxonomique du microbiote racinaire. En effet, le recrutement du microbiote est un

processus en partie actif (Hartmann et al., 2008; Pieterse et al., 2016) et s’effectue au travers

des exsudats racinaires que la plante libère (Bais et al., 2006; Haichar et al., 2008; Tkacz et al.,

2015). La nature et la quantité des constituants sécrétés sont des éléments déterminants pour la

compréhension de la structure génétique du microbiote. On sait ainsi que la distance génétique

qui sépare des variétés de plantes peut se traduire par un profil d’exsudation différent et donc

par un rhizomicrobiote différent (Berendsen et al., 2012; Peiffer et al., 2013; Bouffaud et al.,

2014). De même, la structure génétique du microbiote racinaire est influencée par le stade de

croissance de la plante ou encore les conditions environnementales auxquelles il est soumis (Chaparro et al., 2014). Un autre facteur important permettant d’expliquer la structure taxonomique du rhizomicrobiote est la nature du sol. En effet, la structure physique et la composition chimique des sols sont autant de variables explicatives de la diversité microbienne de la rhizosphère (Peiffer et al., 2013; Bakker et al., 2015).

Au niveau du rhizomicrobiote, la coopération bactéries-plante présente un intérêt particulier, de par la diversité et la redondance des partenaires microbiens présents et leurs répercutions très fortes sur la santé et le développement du végétal. La coopération (synonyme, symbiose associative) est une interaction facultative à bénéfices réciproques pour les partenaires, qui existe notamment entre les bactéries rhizosphériques stimulatrices de la croissance des plantes, appelées aussi Plant Growth-Promoting Rhizobacteria (PGPR) et les plantes. Les PGPR possèdent des fonctions phytostimulatrices qui améliorent la croissance et la nutrition des plantes par des mécanismes hormonaux ou qui augmentent la disponibilité des éléments nutritifs minéraux, et des fonctions phytoprotectrices grâce à des mécanismes d’antagonisme, de compétition ou d’induction de résistance systémique (Vacheron et al., 2013).

Pour mieux comprendre le rôle écologique des fonctions phytobénéfiques impliquant

les PGPR dans la rhizosphère, il est nécessaire de mettre en place des démarches scientifiques

qui prennent en compte l’ensemble des micro-organismes qui participent à la réalisation de ces

fonctions, sachant qu’une même fonction peut être portée par des taxons différents (redondance

fonctionnelle) (Loreau, 2010; Morales and Holben, 2011; Moya and Ferrer, 2016). L’ensemble

des micro-organismes participant à une fonction écologique donnée représente un groupe

fonctionnel ou une communauté fonctionnelle (Torsvik and Øvreås, 2002). La caractérisation

d’un groupe fonctionnel microbien permet d’identifier taxonomiquement les populations

impliquées ainsi que leur contribution relative au fonctionnement de leur écosystème. Des

approches, de type groupe fonctionnel, ont été largement utilisées dans divers types

d’environnements et pour plusieurs types de fonctions, notamment pour des fonctions de

biotransformation comme celles du cycle de l’azote (nitrification, dénitrification, fixation

d’azote, ammonification ; Cavigelli and Robertson, 2000; Patra et al., 2005) ou du carbone

(dégradation de la cellulose, de la lignine, etc. ; Bardgett et al., 2008; Schimel and Schaeffer,

2012). Pour certains groupes fonctionnels microbiens, la fonction écologique correspondante

est codée par un gène ou un opéron qui est commun aux différents membres du groupe

fonctionnel (Poly et al., 2001; Zak et al., 2006; Spaepen et al., 2007; Prigent-Combaret et al.,

2008). Ces gènes possédant des régions conservées entre espèces permettent d’étudier la totalité

pour suivre la diversité, l’abondance et l’expression génique des groupes fonctionnels microbiens (Patra et al., 2005; Zak et al., 2006; Bouffaud et al., 2016), donnant ainsi une vision globale de leur contribution au fonctionnement écologique du milieu. Dans le cas des bactéries en coopération avec la plante, ce type d’approche peut être suivi pour faciliter notre compréhension des interactions biotiques et abiotiques dans la rhizosphère (Donn et al., 2014).

Pendant longtemps, l’influence des micro-organismes du sol sur la croissance des plantes a été négligée dans l’analyse des pratiques agricoles. En effet, la révolution agricole du milieu du siècle dernier était focalisée sur la sélection de variétés de plantes plus productives ainsi que l’utilisation d’intrants chimiques tels que les pesticides et les fertilisants (Pimentel, 1996; Khush, 2001; Evenson and Gollin, 2003; Lynch, 2007). Cette « révolution verte » a permis une sécurisation alimentaire alors même que la démographie mondiale était en forte augmentation. Cependant, ces pratiques agricoles ont appauvri les ressources disponibles en matières fertilisantes et entrainé des pollutions sévères qui ont un impact important sur l’environnement, comme i) la pollution des nappes phréatiques par lixiviation du nitrate et d’herbicides, ainsi que des cours d’eau par ruissellement de matières fertilisantes et pesticides (Bundschuh et al., 2014; McKnight et al., 2015; Rasmussen et al., 2015), ii) l’accumulation de résidus de pesticides dans les plantes, ou encore iii) la réduction (par l’utilisation d’insecticides notamment) de l’activité de pollinisation de certains insectes (Gill et al., 2012; Stanley et al., 2015). Nous savons également aujourd’hui que l’utilisation de produits phytosanitaires peut impacter la diversité microbienne des sols (Jacobsen and Hjelmsø, 2014). A ces difficultés s’ajoutent maintenant les changements climatiques en cours, qui constituent un nouveau défi pour l’agriculture, car il faudra conserver des rendements élevés dans des conditions environnementales où les plantes seront plus exposées à des stress abiotiques tels que la sècheresse, la salinisation ou l’érosion des sols (Teixeira et al., 2013). Dans ce contexte, de nouvelles pratiques agricoles et de nouvelles écotechnologies sont nécessaires pour permettre une « nouvelle révolution verte », cette fois-ci reposant sur des stratégies durables avec une gestion plus responsable des ressources agricoles et fossiles (Herder et al., 2010). Les micro- organismes peuvent être utiles à prendre en considération dans ces approches.

La nouvelle transition agricole à effectuer passe par une optimisation du fonctionnement

du système racinaire des plantes, une part importante de la biomasse végétale qui a été négligée

jusqu’ici (Herder et al., 2010). En ce qui concerne le végétal, cela implique la sélection de

variétés présentant une architecture et un fonctionnement racinaires favorisant l’acquisition des

nutriments nécessaires à la plante (Lynch, 2007). Du côté des partenaires de la plante, cela

signifie mieux valoriser les relations de symbiose et de coopération avec les micro-organismes

du sol (Bulgarelli et al., 2013; Philippot et al., 2013; Vacheron et al., 2013). Pour ce faire, une stratégie possible repose sur l’utilisation de micro-organismes inoculés dont les effets phytobénéfiques permettraient de limiter l’utilisation d’intrants chimiques (Vessey, 2003;

Bhattacharyya and Jha, 2012; Chaparro et al., 2012; Glick, 2012). C’est une stratégie qui est déjà utilisée à grande échelle en Amérique du Sud, où 25 millions d’hectares de culture de soja sont inoculés avec Bradyrhizobium japonicum et un demi-million d’hectares de blé et de maïs avec Azospirillum (Okon and Labandera-Gonzalez, 1994; Castro-Sowinski et al., 2007). Ces technologies sont en pleine expansion et il existe aujourd’hui une grande variété de micro- organismes qui sont utilisés comme inoculum sur de nombreuses plantes d’importance agronomique (Bashan et al., 2013). Néanmoins, les bénéfices potentiels de ces interactions plantes-bactéries sont sous-exploités, et leur potentiel de développement reste à matérialiser davantage par des applications concrètes.

Les PGPR inoculées interagissent avec les communautés microbiennes indigènes en limitant le développement de phytopathogènes par antagonisme ou compétition, mais aussi potentiellement en stimulant des micro-organismes phytobénéfiques déjà présents (Requena et al., 1997; Philippot et al., 2013). La majorité des études sur ces mécanismes phytobénéfiques indirects concerne le biocontrôle (Haas and Défago, 2005; Mendes et al., 2011; Beneduzi et al., 2012), plus rarement les interactions de l’inoculum avec les populations indigènes phytobénéfiques stimulant le développement des plantes (Castro-Sowinski et al., 2007; Trabelsi et al., 2013; Ambrosini et al., 2016). Sur cette base, on peut proposer l’hypothèse générale selon laquelle l’influence de l’inoculation d’une PGPR sur la structure génétique et le fonctionnement de certains groupes fonctionnels serait l’une des clefs pour comprendre les effets bénéfiques observés sur la plante. L’objectif général de ce travail de thèse est d’étayer cette hypothèse, à savoir de déterminer par une démarche expérimentale si l’inoculation d’une PGPR peut modifier la structure génétique de communautés fonctionnelles microbiennes de la rhizosphère importantes pour le développement des plantes.

Ainsi, afin d’évaluer l’impact d’un inoculum sur le fonctionnement du rhizomicrobiote,

nous avons choisi d’évaluer l’impact de l’inoculation de la PGPR Azospirillum lipoferum CRT1

(fixatrice d’azote) sur l’abondance de la communauté bactérienne et, en parallèle, sur la

diversité et l’abondance de trois groupes fonctionnels microbiens que sont les fixateurs d’azote,

les producteurs de 1-aminocyclopropane-1-carboxylique acide (ACC) désaminase, et les

producteurs de 2,4-diacetylphloroglucinol (DAPG) dans la rhizosphère du maïs. Il s’agit pour

les fixateurs d’azote d’un groupe fonctionnel auquel la souche inoculée peut participer, et qui

auquel les plantes sont exposées (Dobbelaere et al., 2003). Par contre, la production d’ACC désaminase (modification des teneurs racinaires en éthylène) ou de DAPG (modification des effets auxiniques chez la plante, ISR, et inhibition de pathogènes), deux fonctions phytobénéfiques importantes (Yang et al., 2009; Glick, 2012; Bulgarelli et al., 2013), ne sont pas présentes dans la souche inoculée.

Nous avons choisi comme modèle végétal le maïs, une plante d’origine subtropicale, domestiquée à partir d’une téosinte, et qui a été disséminée à travers le monde par l’Homme (Diamond, 2002; Doebley, 2004). Au fil du temps, les variétés les mieux adaptées aux différentes conditions pédoclimatiques régionales ont été sélectionnées afin d’augmenter les rendements, conduisant à la formation de cinq grands groupes génétiques de maïs (Camus- Kulandaivelu et al., 2006). Cette plante peut produire une biomasse élevée, et sa culture nécessite des apports en azote et en eau relativement importants. De plus, son cycle de développement ne permet pas une exploitation optimale des ressources du milieu dans les régions climatiques tempérées du Nord-Ouest de l’Europe (Milbourn, 1977). En effet, le maïs est semé tardivement au printemps, ce qui ne lui permet pas de profiter du maximum de rayonnement solaire (en juin). Sa capacité photosynthétique maximale est atteinte tardivement (stade floraison), avec un développement important en juillet et août, alors que le rayonnement solaire diminue et que les déficits hydriques sont élevés (Girardin, 1998; FAO, 2015). Ainsi, dans les régions tempérées, le maïs est une plante fréquemment exposée à des conditions sub- optimales de développement, surtout dans des contextes de limitation des intrants azotés et de l’irrigation. Ces éléments font du maïs un bon candidat à l’utilisation de micro-organismes phytobénéfiques afin de limiter les effets des stress environnementaux qu’il peut subir.

La démarche expérimentale a été de semer des graines de maïs enrobées avec la PGPR A. lipoferum CRT1 sur trois champs possédant des caractéristiques physico-chimiques variées, avec différentes modalités d’apport en azote minéral. Les mesures d’abondance des groupes fonctionnels acdS (ACC désaminase), nifH (fixation d’azote) et phlD (production de DAPG) ont été effectuées par PCR quantitative, et leurs diversités par séquençage à haut débit (Illumina MiSeq).

Ces recherches ont été conduites dans le cadre du projet AZODURE financé par le programme Agrobiosphère de l’agence nationale de la recherche (ANR).

Ce manuscrit comporte cinq chapitres. Le premier est une synthèse bibliographique

comportant deux parties. La première, est un chapitre du livre Handbook for Azospirillum

intitulé Alleviation of abiotic and biotic stresses by Azospirillum. Il est consacré à la

présentation des mécanismes d’action, des rhizobactéries et plus particulièrement du genre

Azospirillum, permettant de limiter les effets des stress environnementaux sur les plantes. La seconde partie de ce chapitre intitulée « Le microbiote rhizosphérique et son fonctionnement » traite de i) de la construction du microbiote rhizosphérique, ii) de la structure et dynamique des communautés fonctionnelles qui le composent et iii) de la manipulation du rhizomicrobiote par l’inoculation de micro-organismes.

Le second chapitre intitulé Co-occurrence of nifH and acdS bacteria in the maize rhizosphere est rédigé sous forme d’article. Ce chapitre traite de la structuration des groupes fonctionnels des diazotrophes et producteurs d’ACC désaminase dans la rhizosphère du maïs.

Cette structuration a été étudiée à la fois au niveau de la taille et de la diversité par des approches de corrélations et de co-inerties.

Le troisième chapitre, intitulé Effect of phytostimulatory seed-inoculant Azospirillum lipoferum CRT1 on maize and key microbial functional groups in the rhizosphere, étudie l’impact de l’inoculation d’Azospirillum CRT1 sur la croissance du maïs, la structure génétique de la communauté bactérienne de la rhizosphère et des groupes fonctionnels des fixateurs d’azote et des producteurs d’ACC désaminase. Pour cela nous avons utilisé une approche basée sur l’évaluation de la taille des communautés par PCR quantitative (étendue aux producteurs de DAPG) et la richesse par séquençage Illumina MiSeq.

Le quatrième chapitre, intitulé Effect of seed formulation on the impact of the PGPR inoculant Azospirillum lipoferum CRT1 on growth of field maize and selected microbial functional groups in the rhizosphere, analyse l’impact de la formulation utilisée pour inoculer A. lipoferum CRT1 sur la croissance du maïs et la structure génétique des diazotrophes et des producteurs d’ACC désaminase.

Le chapitre cinq est une discussion générale sur l’ensemble des résultats obtenus, où sont également abordées les limites et perspectives de ces travaux.

Les annexes présentent la production scientifique qui a fait l’objet de collaboration

durant cette thèse, mais qui sont en-dehors du sujet principal de la thèse. La première est un

article intitulé Is plant evolutionary history impacting recruitment of diazotrophs and nifH

expression in the rhizosphere?, publié dans la revue Scientific Reports. Un second article

intitulé Analysis of hydroxycinnamic acids degradation in Agrobacterium fabrum reveals a

CoA-dependent, beta-oxidativedeacetylation pathway a été publié dans la revue Applied and

Environmental Microbiology.

CHAPITRE 1

S YNTHÈSE BIBLIOGRAPHIQUE

PARTIE A :

A LLEVIATION OF ABIOTIC AND BIOTIC STRESSES IN PLANTS BY A ZOSPIRILLUM

Jordan Vacheron

, Sébastien Renoud

, Daniel Muller

, Olubukola Oluranti Babalola

, Claire Prigent-Combaret

1

Université de Lyon, F-69622, Lyon; Université Lyon 1, Villeurbanne ; CNRS, UMR5557, Ecologie Microbienne, Villeurbanne, France

2

Dept. Biological Sciences, Faculty of Agriculture, Science and Technology, North-West University, Mafikeng Campus. Private Bag X2046, Mmabatho 2735, South Africa

*: Two first co-authors

Chapitre 19

Handbook for Azospirillum

pp 333-365

Abstract

In the face of global changes, plants must adapt to a wide range and often combined biotic and abiotic stresses that seriously impaired plant growth and development. Plants develop complex strategies to deal with water stress conditions, soil fertility losses, soil pollutions, pests and disease. Emerging evidence suggest the involvement of common hormonal players in plant defense signaling pathways triggered in response to biotic and abiotic stresses. Besides plant strategies, plant growth-promoting rhizobacteria (PGPR), which colonize the root system and establish cooperative interactions with plants can improve their growth and help them to adapt to and cope with multiple stresses including drought, salinity, heavy metal pollutions, and parasites. Accordingly, PGPR supply added values to the plant defense strategies by expressing many relevant functions for modulating the plant hormonal balance, increasing nutrients supply to the plant, improving the functional and physical properties of protective barriers against plant parasites. Among PGPR, Azospirillum strains were long viewed as biofertilizers and less as biocontrol agents. It is becoming evident that Azospirillum is able to protect plants against a myriad of detrimental conditions. This review provides an update of works regarding the ability of Azospirillum strains to alleviate plant stress and brings out the relevant involved plant- beneficial functions. Developing PGPR based bio-inoculants is a promising strategy to improve the growth and health of crops and develop sustainable agriculture.

Keywords: plant stress alleviation, plant growth-promoting rhizobacteria, Azospirillum, plant

hormonal balance modulation, plant nutrition improvement, biocontrol, induced systemic

resistance.

1. Introduction

As principal producers of organic matter, plants play a major role in ecosystem dynamics at both micro and macroscopic scales. Through their roots, plants strongly influence the physical structure and chemical composition of the soil compartment (Hiltner 1904). The region of soil directly under the influence of roots, called the rhizosphere, is colonized by a huge abundance and diversity of microorganisms in continuous interactions with plants (Hartmann et al. 2008). A root system releases a large quantity of amino acids, sugars and organic compounds by a phenomenon called root exudation (Haichar et al. 2014). Root exudates constitute a real “buffet” for rhizospheric microorganisms (López-Guerrero et al.

2013), and according to their chemical compositions they modulate the structure, abundance and diversity of microbial communities in the rhizosphere. These microorganisms associated to the roots, including fungi, protozoa, nematodes, and bacteria, constitute the rhizo-microbiote.

These microorganisms can establish a wide range of ecological interactions with plants, ranging from parasitism to symbiosis, and passing by commensalism (Hartmann et al. 2008).

Plants and their rhizo-microbiote must cope with environmental condition changes and can suffer from different biotic (diseases, competition for resources) and abiotic (drought, cold, acidification) stresses. In a context of global changes caused by human activities (urbanization, pollution and deforestation), stresses to which plants must adapt are more diverse, important and frequent (IPCC 2001). Since the middle of the twentieth century, synthetic fertilizers and pesticides have considerably improved crop yields. This “green revolution” has allowed the world population to increase. However, chemical inputs and intensive use of soils caused environmental pollutions and soil fertility troubles (Gerhardson 2002, Ramirez et al. 2012, Eisenhauer et al. 2012). The world population still continues to grow rapidly. Increasing agricultural production is thus desirable, but the potential for expanding agriculture area is limited and chemical inputs are harmful to animals and humans and can accumulate in the environment. Environmentally friendly solutions, based on the use of microorganisms as biofertilizers and biocontrol agents, exist to improve crop yields (Berg and Smalla 2009).

However, these solutions are rarely used by farmers due to their small commercial scale.

Developing these solutions requires better understanding the interactions between plants and their rhizo-microbiote, especially under biotic and abiotic stress conditions.

Modifications of environmental conditions can dramatically affect plant development

and deeply modify the structure and diversity of root-associated microbiotes (Compant et al.

2010). Plants set up various physiological responses to limit the effects of stress on their development. The rhizo-microbiote can be directly affected by biotic and abiotic stresses, but also indirectly through the physiological modifications induced by stresses in plants.

Conversely, the rhizo-microbiote can also modify plant physiology and help it to tolerate stresses. Indeed, cooperative microorganisms have plant beneficial properties like inducing plant systemic defense, improving mineral nutrition and controlling plant pathogen development (Vacheron et al. 2013). Plant beneficial properties are recovered especially in Plant Growth-Promoting Rhizobacteria (PGPR), which do not belong to a unique phylogenetic clade (Bruto et al. 2014). PGPR establish associative symbiosis with plant and colonize their roots without inducing the formation of a symbiosis-dedicated organ.

Several studies demonstrate the ability of PGPR to alleviate biotic and abiotic stresses affecting plants (Dimkpa et al. 2009). The most studied PGPR belong to the genus Bacillus, Pseudomonas, and Enterobacter (Babalola and Akindolire 2011). Bacteria of the genus Azospirillum are less known as being able to protect plants against stresses, but they have several plant beneficial functions potentially efficient to alleviate biotic and abiotic plant stress (Wisniewski-Dyé et al. 2011). These include i) modification of the plant hormonal balance (auxin production, ethylene modulation) resulting in root system augmentation; ii) improvement of mineral nutrition by siderophores production and fixation of atmospheric nitrogen; iii) production of antimicrobial compounds and inducing plant systemic defenses.

This chapter focuses on the technical methods that bring to light the beneficial traits of PGPR and, in particular, of bacteria from Azospirillum genus for their role in alleviating biotic and abiotic plant stresses.

2. Plant responses to biotic and abiotic stresses

a- Responses to biotic stresses

Mechanisms of plant defense against biotic stresses are complex and consist of several

layers of defense. The recognition of Pathogen-Associated Molecular Patterns (PAMPs) can

lead to the induction of protective responses in plants, such as callose deposition, oxidative

bursts, production of antimicrobial compounds, and programmed cell death. This response

corresponds to PAMP-Triggered Immunity (PTI). If pathogens are able to secrete effectors that

suppress PTI, disease occurs resulting in Effector-Triggered Susceptibility (ETS). If pathogens

secrete effectors that are recognized by the plant, plant disease resistance occurs resulting in

Effector-Triggered Immunity (ETI). The latter involves the recognition of an avirulent (Avr) factor from the pathogen by a plant resistance protein (R). This leads to a hypersensitive response (HR), corresponding to a localized cell death that prevents root invasion of plant tissue by the pathogen.

Plants respond to pathogen attack by synthesizing pathogenesis related (PR) proteins.

They encode enzymes like chitinases and glucanases that can hydrolyze the cell walls of fungal pathogens (Mauch et al. 1988). In addition, plants also use the proteasome system to degrade proteins impaired by cellular stress. Ubiquitin is used to trigger this response (Dreher and Callis 2007). It acts as a covalent molecular tag to target proteins that must be degraded. After delivery to the proteasome, the poly-ubiquitylated substrates can be de-ubiquitylated and cleaved in small peptides to release free amino-acids.

The induction of many defense related genes is often linked to the increase of plant endogenous content of salicylic acid (SA), a key signaling molecule involved in plant defense against pathogens, and the establishment of the Systemic Acquired Resistance (SAR), which renders the plant more resistant to subsequent attacks by pathogens.

Besides SA, reactive oxygen species (ROS) produced in part from mitochondria and nitric oxide (NO) contents strongly increase following pathogen recognition. All of these signaling molecules coordinate defense responses in plant (Alvarez 2000, Neill et al. 2002, Laloi et al. 2004, Wendehenne et al. 2004, Delledonne 2005, Torres and Dangl 2005, Amirsadeghi et al. 2007).

Another key hormone, ethylene (ET), plays a major role in plant responses to pathogens. ET is both a plant growth regulator and a stress hormone. ET is produced endogenously by plants and in soil and plays a key role in inducing multifarious physiological changes in plants at molecular level. Under stress, the endogenous production of ET is accelerated substantially. This hormone stimulates the transcription of numerous defense- related genes (Dreher and Callis, 2007). Transcription factors of the EIN3 (Ethylene-insensitive 3) family play a major role in the regulation of plant defense responses (van Loon et al., 2006).

Jasmonate (JA) promotes resistance to microbial pathogens and to insects. JA and ET mostly

operate synergistically to activate the expression of defense related genes, and share a similar

target gene network (Schenk et al. 2000). Contrariwise, SA and JA mostly operate in opposite

ways. Certain key regulators play a pivotal role in the balance between SA and JA pathways

(Li et al. 2006). For instance, it has been shown in Arabidopsis that the transcription factor

WRKY70 acts as a positive regulator of SA-dependent defenses and a negative regulator of JA-

dependent defenses whereas the Mitogen Activated Protein Kinase 4 (MPK4) acts inversely.

The Nonexpressor of Pathogenesis-Related genes 1 (NPR1) also plays an important role in regulating the SA and JA pathways. It is important to note that the expression of PR1 is typically used as a marker of the induction of SA-dependent defense pathway (Martin et al. 2003), while the plant defensive PDF1.2 is one of the most useful markers for the induction of SA- independent defense pathway (Pieterse et al. 2002).

Numerous studies provide evidence that plant defense signaling networks are extremely complex. The involvement of auxin, abscisic acid (ABA) and gibberellic acid also act as important components of the signaling network involved in the regulation of defense responses against various pathogens (Bari and Jones 2009). Defense signaling networks activated by the plant depend on the life modes of pathogens. Briefly, SA is mainly involved in the activation of defense responses against biotrophic and hemi-biotrophic pathogens whereas JA and ET are usually involved with defense against necrotrophic pathogens. Since pathogens are able to produce phytohormones, numerous recent studies suggest that pathogens can manipulate the defense-related regulatory network of plants. Thus plant pathogens seem to manipulate components of hormone biosynthesis and signaling machinery leading to hormone imbalances and alterations in plant defense responses.

b. Responses to abiotic stresses

Plants have developed common strategies to cope with abiotic stresses like drought, flooding, salinity, chilling, or high temperatures. One common mechanism involves the accumulation of compatible solutes, like glycine betaine (amine), trehalose (sugar), proline (amino acids), etc (Ashraf and Foolad 2007, Seki et al. 2007).

In many plant species, the quaternary amine, glycine betaine, is synthesized from choline at high level in response to various types of abiotic stresses, and protects plants against water deficiency, frost and salinity (Chen and Murata 2002). It acts by stabilizing the quaternary structures of enzymes and proteins, and protecting cell membranes.

Other compatible solutes like mannitol, proline and sorbitol are produced for

scavenging ROS, which are produced by plants experiencing drought, salt and temperature

stresses. ROS can directly damage cellular components, and the accumulation of compatible

solutes may protect cells against increased levels of ROS, thereby resulting in the protection of

plants against stress-induced damages (Chen and Murata 2002). Accordingly, up-regulation of

anti-oxidative enzymes, like superoxide dismutase, is a general response to different abiotic stress conditions.

Polyamines such as putrescine, spermidine and spermine also accumulate in response to abiotic stresses. Transcriptomic analyses in the model plant Arabidopsis, the utilization of polyamine-overproducing transgenic plants or, contrariwise, of mutants deficient in polyamine biosynthesis permit to evidence the involvement of polyamines in the tolerance of plants to different kind of stresses (Alcázar et al. 2006). It has been suggested that they may act as ROS scavenging molecules and as membrane protectors.

In response to water deficit or salinity stress, plants increase the synthesis of osmolytes (Farooq et al. 2009), thereby leading to increased osmotic potentials within cells and adaptation of the plant to drought. ABA plays a prominent role in plant responses to drought. It can directly affect ion transport in guard cells, thereby controlling stomatal aperture and plant transpiration (Roelfsema et al. 2004). In addition, it induces the expression of drought stress-related genes.

The level of this hormone increases in response to drought and salt stresses (Seki et al. 2007).

The levels of several other hormones are induced in response to abiotic stresses. This is the case of the ET stress hormone, whose synthesis increases when plants are exposed to different types of abiotic stresses. As mentioned previously, the EIN3 transcription factor acts as a positive regulator that turns on a complex upstream network of signaling responses thereby leading to the activation of numerous defense reactions (cell wall modification, oxidative burst).

Increased levels of NO synthesis and subsequently the up-regulation of NO-dependent defense genes are observed in response to drought, high or low temperature, salinity, heavy metals and oxidative stress (Arasimowicz and Floryszak-Wieczorek 2007).

Increasing evidence suggests that crosstalk exists between plant responses to biotic and abiotic stresses. Signaling pathways regulated by ABA, and ET, play key roles in this crosstalk (Fujita et al. 2006). The generation of ROS appears as a key convergent response mechanism between biotic and abiotic stresses (Mittler et al. 2004, Fujita et al. 2006).

Transcriptomic analyses have thus revealed that a large set of genes that encode ROS-

scavenging enzymes are commonly induced when plants are subjected to abiotic and biotic

stress treatments (Fujita et al. 2006). Plants respond to biotic and abiotic stresses by changing

their physiology and metabolism, in order to limit the negative effects of stresses on plant

tissues. Root-associated microbial communities might also help them. Some rhizobacteria are

indeed capable of alleviating biotic and/or abiotic stresses.

3. Plant stress alleviation by rhizobacteria

a- Rhizobacteria able to reduce stress in plants

Rhizobacteria, including PGPR, dispose of a wide range of beneficial functions that may increase plant growth under stress condition (Dimkpa et al. 2009). A broad taxonomic and functional diversity occurs in the plant rhizosphere (Bouffaud et al. 2014) and may affect plant fitness under stress condition (drought, salinity, pollutions, parasite attacks, etc., Table 1).

PGPR are found in all clades of Proteobacteria especially in Alphaproteobacteria, Betaproteobacteria, and Gammaproteobacteria, and in Firmicutes such as in Actinobacteria.

Hence, there are no specific media or a unique way to isolate PGPR able of alleviate stress in plant. Functional approaches can be developed to select potential PGPR.

Table 1: List of microbes identified for their ability to alleviate plant stress

Stress type Bacteria inoculated Plant species Reference

Abiotic stresses

Arsenic Bradyrhizobium japonicum CB1809 Sunflower (Helianthus annus) Reichman 2014 Wheat (Triticum aestivum)

Cadmium Rhizobium sp. Italian ryegrass (Lolium multiflorum) Guo and Chi 2014

Soybean (Glycine max)

Cadmium and lead Arthrobacter mysorens 7 Barley (Hordeum vulgare) Belimov et al. 2004 Agrobacterium radiobacter 10

Flavobacterium sp. L30 Azospirillum lipoferum 137

Cadmium and Zinc Rhodococcus erythropolis EC 34 Clover (Trifolium repens) Pereira et al. 2014 Achromobacter sp. 1AP2

Microbacterium sp. 3ZP2

Drought Achromobacter piechaudii Tomato (Lycopersicon esculentum) Mayak et al. 2004

Drought Pseudomonas sp. Pea (Pisum sativum) Arshad et al. 2008

Drought Bacillus sp. Lettuce (Lactuca sativa) Vivas et al. 2003

Drought A. lipoferum Maize (Zea mays) Bano et al. 2013

Drought A. brasilense Sp245 Wheat (T. aestivum) Creus et al. 2004

Drought A. brasilense AZ-39 Rice (Oryza sativa) Ruíz-Sánchez et al. 2011

Drought A. brasilense Sp245 Arabidopsis thaliana Cohen et al. 2014

Drought P. mendocina Palleroni Lettuce (Lactuca sativa) Kohler et al. 2008

Drought Consortium of B. cereus AR156, B. subtilis

SM21, and Serratia sp. XY21 Cucumber (Cucumis sativus) Wang et al. 2012 Drought Phyllobacterium brassicacearum STM196 Arabidopsis thaliana Bresson et al. 2013 Nitrogen deficiency A. brasilense VS9 Tomato (L. esculentum) Esquivel-Cote et al. 2010

A. lipoferum AZm5

Insoluble phosphate Bacillus sp. Maize (Z. mays) Pal et al. 1998

Fingermillet (Elosine coracana) Amaranth (Amaranthus hypochondriacus) Buckwheat (Fagopyrium esculentum) Frenchbean (Phaseolus vulgaris)

Salt P. fluorescens Canola (Brassica napus) Jalili et al. 2008

P. putida