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Production au laboratoire d’apothecies de Sclerotinia trifoliorum Eriks pour l’evaluation de la resistance du
trefle violet a la sclerotiniose.
G. Raynal
To cite this version:
G. Raynal. Production au laboratoire d’apothecies de Sclerotinia trifoliorum Eriks pour l’evaluation de la resistance du trefle violet a la sclerotiniose.. Agronomie, EDP Sciences, 1983, 3 (4), pp.369-373.
�hal-02726838�
Production
aulaboratoire d’apothécies de Sclerotinia
trifoliorum Eriks. pour l’évaluation de la résistance du trè- fle violet à la sclérotiniose.
Guy RAYNAL
Francine FERRARI Michelle MOURET
LN.R.A., Laboratoire de Botanique et Pathologie végétale, Institut National Agronomique Paris-Grignon
F 78850 Thiverval-Grignon.
RÉSUMÉ La production au laboratoire des apothécies de S. trifoliorum peut être obtenue régulièrement et en quantité
suffisante pour les contaminations artificielles du trèfle violet. Les sclérotes sont produits par culture du cham-
pignon pendant 1 mois sur PDA (100 boîtes de Petri donnent environ 10.000 sclérotes). Ils sont ensuite dessé- chés pendant 1 mois à la température du laboratoire, puis congelés à - 18°C pendant 24 h. Légèrement enfouis dans de la vermiculite maintenue constamment humide, ils produisent leurs premières apothécies au bout d’un mois, à 15’C et sous un éclairement fluorescent de 18 W/mI, avec une photopériode de 12 h/24. La produc-
tion des apothécies se poursuit pendant au moins 2 mois. Le rendement est de 2.000 à 3.000 apothécies pour 10.000 sclérotes, chaque apothécie produisant en moyenne 30.000 ascospores. Les ascospores desséchées conservent au froid leur pouvoir infectieux pendant plusieurs mois.
SUMMARY Laboratory production of apothecia of Sclerotinia trifoliorum Eriks. for the evaluation of red
clover resistance to crown rot.
Laboratory production of apothecia of S. trifoliorum could be obtained regularly and in sufficient quantities
for artificial inoculation of red clover. Sclerotia were produced on one month old cultures grown on PDA
(100 Petri dishes give some 10.000 sclerotia). They were desiccated 1 month at laboratory temperature, then frozen for 24 h at - 18°C. When lightly covered with constantly moist vermiculite, they raised their first apothecia in I month, at 15°C, under fluorescent light (18 W/m’) with a photoperiod of 12 h/24. Apothecial production went on for at least 2 months. The yield was 2.000 to 3.000 apothecia for 10.000 sclerotia, each apothecium producing an average of 30.000 ascospores. Dried ascospores, when kept cold, remained patho- genic for several months.
I. INTRODUCTION
La sclérotiniose est la plus grave maladie des trèfles,
notamment du trèfle violet, en France et dans toutes les régions du globe à climat tempéré froid ou nordique. Le parasite, Sclerotinia trifoliorum Eriks., produit au champ des apothécies, de fin octobre à début décembre sous les conditions du Bassin parisien, à partir des sclérotes formés
au printemps précédent sur les plantes mortes. Cette période
de production peut être avancée ou retardée dans le temps
en fonction des conditions climatiques du lieu, mais elle est
toujours de courte durée (LovELESS, 1951 ; DIJKSTRA, 1964 ; WILLIAMS ôt WESTERN, 1965 ; PRATT & KNIGHT, 1982).
Les ascospores libérées par les apothécies constituent l’inoculum primaire qui attaque les feuilles du trèfle vio- let. Au cours de l’hiver, le mycélium formé à partir des feuil-
les nécrosées gagne les collets et peut progresser au niveau du sol de plante à plante, provoquant ainsi une pourriture
des parties aériennes et la disparition des trèfles.
La seule possibilité de lutte contre la sclérotiniose est la sélection de plantes à bons niveaux de résistance, capables de ralentir la progression de la maladie d’une année sur l’au- tre. Au cours d’un article précédent, nous avons examiné les divers types d’inoculum utilisables pour évaluer la résis- tance des trèfles violets (RAYNAL, 1981). L’inoculum mycélien, très facile à produire en culture pure, s’avère très intéressant mais ne rend pas compte des possibilités de résis-
tance aux attaques primaires d’ascospores.
Si l’on veut utiliser les ascospores pour les tests de résis-
tance, on peut les obtenir en récoltant les apothécies au champ, à la condition de disposer de parcelles de trèfles très contaminées et en étant tributaire des conditions climati- ques qui influent de façon importante sur la quantité d’apo-
thécies formées. Ceci constituant un facteur limitant pri-
mordial pour les essais, il nous a semblé plus intéressant de tenter de produire les apothécies à partir de cultures pures de S. trifoliorum.
La production par les sclérotes de la forme sexuée en
conditions artificielles a souvent été tenue pour capricieuse
et difficile (HENSOrr, 1940 ; CoE, 1949 ; SPROSTOrt &
P EASE
, 1965 ; PRATT & KNIGHT, 1982). Il est pourtant banal de les observer dans la nature à l’entrée de l’hiver.
C’est donc que les sclérotes de S. trifoliorum nécessitent
un traitement particulier pour lever leur dormance. DIJKS- TRA (1964) utilise à cet effet la sécheresse estivale en
enfouissant, dès le mois de juillet, dans du sable placé à l’extérieur, des sclérotes produits in vitro. Elle les reprend
en octobre-novembre et constate alors une abondante pro- duction d’apothécies. Ce même auteur (1966) lève la dor-
mance de S. trifoliorum en traitant les sclérotes avec du
dichloropropane-dichloropropène. KoHrr (1979) obtient des apothécies après conditionnement des sclérotes à 0°C pen- dant 4 semaines, pour les 3 espèces de Sclerotinia (S. scie- rotiorum, S. minor, S. trifoliorum). Mc GInaPSEY &
M
ALONE (1979) induisent, en boîte de Petri, la formation des apothécies en soumettant les sclérotes de S. trifoliorum
à une température de - 18°C pendant 24 h, avant incuba- tion à 100C pendant 2 mois ou en alternant des températu-
res de 8°C le jour et 2°C la nuit. LAMARQUE (1975, 1980) produit d’abondantes apothécies de S. sclerotiorum en fai- sant séjourner dans le sol pendant 4 mois des sclérotes pro- duits au laboratoire ou récoltés au champ. Ce séjour per- met aux sclérotes d’acquérir l’aptitude à fournir des apo- thécies, lesquelles peuvent être obtenues ultérieurement au
laboratoire, sur coton hydrophile humide, en plusieurs géné- rations successives. Les ascospores sont ensuite utilisées pour la sélection de la résistance du tournesol à la sclérotiniose.
En ce qui concerne S. trifoliorum, à l’exception de DIJK-
S
TRA qui obtient des apothécies en conditions semi- naturelles pendant une courte période de l’année, les auteurs cités ne produisent pas les apothécies en vue de contamina- tion de lots importants de trèfle. Aucun ne donne de ren-
seignement sur la quantité d’apothécies fertiles formées par unité de poids, ou par nombre de sclérotes. Il nous a donc fallu mettre au point une technique en conditions totale- ment contrôlées, apte à fournir rapidement, de façon régu-
lière et tout au long de l’année de nombreuses ascospores infectieuses pour nos essais de contamination.
II. MATÉRIEL ET MÉTHODES
A. Récolte des apothécies en conditions naturelles et pro- duction en conditions semi-naturelles
En octobre-novembre 1981 et 1982, nous avons récolté
toutes les apothécies visibles, au cours de divers passages, dans des parcelles, de la variété sensible « Alpilles » en 2e année de culture (fig. la). Ces parcelles, au nombre de 6, situées dans le Domaine de l’INRA de la Minière (78), mesu-
rent chacune 1,40 x 6 m et comportent 6 lignes de culture.
Pour la production semi-naturelle des apothécies, nous
avons déposé 45 g de sclérotes secs (environ 10.000 scléro- tes) sur de la vermiculite, en 2 terrines de 20 x 30 cm. Ces sclérotes provenaient de cultures sur PDA d’un isolat de trèfle violet. Les terrines furent placées à l’extérieur en juin
1982. Les premières récoltes d’apothécies fertiles ont débuté
en octobre de la même année.
B. Production des apothécies au laboratoire
S. trifoliorum isolé de trèfle violet et de luzerne (3 iso- lats) est cultivé aseptiquement pendant 1 mois à 20°C, sous éclairage fluorescent continu de 9 W/m’, sur PDA en boî-
tes de Petri ou sur carottes broyées ou en tranches, en erlen-
meyers. Les sclérotes sont récoltés, débarrassés par lavage
des particules de milieu nutritif et subissent ou non diver-
ses durées de dessication (de 1 semaine à 1 an) à la tempé-
rature du laboratoire. Ensuite, ils subissent ou non une
congélation (- 18°C) pendant 12 à 48 h. Légèrement enfouis dans de la vermiculite maintenue continuellement humide en « miniserres » par apport régulier d’eau permu- tée dans les bacs de celles-ci, les sclérotes sont enfin placés
dans une enceinte climatisée, à 15°C, sous un éclairage fluo-
rescent de 18 W/mlavec une photopériode de 12 h/24. La
récolte des apothécies développées apparaissant à la surface de la vermiculite est faite chaque semaine (fig. 1, b, c). Les apothécies non ouvertes ou réduites à leur stipe ne sont ni comptées ni récoltées. Elles sont laissées en place afin de
poursuivre leur développement jusqu’à leur étalement com-
plet, ce qui demande environ 1 semaine pour la plupart d’en-
tre elles.
C. Récolte des ascospores
Nous avons utilisé la technique de TOURVIELLE DE LABROUHE
et al. (1978) mise au point pour S. sclerotiorum.
Les apothécies sont appliquées face sporulante contre le
fond d’une boîte de Petri entrouverte. Leur dessication à la température du laboratoire (18-22°C) pendant quelques
heures permet la décharge d’une grande partie des ascos-
pores. Celles-ci sont ensuite récupérées par lavage de la spo- rée pour une utilisation immédiate ou peuvent être conser- vées à sec pendant au moins 4 mois sans perte de leur pou- voir germinatif, voisin de 90 à 95 p. 100. Au-delà, le taux de germination des ascospores diminue fortement (RAY-
N AL, 1981).
III. RÉSULTATS
A. Conditions naturelles et semi-artificielles
Au champ, nous avons récolté les quantités suivantes d’apothécies fertiles, de couleur beige à orangée, pour un nombre de sclérotes inconnu, sur une surface totale de 50,4 m2:
1981 : 18 novembre : 534
25 novembre : 318 ... Total : 853 1982 : 20 octobre . 227
2 novembre : 1008 12 novembre : 536 24 novembre : 116
30 novembre : 61 ... Total : 1948 Nous n’avons pas dénombré les apothécies vieillissantes de couleur sombre ni celles, noires, en voie de nécrose. Ces organes âgés étaient surtout visibles dans les derniers pré-
lèvements. Une centaine d’entre eux, mis en boîtes de Petri, n’ont déchargé aucune ascospore.
La récolte des ascospores provenant d’apothécies fonc-
tionnelles d’âge variable s’établit en moyenne à 30.000 spo-
res par apothécie en 1981 et pour les 3 premiers prélève-
ments de 1982. Elle n’est que de 12.500 et 5.000 pour les 2 derniers, vraisemblablement en raison de pluies abondan-
tes ayant lessivé les apothécies. La moyenne des dimensions diamétrales des apothécies, établie sur 50 de ces organes, est de 5,02 mm avec un écart type de 1,78 mm.
Notons que la récolte des apothécies au champ est malai-
sée et souvent rendue peu agréable par les conditions cli-
matiques ; chaque séance requiert en outre entre 2 et 3 h de prospection au niveau du sol.
En terrines placées à l’extérieur, la production d’apothé-
cies fertiles est la suivante :
10 octobre : Stipes porteurs d’ébauches d’apothécies d’en- viron 01 1 mm
25 octobre : 17 apothécies étalées, planes
30 octobre : 67 apothécies étalées, planes
8 novembre : 347 apothécies étalées, planes
16 novembre : 750 apothécies étalées, planes
23 novembre : 428 apothécies étalées, planes
29 novembre : 396 apothécies étalées, planes
6 décembre : 332 apothécies étalées, planes
Total : 2337 pour 10.000 sclérotes
Le rendement en ascospores est assez constant et atteint
en moyenne 15.000 spores par apothécie. Cette faible quan- tité est due sans doute à la très petite taille des apothécies
formées dans ces conditions et récoltées très jeunes (âgées
d’une semaine) : diamètre moyen de 2,73 mm, écart type de 1,05 mm. Rapporté à la quantité initiale de sclérotes, le rendement par sclérote est de 0,233 apothécie par sclérote.
B. Production des apothécies au laboratoire
Le premier essai a été effectué avec un seul isolat de trè- fle violet selon la technique de KOHN(1979), avec des sc1é-
rotes obtenus sur tranches de carottes, non desséchés et sans congélation. Nous avons obtenu un petit nombre d’apothé- cies sporulantes (37 pour 500 sclérotes, soit 0,074 apothé-
cie par sclérote), 3 mois après avoir mis les sclérotes sur ver-
miculite humide.
Nous avons ensuite réalisé un essai factoriel (200 scléro-
tes issus de cultures sur PDA par facteur), intégrant l’effet
de l’isolat (2 de trèfle et 1 de luzerne) et de la durée de la
congélation (12 h, 24 h, 48 h) sur des sclérotes desséchés
pendant 1 mois, réhumidifiés ou non juste avant congéla-
tion. Dans tous les cas, les apothécies sont apparues entre 25 et 35 j après la mise des sclérotes sur vermiculite (2 mois
pour Mc GIMPSEYôG MALONE). Les récoltes se sont dérou- lées sur 4 semaines. La variabilité des résultats observée pour les répétitions d’un même facteur est telle qu’il est impos-
sible de faire ressortir l’effet propre à chaque facteur. Par rapport au 1 eressai, sans dessication préalable des scléro- tes ni congélation, ces 2 opérations ont apporté une amé-
lioration sensible de la production en apothécies, puisque
l’ensemble des 3.600 sclérotes utilisés dans le 2cessai ont
produit 771 apothécies (0,214 apothécie par sclérote).
Assez importants semblent être la durée de dessication
préalable à la congélation ainsi que le milieu de production
des sclérotes. Le tableau 1 résume en ce sens plusieurs essais
successifs conduits avec un seul isolat de trèfle violet.
La production d’apothécies, ainsi qu’indiqué dans le tableau, a démarré aussi rapidement que lors des essais pré-
cédents et s’est poursuivie pendant plus de 2 mois, avec en général un maximum entre les 5e et 8e semaines après congélation. Une durée de dessication voisine de 1 mois sem-
ble, dans nos conditions, la plus favorable à la formation des apothécies. Les sclérotes desséchés pendant 1 an ne sont pratiquement plus productifs.
Sur PDA, les sclérotes formés sont très petits (poids sec
de 100 sclérotes : 0,4 g) et ne donnent naissance le plus sou-
vent qu’à une seule apothécie (moyenne sur 150 sclérotes fructifères : 1,23 apothécie par sclérote). Par contre, sur carottes autoclavées, les sclérotes sont volumineux (poids
sec de 100 sclérotes : 5,2 g), chacun donnant souvent nais-
sance à plusieurs apothécies - nous en avons observé jusqu’à 22 par sclérote (moyenne sur 150 sclérotes fructi- fères : 2,12 apothécie par sclérote).
Les diamètres moyens en millimètres des apothécies âgées
d’une semaine sont différents selon les milieux d’obtention des sclérotes et sont en rapport avec la taille des sclérotes :
PDA : 3,39 ; écart type 0,69
Carottes broyées : 4,02 ; écart type 0,84 Carottes en tranches : 4,72 ; écart type 1,09 Ces dimensions sont comparables à celles des apothécies produites en conditions naturelles et semi-naturelles.
La quantité d’ascospores récoltées par apothécie est éga-
lement variable selon le milieu de production des sclérotes :
PDA : 45.200
Carottes broyées : 40.000
Carottes en tranches : 52.500
(Moyenne de 150 apothécies âgées d’une semaine)
Les petites apothécies formées à partir des sclérotes ré- coltés sur PDA seraient donc proportionnellement plus productives que celles provenant des sclérotes formés sur carottes autoclavées. Dans tous les cas, le rendement en
ascospores est supérieur à celui obtenu avec les apothécies naturelles ou produites à l’extérieur.
Remarquons que nous n’avons pas observé, dans nos conditions, de générations successives de formation d’apo-
thécies à partir d’un même sclérote, contrairement aux
observations de LAMARQUE(1980) sur S. sclerotiorum.
IV. CONCLUSION
Il est donc possible d’obtenir au laboratoire de grandes quantités d’apothécies fertiles de S. trifoliorum. Le contact
direct des sclérotes avec le sol en place ne semble pas être
indispensable pour induire la carpogenèse de cette espèce,
contrairement à ce qui est signalé pour S. sclerotiorum (LaNtaxQuE, 1980). Le rendement des sclérotes étant tou- tefois encore assez faible, il est indispensable d’utiliser une
grande quantité de ces organes dont l’obtention ne présente
aucune difficulté. La technique que nous avons mise au
point constitue cependant un net progrès par rapport aux méthodes précédentes, notamment celles se bornant à la récolte des apothécies en conditions naturelles ou même semi-naturelles. Cette technique devrait donc présenter un grand intérêt pour la recherche de résistances à la scléroti-
niose chez le trèfle violet. Ses étapes sont les suivantes :
- Culture du champignon pendant 1 mois sur PDA à
20 °C.
- Récolte des sclérotes.
- Dessication des sclérotes à la température du labora-
toire pendant 1 mois.
- Congélation des sclérotes desséchés, à - 18°C pen- dant 24 h.
- Dépôt des sclérotes sur vermiculite humide à 15 ° C,
sous un éclairement fluorescent de 18 W/m2, avec une photopériode de 12 h/24.
- Premières récoltes 1 mois après le dépôt sur
vermiculite.
Dans ces conditions, selon les essais, 100 boîtes de culture donnent entre 104et 1,5 x 105 sclérotes, lesquels produiront dans un délai d’un mois et pendant 2 à 3 mois de 2.000 à 3.000 apothécies à partir desquelles on récoltera
6 à 9 x 107ascospores pour constituer de 1,2 à 1,8 1 d’ino- culum à 5 x 104spores/ml, concentration que nous utili-
sons ordinairement. Il est certainement possible d’amélio-
rer encore la production d’ascospores au laboratoire,
notamment en obtenant une meilleure induction de la car-
pogenèse et en optimisant l’âge de récolte des apothécies qui, dans les manipulations précédentes, étaient récoltées très jeunes.
Notons que la longue durée requise pour produire l’ino-
culum impose d’avoir des cultures régulièrement échelon-
nées dans le temps si l’on veut obtenir suffisamment d’apo-
thécies en continu. La conservation aisée des ascospores permet de pallier dans une certaine mesure les aléas de leur production.
Les ascospores récoltées ont un pouvoir pathogène élevé, comparable à celui des ascospores naturelles, ainsi que nous
le montrerons dans un article ultérieur sur l’évaluation de la résistance du trèfle violet aux attaques par les ascospores.
Reçu le 25 novembre 1982.
Accepté le 28 décembre 1982.
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REMERCIEMENTS
Nous remercions Mme C. LAMARQUE(INRA, Versailles) pour ses
critiques judicieuses et ses compléments d’information.
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