Formulation de nanoparticules d’ADN fonctionnalisées par des peptides ligands des chaînes LC8 de la dynéine pour améliorer le trafic intracellulaire dans le transfert de gènes non viral

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Formulation de nanoparticules d’ADN fonctionnalisées

par des peptides ligands des chaînes LC8 de la dynéine

pour améliorer le trafic intracellulaire dans le transfert

de gènes non viral

Coralie Charrat

To cite this version:

Coralie Charrat. Formulation de nanoparticules d’ADN fonctionnalisées par des peptides ligands des chaînes LC8 de la dynéine pour améliorer le trafic intracellulaire dans le transfert de gènes non viral. Autre. Université Nice Sophia Antipolis, 2016. Français. �NNT : 2016NICE4017�. �tel-01358416�

1

-UNIVERSITE NICE SOPHIA ANTIPOLIS

_–

UFR Sciences

Ecole Doctorale « Sciences Fondamentales et Appliquées »

THESE

pour obtenir le grade de

Docteur en Sciences

de l’UNIVERSITE Nice Sophia Antipolis

Discipline : Chimie (section 32)

présentée et soutenue par

Coralie CHARRAT

FORMULATION DE NANOPARTICULES D’ADN FONCTIONNALISEES

PAR DES PEPTIDES LIGANDS DES CHAINES LC8 DE LA DYNEINE

POUR AMELIORER LE TRAFIC INTRACELLULAIRE

DANS LE TRANSFERT DE GENES NON VIRAL

Thèse dirigée par Christophe DI GIORGIO

soutenue le 22 Avril 2016 devant le jury composé de

Dr Ling PENG

Directeur de Recherche CNRS

Centre Interdisciplinaire de Nanoscience de Marseille - UMR 7325

Université d’Aix-Marseille

Rapporteur

Dr Patrick MIDOUX

Directeur de Recherche

Centre de Biophysique Moléculaire - UPR 4301 Université d’Orléans

Rapporteur

Dr Rachid BENHIDA

Directeur de Recherche CNRS

Institut de Chimie de Nice - UMR 7272 Université Nice Sophia Antipolis

Examinateur

Dr Christophe DI GIORGIO

Maître de conférences

Institut de Chimie de Nice - UMR 7272 Université Nice Sophia Antipolis

3

5

-R

EMERCIEMENTS

Merci en premier lieu à la directrice de l’Institut de Chimie de Nice (ICN), Elisabeth Duñach, ainsi qu’au directeur de l’équipe « molécules bioactives », Rachid Benhida, pour leur accueil. Je remercie aussi très chaleureusement mon directeur de thèse, Christophe Di Giorgio, pour la réalisation de ce projet. Merci de m’avoir accordé ta confiance et d’avoir encadré mon travail avec un œil critique et bienveillant. Je remercie également Lionel Massi, Marc Gayinski, Jean­Marie Guigonis (TIRO, iBEB), Agnès Loubat (iBV) et Olga Volkova (LPMC) pour leur collaboration. Un grand merci à Béatrice Cambien (Laboratoire TIRO, iBEB, Nice) pour m’avoir accueilli dans ses locaux alors que la chance ne me souriait plus tellement en cette fin de thèse.

***

Je remercie ensuite, tout particulièrement, les membres de mon jury. Merci à Ling PENG et Patrick Midoux d’avoir accepté d’être les rapporteurs de ce travail. Merci à Rachid Benhida d’en être examinateur.

***

Merci à mes colocataires du 5ème (et 4ème) étage pour leur bonne humeur au quotidien : Nicolas, Janah, Ahn, Johana, Pascal, Estelle, Caterina, Mauro, Lauranne, Alexandra, Hella, Antoine… Merci à Florian d’être arrivé au bon moment pour m’aider à ordonner le labo… mais surtout pour tous ces bons moments partagés. Merci aux anciens Jean­Patrick, Bruno et Camille, qui ont beaucoup compté pendant ces années et avec qui j’ai tant de bons souvenirs. Merci aux plus expérimentés, Pierre, Maria, Stéphane, Audrey, Alain, Benoît, Mohamed, Anthony, Cyril, Luc et Nadine pour leurs précieux conseils. Merci aussi aux gestionnaires Christelle et Patricia pour leur aide.

***

Je remercie également ma famille et mes amis les plus proches, qui m’accompagnent bien au­delà de cette expérience. Merci à mes parents et mes beaux­parents pour m’avoir permis de réaliser ce travail dans de telles conditions. Merci à ma sœur, Laurie, et mon frère, Dylan, sur qui je peux compter depuis toujours et pour toujours. Un merci tout particulier à Nadia pour son rôle si singulier et son soutien quotidien. Tu vas beaucoup me manquer... Merci aussi à vous autres que j’aime tant : Sébastien, Inès, Nicole, Robert, Claudette, Loulou, Sarah, Brice, Aaron et Esther.

***

Enfin, je remercie l’homme qui partage ma vie, Orens, pour son soutien indéfectible et son amour infini. Je mesure chaque jour la chance de t’avoir à mes côtés. Je ne pourrais terminer sans embrasser ma fille, Norah, née pendant cette thèse et que j’aime inconditionnellement.

7

-L

ISTE DES ABREVIATIONS

A

AAA : Activité cellulaire variée ATPase Associée AAV : Adeno-Associated Virus (virus adéno­associé) Ac : Acétyle

ADA­SCID : Adenosime deaminase severe combined immunodeficiency (déficit immunitaire combiné sévère par déficience en adénosine désaminase)

ADN : Acide désoxyribonucléique AN : Acide Nucléique

ARN : Acide ribonucléique

ARNi : Interférence à acide ribonucléique ARNm : Acide ribonucléique messager

ASGP­R : Asialoglycoprotein Receptor (récepteur aux asialoglycoprotéines) ATP : Adénosine triphosphate

B

BCA : Acide bicinchonique Boc : ter­Butyloxycarbonyle BET : Bromure d’éthidium

br s : Broad singlet (singulet large)

C

CCM : Chromatographie sur Couche Mince CDs : Cyclodextrines

CFTR : Cystic Fibrosis Transmenbrane Conductance Regulator (régulateur de la conductance transmembranaire de la fibrose kystique)

CMC : Concentration Micellaire Critique CMV : Cytomégalovirus

CPPs : Cell Penetrating Peptides (peptides pénétrants)

CREB : C-AMP Response Element-binding protein (protéine de liaison à l'élément de réponse à l'AMP cyclique)

CTAB : Bromure de cétyltriméthylammonium

CuAAC : Cycloaddition 1,3­dipolaire azoture/alcyne de Huisgen catalysée par le cuivre(I)

D

d : Doublet

DCC : N,N’­Dicyclohexylcarbodiimide

DC­Chol : 3β­[N­(N',N'­diméthylaminoéthane)­carbamoyl]­cholestérol dd : Doublet dédoublé

DIC : N,N’­Diisopropylcarbodiimide DIPEA : N,N’­diisopropyléthylamine

DLC­AS : Dynein Light Chain Association Sequence (séquence d’interaction avec les chaînes légères de la dynéine)

DLS : Dynamic Light Scattering (diffusion quasi­élastique de la lumière) DMAP : 4­(Diméthylamino)pyridine

DMEM : Dulbecco’s Medium Eagle Modified (milieu de Eagle modifié par Dulbecco) DMF : N,N­diméthylformamide

DMSO : N,N­diméthylsulfoxide Dmt : Diméthylthiazol

DOGS : Dioctadécylamidoglycyl spermine

DOGSDSO : 1,2­Dioléoyl­sn­glycéro­3­succinyl­2­hydroxyéthyl disulfure ornithine DOPC : 1,2­Dioléoyl­sn­3­glycéro­3­phosphocholine

DOPE : Dioléoyl­phosphatidyléthanolamine

DORIE : Bromure de 1,2­dioleyloxypropyl­3­diméthyl­hydroxyéthyl ammonium

DOSPA : 2,3­Dioléyloxy­N­[2­(spermine­carboxamido)éthyl]­N,N­diméthyl­1­propanammonium trifluoroacétate

DOTAP : N­[1­(2, 3­Dioléolyloxy)propyl]­N,N,N­triméthylammonium méthylsulfate DOTMA : Chlorure de N­[1­(2,3­dioléyloxy)propyl]­N,N,N­triméthylammonium) DPH : 1,6­Diphényl­1,3,5­hexatriène

DTNB : Acide 5,5’­dithiobis(2­nitrobenzoïque) DTS : DNA Nuclear Targeting Sequence DTT : Dithiothréitol

E

EDTA : Acide éthylène diamine tétraacétique Egl : Egalitarian

ENCODE : Encyclopedia of DNA Elements (encyclopédie des éléments de l’ADN)

EPR : Enhanced Permeability and Retention effect (effet de perméabilité et de rétention accrue) ESI : Electrospray Ionisation (ionisation par électrospray)

H

HBTU : N,N,N’,N’­Tétraméthyl­O­(1H­benzotriazol­1­yl)uronium hexafluorophosphate HC : Heavy Chains (chaînes lourdes)

HEPES : Acide 4­(2­hydroxyéthyl)pipérazine­1­éthanesulfonique HOBt : N­Hydroxybenzotriazole

HOSu : N­Hydroxysuccinimide

HRMS : High-Resolution Mass Spectrometry (spectrométrie de masse haute résolution) HSPGs : Heparan Sulfate Proteoglycan’s (protéoglycanes de type sulfate d’héparine)

HSV1­TK : Herpes simplex virus type 1 thymidine kinase (thymidine kinase du virus Herpes simplex de type 1)

I

IC : Intermediaite Chains (chaînes intermédiaires) ID : Indice de Dissociation

(IEP)­CMV : Cytomegalovirus Immediate-Early Promoter (promoteur du gène précoce du cytomégalovirus)

IRF : Intensité Relative de Fluorescence

L

LA : Acide lipoïque

LC : Light Chains (chaînes légères ex. LC8)

LIC : Light Intermediate Chains (chaînes légères intermédiaires)

M

m : Multiplet

M3­PALS : Mixed Mode Measurement Phase Analysis Light Scattering (Analyse de la diffusion quasi­ élastique par un mode de mesure mixte de la phase)

10 -NPs : Nanoparticules

NTB : 2­nitro­5­thiobenzoate

O

OTC : Ornithine transcarbamylase deficiency (déficit en ornithine transcarbamylase)

P

pb : Paires de bases

Pbf : 2,2,4,6,7­Pentaméthyldihydrobenzofuran­5­sulfonyle PBS : Phosphate Buffered Saline (tampon phosphate salin) PdI : Indice de Polydispersité

PEG : Polyéthylène glycol PEI : Polyéthylène imine

PEIb : Polyéthylène imine branché PLL : Poly­L­lysine

PM : Poids Moléculaire Ppm : Parties par million

PTDs : Protein Transduction Domains (domaines de transduction des protéines)

Q q : Quadruplet quint : Quintuplet R RC : Cellulose régénérée Rf : Rapport frontal

RMN : Résonance Magnétique Nucléaire

RPP : Rabies virus Phosphoprotein P (phosphoprotéine P du virus de la rage)

S

s : Singulet

SDS : Dodécylsulfate de sodium sext : Sextuplet

shARN : Short hairpin ribonucleic acid (petit ARN en épingle à cheveux) siARN : Small Interfering ribonucleic acid (petit ARN interférant) SIDA : Syndrome d’Immunodéficience Acquise

SSC : Side-Scattered Channel (diffusion latérale de la lumière) SVF : Sérum de Veau Fœtal

­ 11 ­ T

t : Triplet

TAE : Tris­Acétate­EDTA

Tat : Trans-activator of transcription (transactivateur de transcription) TCEP : Tris(2­carboxyéthyl)phosphine

td : Triplet dédoublé TEG : Triéthylène glycol TFA : Acide trifluoroacétique TFE : Trifluoroéthanol THF : Tétrahydrofurane TIS : Triisopropylsilane Trt : Trityle U US : Ultrasons UV : Ultraviolet V

VHS­1 : Virus Herpes Simplex de type 1 VIH : Virus de l’Immunodéficience Humaine

VIP : Vectored Immunoprophylaxis (immunoprophylaxie vectorisée)

X

X­ALD : X-Linked adrenoleukodystrophy (adrénoleucodystrophie liée à l’X)

­ 12 ­

S

OMMAIRE

LISTE DES ABREVIATION S ­ 7 ­

I

NTRODUCTION GENERALE

­ 19 ­

REFERENCES BIBLIOGRAP HIQUES ­27 ­

P

ARTIE

_{I : L}

A THERAPIE GENIQUE ET LES VECTEURS DE TRANSFERT DE GENES

­ 29 ­

I. Introduction à la thérapie génique : le gène comme médicament ­ 31 ­

I.1 Maladies génétiques ­ 31 ­

I.2 Thérapie génique et « gène médicament » ­ 32 ­

I.3 Bref historique des essais cliniques ­ 34 ­

II. Stratégies de thérapie génique ­ 35 ­

II.1 Différents modes d’administration ­ 35 ­

II.2 Différentes stratégies de transfert de gènes ­ 36 ­

II.2.1 Maladies monogéniques héréditaires ­ 36 ­

II.2.2 Cancers ­ 37 ­

II.2.3 Maladies infectieuses ­ 38 ­

II.3 Thérapie génique ou délivrance d’acides nucléiques ­ 38 ­

III. Outils du transfert de gènes ­ 40 ­

III.1 Thérapie génique virale ­ 40 ­

III.1.1 Virus integratifs ­ 41 ­

III.1.2 Virus non integratifs ­ 42 ­

III.1.3 Bilan sur les vecteurs viraux ­ 43 ­

III.2 Thérapie génique non virale ­ 44 ­

III.2.1 Méthodes physiques ­ 44 ­

III.2.2 Méthodes chimiques : vecteurs synthétiques ­ 46 ­

III.2.2.1 Systèmes lipidiques (poly)cationiques et lipoplexes ­ 46 ­ III.2.2.2 Systèmes polymériques polycationiques et polyplexes ­ 51 ­ III.2.2.3 Systèmes basés sur l’amphiphilie faciale : exemple des cyclodextrines ­ 53 ­

III.2.2.4 Bilan sur les vecteurs synthétiques ­ 55 ­

IV. Barrières au transfert de gènes par les vecteurs non viraux ­ 56 ­

IV.1 Barrières extracellulaires : circulation dans les fluides biologiques ­ 57 ­

IV.2 Entrée dans la cellule ­ 58 ­

IV.3 Trafic intracellulaire ­ 60 ­

IV.3.1 Sortie des endosomes ­ 60 ­

IV.3.1.1 Mécanisme d’ « éponge à protons » : cas des polyplexes ­ 61 ­ IV.3.1.2 Mécanisme « flip­flop » et déstabilisation de la membrane

endosomale ­ 62 ­

IV.3.2 Routage intracellulaire jusqu’au noyau ­ 64 ­

IV.3.2.1 Decomplexation ­ 64 ­

­ 13 ­

IV.3.3 Transport nucléaire ­ 65 ­

IV.3.4 Expression du transgène ­ 67 ­

V. Conclusion : vers la formulation de virus synthétiques ­ 68 ­

REFERENCES BIBLIOGRAP HIQUES ­ 70 ­

P

ARTIE

II : E

LABORATION DE VIRUS SYNTHETIQUES POUR L

’

AMELIORATION

DU TRAFIC INTRACELLULAIRE DU GENE

­ 83 ­

C

HAPITRE

I : I

NTRODUCTION ­ 85 ­

I. Cytosquelette et trafic intracellulaire ­ 85 ­

I.1 Cytosquelette ­ 85 ­

I.1.1 Filaments d’actine ­ 86 ­

I.1.2 Filaments intermédiaires ­ 86 ­

I.1.3 Microtubules ­ 86 ­

I.2 Réseau de transport intracellulaire ­ 87 ­

I.2.1 Moteurs moléculaires ­ 88 ­

I.2.1.1 Associés a l’actine : myosines ­ 88 ­

I.2.1.2 Associés aux microtubules : kinésines et dynéines ­ 88 ­

II. Utilisation du cytosquelette par les virus ­ 92 ­

III. Utilisation du cytosquelette par des nanoparticules ou des vecteurs

synthétiques fonctionnalisés ­ 93 ­

III.1 Utilisation de fluosphères fonctionnalisées ­ 93 ­

III.2 Utilisation de vecteurs non viraux fonctionnalisés ­ 94 ­

IV. Objectif général du projet ­ 96 ­

IV.1 Système basé sur des dérivés du 1,2­dithiolane ­ 98 ­

IV.2 Système basé sur des dérivés cystéine ­ 99 ­

IV.3 Système basé sur des dérivés octaarginine ­100­

C

HAPITRE

II : F

ORMULATION DE NANOPARTICULES D

’ADN

FONCTIONNALISEES BASEES

SUR DES DERIVES DU

1,2­

DITHIOLANE ­103­

I. Design des molécules à base de 1,2­dithiolane et des contrôles ­104­

II. Synthèse des amphiphiles cationiques et des conjugués pegylés ­105­

III. Formulation et caractérisation physico­chimique des complexes d’ADN issus des dérivés

du 1,2­dithiolane ­108­

III.1 Plasmide utilisé ­108­

III.2 Méthodes générales de caractérisation des complexes d’ADN ­109­ III.3 Formulation des complexes d’ADN à base de 1,2­dithiolane ­109­ III.4 Condensation de l’ADN en nanoparticules quasi­monomoléculaires ­110­

III.4.1 Evaluation de l’état de compaction de l’ADN ­110­

III.4.2 Etude du processus de polymérisation du motif 1,2­dithiolane ­111­

­ 14 ­

III.4.2.2 Suivi UV du chromophore 1,2­dithiolane ­112­

III.5 Fonctionnalisation de surface des nanoparticules d’ADN ­113­ III.5.1 Evaluation de l’intégrité des nanoparticules après fonctionnalisation ­113­

III.5.2 Mesure de la taille et du potentiel zêta ­114­

III.5.3 Morphologie des complexes ­116­

III.5.4 Effet de sel ­116­

III.6 Conclusion sur l’étude physico­chimique des complexes d’ADN issus

des dérivés du 1,2­dithiolane ­117­

IV. Etude du comportement in vitro des nanoparticules d’ADN à base de 1,2­dithiolane ­118­

IV.1 Transfection in vitro des complexes ­118­

IV.2 Internalisation cellulaire des complexes ­119­

IV.3 Conclusion sur l’étude du comportement in vitro des nanoparticules d’ADN

à base de 1,2­dithiolane ­120­

V. Conclusion sur le système basé sur des dérivés du 1,2­dithiolane ­120­

C

HAPITRE

III : F

ORMULATION DE NANOPARTICULES D

’ADN

FONCTIONNALISEES PAR DES

DERIVES CYSTEINE ­122­

I. Design des molécules à base de cystéine et des contrôles ­123­

II. Synthèse de l’amphiphile cationique et des conjugués pegylés ­124­

II.1 Synthèse de l’amphiphile monocationique et perfluoroalkylé dimérisable ­124­ II.2 Synthèse des conjugués pegylés perfluoroalkylés oligomérisables ­125­

II.2.1 Première approche ­125­

II.2.1.1 Synthèse des précurseurs de Click ­126­

II.2.1.2 Mono­ et double­Click ­126­

II.2.2 Seconde approche ­128­

II.2.3 Conclusion sur la synthèse des amphiphiles cystéine ­130­

III. Cac de l’amphiphile monocationique et perfluoroalkylé dimérisable ­130­

IV. Stabilité des amphiphiles en milieu HCl (test DPH) ­132­

V. Formulation des complexes d’ADN à base de dérivés cystéine ­132­

VI. Caractérisation physico­chimique des complexes d’ADN à base de dérivés cystéine ­133­ VI.1 Condensation de l’ADN par l’amphiphile monocationique et perfluoroalkylé

dimérisable ­133­

VI.1.1 Evaluation du retard sur gel par électrophorèse ­133­

VI.1.2 Expérience d’exclusion du bromure d’éthidium ­134­

VI.1.3 Mesure de taille et de potentiel zêta ­134­

VI.2 Fonctionnalisation de surface des nanoparticules d’ADN ­136­ VI.2.1 Evaluation de l’intégrité des nanoparticules après fonctionnalisation ­136­

VI.2.2 Expérience d’exclusion du bromure d’éthidium ­136­

VI.2.3 Mesure de taille et de potentiel zêta ­137­

­ 15 ­

VI.3 Conclusion sur l’étude physico­chimique des complexes d’ADN

à base de dérivés cystéine ­139­

VII. Etude du comportement in vitro des nanoparticules d’ADN à base de résidus cystéine ­140­

VII.1 Transfection in vitro des complexes décorés ­140­

VII.2 Transfection in vitro des complexes en présence d’un inhibiteur de microtubules ­142­ VII.3 Conclusion sur l’étude du comportement in vitro des nanoparticules d’ADN

à base de résidus cystéine ­143­

VIII. Conclusion sur le système à base de résidus cystéine ­144­

C

HAPITRE

IV : F

ORMULATION DE NANOPARTICULES D

’ADN

FONCTIONNALISEES BASEES

SUR DES DERIVES OCTAARGININE

­

146­

I. Design des molécules a base d’octaarginine et des contrôles ­146­

II. Synthèse de l’amphiphile polycationique et des conjugués pegylés ­147­

III. Cac de l’amphiphile polycationique octaarginine perfluoroalkylé ­150­

IV. Formulation des complexes d’ADN a base de dérivés octaarginine ­150­

V. Caractérisation physico­chimique des complexes d’ADN à base de dérivés octaarginine ­151­ V.1 Condensation de l’ADN en conditions monomoléculaires ­151­

V.1.1 Evaluation de l’état de compaction de l’ADN ­151­

V.1.2 Expérience d’exclusion du bromure d’éthidium ­151­

V.1.3 Mesure de taille et de potentiel zêta ­152­

V.2 Fonctionnalisation de surface des nanoparticules d’ADN ­154­ V.2.1 Evaluation de l’intégrité des nanoparticules après fonctionnalisation ­154­

V.2.2 Expérience d’exclusion du bromure d’éthidium ­154­

V.2.3 Mesure de taille et de potentiel zêta ­156­

V.2.4 Morphologie des complexes ­156­

V.3 Conclusion sur l’étude physico­chimique des complexes d’ADN

à base de dérivés octaarginine ­157­

VI. Etude du comportement in vitro des nanoparticules d’ADN à base de dérivés octaarginine­158­

VI.1 Transfection in vitro des complexes ­158­

VI.2 Conclusion sur l’étude du comportement in vitro des nanoparticules d’ADN

à base de dérivés octaarginine ­159­

VII. Fonctionnalisation de polyplexes de PEI par des séquences dimériques DLC8­AS ­160­

VII.1 Formulation des polyplexes de PEI décorés par les conjugués pegylés

octaarginine et perfluoroalkylés ­161­

VII.2 Caractérisation physique des polyplexes de PEI décorés ­161­ VII.3 Etude du comportement in vitro des polyplexes de PEI décorés ­163­

VIII. Conclusion sur les systèmes à base de dérivés octaarginine ­165­

­ 16 ­

P

ARTIE

III : P

ROTOCOLES EXPERIMENTAUX

­173­

I. Synthèses ­175­

I.1 Mode opératoire général et instruments ­175­

I.2 Procédures générales de synthèse ­176­

I.2.1 Synthèse peptidique en phase solide – Protocole 1 ­176­

I.2.2 Cycloaddition 1,3­dipolaire azoture/alcyne de Huisgen catalysée

par le cuivre(I) (CuAAC) – Protocol 2 ­178­

I.3 Préparation des dérivés du 1,2­dithiolane ­178­

I.3.1 Synthèse des amphiphiles cationiques et des conjugués pegylés neutres ­178­

I.3.2 Synthèse des conjugués pegylés polyanioniques ­183­

I.4 Préparation des dérivés mono­ et bis­cystéine ­188­

I.4.1 Synthèse de l’amphiphile cationique ­188­

I.4.2 Synthèse des conjugués pegylés mono­ et bis­cystéine ­189­

I.4.2.1 Préparation des synthons pegylés azotures ­189­

I.4.2.2 Préparation des synthons alcynes ­190­

I.4.2.3 Mono­ et double­Click ­195­

I.5 Préparation des dérivés octaarginine ­199­

I.5.1 Synthèse de l’amphiphile cationique F4C10­Arg8­CH2CCH 36 ­199­

I.5.2 Synthèse des conjugués pegylés ­200­

II. Détermination de la cac des détergents ­205­

III. Etude de la stabilité des dérivés cystéine en milieu HCl – Test quantitatif d’Ellman ­205­

IV. Préparation des complexes d’ADN ­206­

V. Etudes physico­chimiques ­207­

V.1 Evaluation de l’état de compaction de l’ADN – Electrophorèse sur gel d’agarose ­207­

V.2 Exclusion du bromure d’éthidium ­207­

V.3 Dissociation des complexes en solution saline ­207­

V.4 Etude du cycle 1,2­dithiolane – Spectrométrie UV­visible ­208­ V.5 Taille et potentiel zêta des complexes – Diffusion quasi­élastique de la lumière (DLS) et diffusion de la lumière par analyse de phase et mesure en mode mixte (M3­PALS) ­208­ V.6 Taille et morphologie des complexes – Microscopie électronique à transmission ­208­

VI. Etudes sur cellules in vitro ­208­

VI.1 Culture cellulaire ­208­

VI.2 Transfection in vitro – Mesure de la luciférase ­209­

VI.3 Internalisation cellulaire – Cytométrie de flux ­210­

C

ONCLUSION GENERALE

­213­

19

21

-La thérapie génique est une technique directement issue des avancées majeures en génétique et en biologie moléculaire réalisées durant la seconde moitié du XXème siècle. Depuis le séquençage complet du génome humain, achevé en 2003, les progrès de la thérapie génique sont dépendants de l’accumulation de données sur les maladies candidates avec notamment l’identification des gènes impliqués. La dénomination thérapie génique recouvre plus un principe général qu’une technique précise. Il s’agit de transférer une construction d’acides nucléiques (AN) dans des cellules cibles pour leur faire exprimer un gène dit thérapeutique, et compenser un dysfonctionnement ou ajouter une nouvelle fonction cellulaire. Alors que les stratégies classiques ciblent l’activité de protéines (et donc bien souvent les conséquences symptomatiques), la thérapie génique intervient plus en amont (sur les causes), directement sur le génome. Les champs d’application potentiels sont ainsi plus vastes et concernent à la fois les maladies monogéniques héréditaires (mucoviscidose, adrénoleucodystrophie…) et les maladies acquises (cancers, infections virales…).

La thérapie génique a été appliquée pour la première fois à l’Homme en 1989 sous la forme d’un premier essai clinique initié par le professeur Rosenberg, pour traiter des patients atteints d’un mélanome avancé.1 A ce jour, les quelques 2000 protocoles cliniques recensés2 ont contribué à l’identification des étapes limitantes du transfert de gènes. Même si la validité du concept est établie, en témoigne Glybera, première thérapie génique approuvée en Europe pour prévenir des attaques pancréatiques graves,3les résultats restent bien en deçà des espoirs initiaux.

Le succès de la thérapie génique repose sur l’élaboration de vecteurs de transfert de gènes efficaces et sûrs. En effet, la nature macromoléculaire et polyanionique des acides nucléiques ne les prédispose pas à diffuser spontanément au travers des membranes cellulaires. Ils présentent aussi une grande sensibilité face à l’hydrolyse enzymatique. Ces caractéristiques les rendent dépendants de vecteurs dont le rôle est de les protéger des agressions en milieu biologique, et de les acheminer efficacement depuis leur site d’administration jusqu’au site d’action. Les vecteurs d’origine virale sont encore aujourd’hui les plus utilisés dans les essais cliniques, en raison de la capacité naturelle des virus à infecter leur hôte. Ils renferment alors un génome viral modifié, ou recombinant, porteur du gène thérapeutique. Malgré leur grande efficacité, ces vecteurs présentent de nombreux inconvénients (immunogénicité, taille de l’insert limitée, difficulté et coût de production…) et les inclure dans des protocoles cliniques n’est pas sans risque. Ainsi, parallèlement à la mise au point de nouveaux vecteurs viraux, la communauté scientifique s’est tournée vers le développement de systèmes non viraux de transfert de gènes plus sûrs mais bien moins efficaces.

A ce jour, une multitude de vecteurs synthétiques pour la plupart dérivés de lipides ou de polymères (poly)cationiques ont été synthétisés et évalués in vitro et in vivo. Ces systèmes complexent les acides nucléiques principalement par le biais d’interactions électrostatiques entre leurs charges cationiques et les groupements phosphate anioniques des AN. Les particules résultantes, appelées lipoplexes ou polyplexes, ont montré une excellente capacité à transfecter des

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-cellules in vitro, tout en étant moins toxiques, plus faciles à produire, et plus faciles à manipuler que les vecteurs viraux. Cependant, ces systèmes présentent de sérieuses limitations qui affectent leur efficacité, principalement lorsqu’une application in vivo est envisagée. Ceci est imputable (i) à leur nature (poly)cationique à l’origine de nombreuses interactions non spécifiques avec les constituants biologiques et à leur rapide élimination de la circulation sanguine, et (ii) à leur difficulté à franchir les différents obstacles rencontrés pour délivrer leur matériel génétique dans le cytoplasme (cas d’un ARN) ou le noyau cellulaire (cas d’un ADN).

Le succès d’une thérapie génique non virale nécessite donc l’élaboration de systèmes plus performants, capables de contourner les différents obstacles rencontrés en milieu intra­ et extracellulaire. Les recherches se sont ainsi concentrées sur le développement de systèmes multifonctionnels appelés « virus synthétiques ou artificiels » (schématisés dans la Figure 1).4_{Ce sont} des systèmes multicomposants imaginés en s’inspirant des virus naturels, qui présentent idéalement : (i) une taille nanométrique, (ii) un tropisme et une spécificité cellulaire, (iii) une capacité à contourner le système immunitaire (furtivité), (iv) une délivrance cytoplasmique, (v) un tropisme et une délivrance nucléaire (cas de l’ADN). Ces édifices sont dotés entre autres (i) de polyéthylène glycol (PEG) en surface pour favoriser leur furtivité, (i) de ligands de ciblage pour induire une reconnaissance cellulaire spécifique, (iii) de peptides fusogènes pour favoriser leur délivrance cytoplasmique, (iv) de peptides de localisation nucléaire pour leur import dans le noyau.

Figure 1 : Représentation schématique d’un virus synthétique

Le projet de thèse qui m’a été confié s’inscrit dans cette optique de formulation de « virus synthétiques ». Nous nous sommes plus particulièrement intéressés à l’amélioration du trafic intracellulaire du gène vers le noyau, étape limitante à l’utilisation des vecteurs non viraux qui reste relativement peu étudiée. D’une façon générale, nous avons souhaité obtenir, de façon simple et reproductible, des nanoparticules (NPs) d’ADN :

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dont la taille est la plus petite possible pour avoisiner celle d’une particule virale (< 250 nm) et faciliter leur diffusion dans les fluides biologiques (ex. cytosol),

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-!

dont la surface est fonctionnalisée par des ligands spécifiques pour améliorer le trafic intracellulaire du gène vers le noyau.

La première partie de ce manuscrit est dédiée à une revue bibliographique non exhaustive sur la thérapie génique. Nous y décrivons les principaux acteurs du transfert de gènes en insistant sur les vecteurs synthétiques, thématique largement abordée au laboratoire. Nous présentons également les différentes barrières rencontrées par ces systèmes pour permettre une expression efficace du transgène, ainsi que les solutions envisagées jusqu’ici pour tenter de les rendre compétitifs face aux vecteurs viraux.

La deuxième partie de ce mémoire est divisée en quatre chapitres. Le chapitre I est consacré à la description des acteurs du trafic intracellulaire, ainsi qu’à la présentation des objectifs de la thèse. La stratégie générale repose sur la fonctionnalisation de complexes d’ADN par des ligands de la dynéine cytoplasmique de type I, moteur moléculaire assurant le transport rétrograde (de la périphérie de la cellule jusqu’au noyau) de cargos le long des microtubules. Nous avons choisi d’utiliser des séquences peptidiques spécifiques ciblant les chaînes légères LC8 de la dynéine (DLC8­AS pour Dynein Light Chain 8 Associated Sequence). Des travaux préliminaires au laboratoire ont montré que cette stratégie, appliquée à un modèle simplifié basé sur des nanobilles en polystyrène fonctionnalisées, permettait d’augmenter leur concentration périnucléaire.5 Toutefois, ces résultats requièrent de hauts taux de fonctionnalisation, difficiles à obtenir dans le cas de complexes d’ADN car pouvant affecter leur stabilité colloïdale. Pour contourner ce problème et pouvoir se contenter de plus faibles degrés de fonctionnalisation, nous avons décidé de favoriser l’affinité de nos ligands pour la cible en utilisant des peptides DLC8­AS sous leur forme dimérique, qui présentent des constantes d’association bien plus élevées que leur forme monomérique.6 La stratégie est représentée schématiquement dans la Figure 2.

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-Ainsi, les chapitres II, III et IV sont consacrés à la formulation, la caractérisation et l’évaluation sur cellules in vitro des systèmes nanoparticulaires développés dans le cadre de cette étude :

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SYSTEME BASE SUR DES DERIVES DU 1,2­DITHIOLANE (CHAPITRE II)

Pour répondre à la problématique fixée, nous avons envisagé l’utilisation d’un système basé sur des dérivés de l’acide lipoïque, c’est­à­dire contenant un motif 1,2­dithiolane polymérisable. Il s’agit de formuler des NPs fonctionnalisées par des séquences DLC8­AS dimériques, suivant un processus en deux étapes combinant interactions électrostatiques et oligomérisation du motif lipoyl (Figure 3) :

Figure 3 : Fonctionnalisation de NPs d’ADN basées sur des dérivés du 1,2­dithiolane par des dimères de DLC8­AS

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Etape 1 :L’ADN est condensé par un amphiphile cationique et polymérisable pour conduire à une population monodisperse de NPs cationiques de petites tailles.

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Etape 2 : La surface des NPs est décorée avec un conjugué pégylé polyanionique et polymérisable contenant le même motif 1,2­dithiolane et des résidus aspartate.

Le choix du motif 1,2­dithiolane devrait permettre (i) de condenser l’ADN en NPs stables en limitant la réversibilité du système via l’oligomérisation des amphiphiles cationiques, (ii) d’accéder à un haut taux de fonctionnalisation de surface grâce à un effet synergique entre oligomérisation des motifs lipoyl et interactions électrostatiques des résidus aspartate anioniques avec les NPs cationiques, et (iii) de délivrer l’ADN sous contrôle rédox grâce aux systèmes réducteurs intracellulaires.

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SYSTEME BASE SUR DES DERIVES CYSTEINE₍CHAPITRE _III)

Lors de travaux précédents, l’équipe a développé des amphiphiles cationiques et perfluoroalkylés dimérisables basés sur la cystéine pour condenser l’ADN en une population monodisperse de NPs de petites tailles. Elle a également fonctionnalisé les NPs résultantes avec une ancre hydrophobe pegylée et perfluoroalkylée portant un ligand DLC8­AS. Cette stratégie n’a cependant pas permis une accumulation périnucléaire des NPs décorées après injection intracytoplasmique dans des oocytes de

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-drosophiles, probablement à cause d’un trop faible taux de fonctionnalisation (résultats non publiés). L’approche envisagée dans le cadre de cette thèse consiste à améliorer ce système par l’adjonction d’une force motrice supplémentaire pour tenter d’augmenter le taux de ligands DLC8­AS en surface des NPs. Le protocole de formulation est donné ci­après (Figure 4).

Figure 4 : Fonctionnalisation de NPs d’ADN basées sur des résidus cystéine par des dimères de DLC8­AS

Il s’agit de co­formuler avec l’ADN :

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un amphiphile monocationique, perfluoroalkylé et dimérisable basé sur un résidu cystéine,

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un amphiphile perfluoroalkylé, basé sur deux résidus cystéine et conjugué à un dimère de

type PEG1,6K­DLC8­AS à son extrémité.

Outre l’effet bivalent lié à l’utilisation d’un dimère de séquences DLC8­AS pour augmenter l’affinité pour la dynéine, le conjugué pegylé comporte ici un résidu bis­cystéine qui devrait contribuer à améliorer le taux de fonctionnalisation des NPs via l’oligomérisation des thiols avec l’agent de compaction.

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SYSTEME BASE SUR DES DERIVES OCTAARGININE(CHAPITRE IV)

La dernière approche consiste à utiliser un système purement peptidique basé sur des amphiphiles perfluoroalkylés de type polyarginine. Il s’agit de tirer profit des différents avantages liés à l’utilisation de peptides cationiques en transfert de gènes, qui concernent plus particulièrement (i) leur biocompatibilité et leur biodégradabilité, (ii) leur facilité d’accès, (iii) leur capacité à condenser efficacement l’ADN, et (iv) leur capacité d’internalisation cellulaire. Par ailleurs, l’attachement d’une entité hydrophobe sur la chaîne homopeptidique est susceptible d’induire une amélioration de l’efficacité de transfection des formulations.7 Le protocole de formulation est présenté ci­après (Figure 5) :

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-Figure 5 : Fonctionnalisation de NPs d’ADN basées sur des résidus arginine par des dimères de DLC8­AS

Il s’agit d’utiliser sur l’ADN de façon conjointe :

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un amphiphile polycationique et perfluoroalkylé comportant huit résidus arginine,

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un amphiphile polycationique et perfluoroalkylé à huit résidus arginine conjugué à un dimère de PEG1,6K­DLC8­AS à son extrémité.

Alors que l’octaarginine devrait permettre une forte interaction avec les groupements phosphate de l’ADN pour former des NPs stables et fonctionnalisées par des séquences DLC8­AS, la chaîne perfluoroalkylée pourrait améliorer l’échappement endosomal des nanovecteurs par un effet lysomotropique.

Nous verrons finalement comment il est possible d’adapter cette stratégie à un système référence en transfert de gènes, le polyéthylène imine (PEI).

La troisième partie de ce mémoire est dédiée à la description des différents protocoles expérimentaux utilisés dans ce projet.

Une conclusion générale permet finalement de dresser un bilan des différents résultats obtenus, d’énoncer les retombés de notre travail et d’ouvrir la discussion sur les perspectives de recherche à venir.

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Nat Rev Drug

Chem Soc Rev 2012,

­M.; Godeau, G.; Greiner, J.; Vierling, P.; Noselli, S.; Di Giorgio, C.; Van De Bor, V., In vivo characterization of dynein­ driven nanovectors using drosophila oocytes. PLoS ONE 2013, 8, (12), e82908.

6. Rapali, P.; Radnai, L.; Süveges, D.; Harmat, V.; Tölgyesi, F.; Wahlgren, W. Y.; Katona, G.; Nyitray, L.; Pál, G., Directed evolution reveals the binding motif preference of the LC8/DYNLL hub protein and predicts large numbers of novel binders in the human proteome. PLoS ONE 2011,6, (4), e18818.

7. Futaki, S.; Ohashi, W.; Suzuki, T.; Niwa, M.; Tanaka, S.; Ueda, K.; Harashima, H.; Sugiura, Y., Stearylated arginine­rich peptides: A new class of transfection systems. Bioconjug Chem 2001,12, (6), 1005­1011.

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