Organisation et expression des gènes de résistance aux métaux lourds chez Cupriavidus metallidurans CH34

UNIVERSITE LIBRE DE BRUXELLES Faculté des Sciences

Organisation et expression des gènes de résistance aux métaux lourds chez

Cupriavidus metallidurans CH34

Sébastien MONCHY

Thèse présentée en vue de l'obtention du titre de Docteur en Sciences 2007

Directeurs de thèse: Max MERGEAY

Molecular & Cellular Biology

Institute for Health, Environment & Safety Belgian Nuclear Research Centre SCK ^. CEN

Ariane TOUSSAINT

Service de Conformation de Macromolécules

Biologiques et de Bioinformatique SCMBB

Université libre de Bruxelles

A mes chers parents

« Ne dérange pas mes cercles ! »

Archimède avant de mourir (287 av JC)

R R R

Remerciements emerciements emerciements emerciements

Je tiens tout d'abord à exprimer ma gratitude au professeur Max Mergeay sans qui je n'aurais jamais pu commencer ce travail. Je le remercie pour sa disponibilité, sa gentillesse, son soutien, ainsi que pour les fructueuses discussions scientifiques que nous avons eues tout au long de ma thèse. Merci pour tout Max, avec mon plus profond respect et mes amitiés les plus sincères.

Je remercie le professeur Ariane Toussaint avec qui j'ai eu la chance de travailler durant ces quatre années de thèse, malgré l'éloignement entre l'ULB et le SCK.CEN qui n'a pas toujours permis une plus étroite collaboration.

Je remercie également toutes les personnes qui m'ont aidé à réaliser ce travail. Je pense plus particulièrement aux Drs. Daniel van der Lelie et Safieh Taghavi pour m'avoir chaleureusement accueilli au sein de leur équipe à BNL (New-York) et ainsi permis d'avancer dans la fermeture de la séquence du génome de C. metallidurans CH34. Aux Drs. Tatiana Vallaeys, Ruddy Walliez, Raphaël Leplae et Philippe Bertin pour leur aide et leurs suggestions tout au long de ce travail.

Je voudrais aussi remercier les Drs. Guy Collard, Hans Vanmarcke et Mark Loos qui m'ont accueilli dans d'excellentes conditions au SCK.CEN et soutenu dans mes travaux de recherche.

Je remercie enfin tous les membres du laboratoire de Biologie Moléculaire et Cellulaire. En particulier mes ami(e)s et étudiants en thèse de doctorat : Joris Verheyde, Nicolas Morin, Sébastien van Aelst, Alfred Cubaka Kabagale, Vanessa Auquier, Félice Mastroleo, Aurélie Crabbé, Benny Pycke, Hanane Derradji qui ont rendu agréables ces quatre années de travail. Aux chercheurs de notre groupe, les Drs. Rafi Benotmane, Paul Janssen, Natalie Leys, Sarah Baatout, Paul Jacquet, Louis de Saint-Georges pour toutes les passionnantes discussions lors des pauses cafés. Enfin, aux techniciens qui m'ont aidé et conseillé dans la réalisation de mes expériences: Albert Bossus, Ann Proovost, Arlette Michaux, Ilse Coninx, Werner Schoonjans et Ann Janssen.

Je voudrais remercier mes ami(e)s qui ont rendu mon séjour en Belgique inoubliable et m'ont fait découvrir immodérement la culture et les bières de ce pays : Astrid Herman, Wouter van Renterghem, Carsten Mischke, Benoît Benedetto, Marcella Mori, Florence Marty et bien d'autres...

Enfin, je tiens à remercier ma famille et en particulier mes parents et mon frère

pour leur soutien continu tout au long de ma thèse de doctorat, aussi bien dans les bons

moments que dans ceux de doutes et d'impatience. C'est à eux que je dédis ce travail.

Table des matières

ABREVIATIONS: ... 6

I. INTRODUCTION GENERALE: DE CUPRIAVIDUS METALLIDURANS CH34 AUX MECANISMES MICROBIENS DE RESISTANCE AUX METAUX LOURDS... 8

I.1. Bref historique: de la découverte de la souche CH34 à ses perspectives en biotechnologie de l'environnement 8 I.2. Taxonomie de C. metallidurans CH34 10 I.3. Le génome de C. metallidurans CH34 : quatre réplicons 12 I.4. La résistance aux métaux lourds 13 I.4.1. Nécessité / toxicité 13 I.4.2. Mécanismes de résistance ...15

I.4.2.1. Séquestration, biosorption, immobilisation, biominéralisation: ...16

I.4.2.2. Conversion enzymatique ...17

I.4.2.3. Le thème principal: porter le métal hors du cytoplasme (mais aussi du périplasme) ...17

I.4.2.3.1. Les transporteurs membranaires ...17

I.4.2.3.1.1. Les transporteurs primaires: ATPases de type P 17 I.4.2.3.1.2. Les transporteurs secondaires 19 I.4.2.3.1.2.1. Les systèmes RND (chimioosmotiques) ...19

I.4.2.3.1.2.2. Le système CDF (Cation Diffusion Facilitators)...21

I.4.2.3.1.2.3. Les protéines MFS (Major Facilitator Superfamily) ...22

I.5. Mécanismes microbiens de résistance aux métaux lourds présents chez C. metallidurans 23 I.5.1. Résistance à l'argent :...24

I.5.2. Résistance au cadmium, au cobalt et au zinc : ...24

I.5.2.1. Via un transporteur ATP-dépendant:...24

I.5.2.2. Via l'extrusion chimioosmotique: le système czc ...25

I.5.2.3. Via le système CDF (Cation Diffusion Facilitator) ...26

I.5.3. Résistance au chromate ...26

I.5.4. Résistance au cuivre :...27

I.5.4.1. Via les ATPases d'efflux: ...27

I.5.4.2. Via l'extrusion chimioosmotique: ...28

I.5.4.3. Via le système pco/cop (périplasmique):...28

I.5.5. Résistance au mercure :...29

I.5.6. Résistance au nickel et au cobalt:...31

I.5.6.1. Le système RND : cnr ...31

I.5.6.2. Les systèmes ncc (RND) et nre ...32

I.5.7. Résistance au plomb ...32

I.5.8. Résistance au thallium ...33

II. BUT DU TRAVAIL ... 34

III. RESULTATS ... 35

III.1. L'analyse bioinformatique du génome de C. metallidurans CH34 35 III.1.1. Inventaires des gènes de résistance aux métaux lourds chez C. metallidurans CH34 ...35

III.1.1.1. Les gènes de la famille des HME-RND ...36

III.1.1.2. Les gènes codant pour les ATPases de type P ...38

III.1.1.3. La résistance au cuivre ...40

III.1.1.4. Les gènes des familles CDF, CHR et ars ...41

III.1.1.5. Les gènes impliqués dans la régulation ...41

III.2. Approche expérimentale ciblée de trois des systèmes impliqués dans la résistance aux métaux lourds...43

III.2.1. Les systèmes HME-RND 43

III.2.2. Les ATPases de type P 46

III.2.2.1. Six des huit ATPases de type P sont activées en présence de métaux lourds...46

III.2.2.2. Analyse phénotypique de l'ATPase ZntA ...49

III.2.2.3. La réponse au Tl(I) pourrait en outre être gouvernée par un autre gène que celui codant pour une ATPase ...51

III.2.3. La résistance au cuivre 55 III.2.3.1. Le phénotype de résistance au cuivre est lié au plasmide pMOL30...55

III.2.3.2. Un fragment de 16,6 kb confère la résistance au Cu(II)...55

III.2.3.3. Le groupe de gènes impliqués dans la résistance au cuivre contient au moins 19 ORFs ...56

III.2.3.4. La transcription des 19 gènes cop est activée en présence des ions Cu(II) ...58

III.2.3.5. L’analyse protéomique révèle la surexpression de six protéines Cop ...60

III.3. Une approche transcriptomique globale 60 III.3.1. Les plasmides pMOL28 et pMOL30...61

III.3.1.1. Description des deux plasmides ...63

III.3.1.2. L’extension de la région de résistance aux ions Cu(II)...65

III.3.1.3. Trois petites ORFs similaires et de fonction inconnue fortement surexprimées en présence de métaux lourds...66

III.3.1.4. Un nouveau gène identifié dans l'opéron pbr pourrait être impliqué dans la résistance au plomb ..67

III.3.2. Le chromosome et le mégaplasmide ...67

III.3.2.1. Les voies métaboliques induites en présence de cuivre et de plomb...68

III.3.2.2. Voies métaboliques induites par le Pb(II) ...70

IV. Discussion générale et conclusions 71 IV.1. Tous les gènes identifiés comme potentiellement impliqués dans la résistance sont-ils activés en présence d'ions métalliques ? ...71

IV.2. Combien de gènes sont vraiment impliqués dans la résistance aux ions Cu(II) ? ...72

IV.3. Un "appel aux armes" en présence d'ions métalliques ?...73

IV.4. Le catalogue des gènes de résistance est-il complet après sa mise à jour grâce aux études transcriptomiques ? ...73

IV.5. La structure du génome et l'assemblage en modules de gènes de résistance aux métaux lourds: ...74

IV.6. L'annotation et le décryptage des autres fonctions biologiques de C. metallidurans CH34, une vie en dehors de la résistance aux métaux lourds ? ...75

V. REFERENCES... 77

VI. MATERIELS ET METHODES... 88

VI.1. Séquençage et fermeture du génome de C. metallidurans CH34 88 VI.2. Souches et conditions de culture : 92 VI.3. Composition du milieu 284 gluconate : 92 VI.4. Prédiction de fonction et analyse phylogénétique : 93 VI.5. Détermination des comptes viables : 94 VI.6. Les puces à ADN : 94 VI.6.1. Le « spotting »...94

VI.6.2. Marquage et hybridation ...94

VI.6.3. Scanner et analyser les puces à ADN ...95

VI.7. PCR quantitative 96

VI.8. Programmes utilisés au cours de cette étude 97

VII. ANNEXES ... 98

Abréviations:

aa: acide aminé

ABC-transporteur : ATP-binding cassette-tranporteur ADN : Acide désoxyribonucléique

ADNc : Acide désoxyribonucléique complémentaire ARN : Acide ribonucléique

ars : résistance à l'arsenic (gène)

BLAST : Basic Local Alignment Search Tool CDF : Cation Diffusion Facilitator

CHR : CHromate Transporter Chr. : Chromosome

CMI : Concentration Minimale Inhibitrice cnr : résistance à cobalt, nickel (gène) cop : résistance au cuivre "copper" (gène) czc: résistance au cadmium, zinc, cobalt (gène) ECF : Environmental Control Factor

GEO : Gene Expression Omnibus

HAE-RND : Hydrophobic and Amphiphilic compounds - Export Resistance-Nodulation-Cell Division

HME-RND : Heavy Metal Efflux – Resistance-Nodulation-Cell Division ICE : Integrative Conjugative Element

IS: Insertion Sequence kb : kilopaire de base

MAGE : Magnifying Genomes ou Microbial Genome Annotation System Mb : mégapaire de base

mer : résistance au mercure (gène) MFP : Membrane Fusion Protein MGE : Mobile Génétique Elément

ncc : résistance au nickel, cobalt, cadmium (gène) NCBI : National Center for Biotechnology Information MPL : MegaPLasmide

OMP : Outer Membrane Protein ORF ou orf : Open Reading Frame

PAGI : Pseudomonas aeruginosa Genomic Island pb : paire de bases

pbr : résistance au plomb (gène) PCR : Polymerase Chain Reaction p.v. : pValue

Q-PCR : Quantitative - Polymerase Chain Reaction RMGI : Ralstonia metallidurans Genomic Island RND : Resistance-Nodulation-Cell Division SAM : Significance Analysis of Microarrays sil : résistance à l'argent "silver" (gène) SOD : Superoxide Dismutase

TAT : Twin Arginine Translocation

t.exp. : taux d’expression (ratio _r/v )

Tn: transposon

Les principaux ions métalliques : Ag(I) : argent

Bi(III) : bismuth Cd(II) : cadmium Co(II) : cobalt CrO 4 2-

: chromate Cu(I) ou Cu(II) : cuivre Hg(II) : mercure

Mn(IV) : manganèse

Ni(II) : nickel

Pb(II) : plomb

Tl(I) : thallium

Zn(II) : zinc

I. Introduction générale: de Cupriavidus metallidurans CH34 aux mécanismes microbiens de résistance aux métaux lourds

I.1. Bref historique: de la découverte de la souche CH34 à ses perspectives en biotechnologie de l'environnement

Depuis la révolution industrielle, de nouvelles niches écologiques sont apparues suite au rejet dans l'environnement de déchets industriels toxiques constitués souvent d'un mélange de métaux lourds, de composés organiques et d'hydrocarbures. Ces biotopes sont considérés comme extrêmes vu la présence abondante et chronique de rejets toxiques, les limitations en nutriments organiques, et les fluctuations importantes de température et d'hydrométrie. Une telle combinaison de conditions environnementales est, sans doute, très rare sauf dans le cas de catastrophes naturelles tels que les tremblements de terre, les inondations ou encore les éruptions volcaniques, mais est typique des environnements industriels ou anthropogéniques. On peut supposer que des organismes pionniers capables d'adaptation rapide soient seuls capables de survivre et de jouer un rôle dans la recolonisation de tels environnements.

Cupriavidus metallidurans souche CH34 a été isolée pour la première fois en 1976 par Christian Houba, dans les sédiments d'une usine non ferro-métallique "Métallurgie de Prayon" à Engis près de Liège (Mergeay et al., 1978a). Cette bactérie, multirésistante aux métaux lourds, possède deux grands plasmides pMOL28 (171 kb) et pMOL30 (234 kb). D'abord caractérisée comme résistante au Zn(II) (les sédiments dans lesquels elle a été découverte avaient une teneur en Zn(II) de l'ordre de 10000 µg/g), au Cd(II) et au Co(II), CH34 a ensuite démontré des résistances au Ni(II), au Cu(II), au CrO ₄ ^2- , au Hg(II) et au Pb(II). Les cellules de CH34 ont une forme circulaire (0.4 µm de diamètre et 1 à 2 µm de longueur) qui se présente sous forme simple, par paire ou en courte chaîne. Cette bactérie à Gram ^- appartient à la famille des β-protéobactéries. Elle se déplace grâce à un flagelle péritriche. En 1978, elle fut caractérisée comme hydrogénotrophe facultative (Mergeay et al., 1978b). Par la suite, avec la découverte de deux déshydrogénases (l'une cytoplasmique, l'autre membranaire), cette souche fut apparentée aux bactéries Alcaligenes eutrophus (Mergeay et al., 1985). Toutefois, la taxonomie de cette souche a fortement évolué comme décrit dans la section I.2., le nom de genre actuel, Cupriavidus, n'ayant été fixé qu'en 2005.

Le métabolisme de C. metallidurans est de type oxydatif: elle utilise une grande gamme de

substrats comme source de carbone mais pas les sucres, même pas le fructose, ce qui permet

notamment de la distinguer de C. eutrophus H16 qui peut utiliser ce seul glucide. C. metallidurans

est aussi chimiolithotrophe facultative. Elle peut utiliser le CO 2 ou le carbonate comme source de carbone et tirer son énergie de l'oxydation de l'hydrogène. CH34 est également capable d'utiliser l'acétone comme source de carbone grâce à la présence d'une acétone carboxylase que très peu de bactéries caractérisées à ce jour semblent posséder. Enfin, cette bactérie et C. eutrophus H16 peuvent synthétiser de longues chaînes poly-carbonées, tel que le PHB (polyhydroxybutyrate), pour la mise en réserve de sources de carbone. Cette particularité est exploitée par l'industrie pour la fabrication de bioplastique (Pohlmann et al., 2006; Schwartz et al., 2003; Tang et al., 1999).

Des outils génétiques ont été mis au point pour la souche CH34 (Lejeune et al., 1983;

Mergeay et al., 1987; Sadouk & Mergeay, 1993) qui est une bonne acceptrice de gènes étrangers.

Des mutants non résistants au Zn(II), Cd(II) et Co(II) s'isolent facilement en cultivant la bactérie à 37°C (au lieu de 30°C, sa température optimale de croissance) ce qui laissaient supposer un "curage" du plasmide (Mergeay et al., 1978a). Ces expériences de "curage" et des expériences de transfert des déterminants de résistance à d'autres souches ont permis de montrer que les résistances au Zn(II), au Cd(II) et au Co(II) sont codées par le plasmide pMOL30, alors que les résistances au Ni(II) et au Co(II) sont codées par le plasmide pMOL28. D'autres résistances aux métaux ont ensuite été attribuées de la même façon à l'un ou l'autre des deux plasmides. Les déterminants de résistance au Zn(II), Cd(II) et Co(II) de pMOL30 ont été clonés dans un vecteur à large spectre d'hôte (pRK290) (Nies et al., 1987). Le plasmide résultant peut être mobilisé dans divers bactéries, mais l'expression de la résistance est faible en dehors des souches taxonomiquement apparentées à C. metallidurans (Collard et al., 1994). La séquence de l'insert de pRK290 a révélé que des gènes czc, codant pour les composants d'un mécanisme d'extrusion chimioosmotique à trois composants, sont impliqués dans la résistance au Zn(II), Cd(II) et Co(II).

La présence de gènes de résistance aux métaux lourds sur des plasmides pose la question de la dispersion de tels plasmides dans l'environnement. Afin de répondre à cette question, les 9.1 kb du fragment czc (résistance au Cd(II), Zn(II), Co(II)) ont été utilisés comme sonde pour détecter la présence d'autres déterminants czc dans les bactéries de sols isolés d'environnements pollués en métaux lourds aussi divers que des sédiments autour des industries de métallurgie non ferreuse en Belgique, en Allemagne, ainsi que dans les régions minières de la République Démocratique du Congo. Les échantillons prélevés en Belgique contenaient essentiellement des concentrations élevées en Cu(II) (jusqu'à 1000 ppm), Pb(II) (jusqu'à 2000 ppm) et Zn(II) (jusqu'à 11000 ppm), tandis que les sols prélevés au Congo contenaient essentiellement de hautes concentrations en Co(II) (jusqu'à 2650 ppm), Cu(II) (jusqu'à 31700 ppm) et Zn(II) (jusqu'à 13700 ppm) (Diels &

Mergeay, 1990). Dans ces différents environnements ont été identifiées des souches de C.

metallidurans (portant à l'époque le nom d'Alcaligenes eutrophus) qui possèdent également de

grands plasmides qui s'hybrident avec la sonde czc (Diels & Mergeay, 1990). Une approche

similaire a été effectuée avec des sondes spécifiques des déterminants de résistance du Ni(II), Co(II), et des déterminants de résistance au Hg(II) (Diels & Mergeay, 1990). Les différentes souches identifiées possédaient tout comme C. metallidurans CH34, deux grands plasmides ayant des tailles similaires à celles de pMOL28 et pMOL30 et en plus partagent les mêmes caractéristiques de résistance aux métaux lourds que la souche CH34. Hormis ces souches résistantes au Zn(II) hybridant avec la sonde czc, et phénotypiquement proches de C. metallidurans, quelques bactéries fluorescentes et quelques flavobactéries ont également été identifiées sur des milieux non sélectifs.

Sur le site industriel de Maatheide (Lommel, Province du Limbourg,Belgique), des bactéries Gram ⁺ ont également été identifiées, tel que quelques Streptomycètes, ainsi que des Actinobactéries (bactérie Gram ⁺ à haut %GC) identifiées comme Arthrobacter ilicis.

Certaines propriétés de CH34 en font un bon candidat pour les applications à la biotechnologie de l'environnement. CH34 dégrade diverses substances aromatiques récalcitrantes telles que le toluène, le benzène, l'o-xylène ou l'éthylbenzène et exprime les gènes de dégradation de PCB et d'autres chloroaromates et pourrait donc être utilisée pour le traitement de pollutions mixtes (Merlin et al., 1997; Springael et al., 1993; Springael et al., 1996), d'effluents pollués par les métaux lourds (Diels et al., 1999; Diels et al., 1995b), de sols pollués. CH34 peut en outre être exploitée pour la mise au point de biosenseurs permettant de suivre la concentration en métaux lourds dans les sols (Corbisier et al., 1999; Diels et al., 1995a; Tibazarwa et al., 2001; van der Lelie et al., 1994), pour la bioaugmentation (Dong et al., 1998) ou encore la phytoremédiation (Lodewyckx et al., 2002).

La souche a aussi été utilisée en écologie microbienne pour approcher la dissémination des gènes dans les environnements pollués (Top et al., 1990; Top et al., 1992; Top et al., 1994; Top et al., 1995).

I.2. Taxonomie de C. metallidurans CH34

En 1995, une analyse taxonomique polyphasique basée sur l'ARN 16S, sur des caractérisations phénotypiques et sur une analyse des lipides et acides gras des bactéries a été appliquée aux groupes Alcaligenes eutrophus, Burkholderia pickettii, Burkholderia solanacearum, CH34 et à un groupe de souches Czc ⁺ isolées de biotopes riches en métaux lourds (Diels &

Mergeay, 1990). Les résultats ont amené le reclassement de ces bactéries dans un nouveau genre Ralstonia qui comprenait déjà Ralstonia eutropha, Ralstonia pickettii et Ralstonia solanacearum (Yabuuchi et al., 1995).

En 1999, différentes souches du genre Ralstonia provenant de biotopes industriels très pollués en métaux lourds ont été testées pour leur capacité à croître dans un tel environnement.

Suite à ces tests, la souche CH34 et une quarantaine d'autres bactéries du genre Ralstonia ont été

rassemblées dans un sous groupe nommé "Ralstonia eutropha-like metal-resistant strains" (Brim et al., 1999). Le nom de Ralstonia metallidurans a été introduit pour CH34, en vertu des différentes résistances aux métaux lourds que possède cette dernière (Goris et al., 2001).

En 2004, de nouvelles analyses révèlent une séparation claire du genre Ralstonia en deux sous-groupes: la lignée Ralstonia eutropha et la lignée Ralstonia pickettii. La lignée Ralstonia eutropha, comprenant la souche CH34 et les souches Czc ⁺ apparentées, est alors rebaptisée Wautersia, et le groupe des souches représentées par CH34 devient Wautersia metallidurans (Vaneechoutte et al., 2004).

Six mois plus tard, toutes les bactéries appartenant au genre Wautersia sont reclassées dans le genre Cupriavidus. En effet, le genre Wautersia est considéré comme synonyme junior de Cupriavidus et en vertu des différentes règles du code international de nomenclature des bactéries, la dénomination Cupriavidus est prioritaire sur le genre Wautersia (Vandamme & Coenye, 2004), ce qui n'a pas été sans provoquer de grosses incompréhensions entre les taxonomistes et les chercheurs travaillant depuis près de cinquante ans sur la souche type Alcaligenes eutrophus. La souche CH34 porte donc à ce jour le nom de Cupriavidus metallidurans CH34 (Table 1).

Périodes Nom de la bactérie

Avant 1995 Alcaligenes eutrophus

De 1995 à 1999 Ralstonia eutropha De 1999 à 2001 Ralstonia eutropha-like De 2001 à 2004 Ralstonia metallidurans De début 2004 à mi-2004 Wautersia metallidurans De mi-2004 à maintenant Cupriavidus metallidurans

Table 1: Historique de la nomenclature du genre: d'Alcaligenes à Cupriavidus

L'hydrogénotrophie jointe à la résistance aux métaux lourds chez le genre Cupriavidus, et

plus particulièrement C. metallidurans laisse supposer une adaptation à des biotopes minéraux

naturels, tels que les biotopes volcaniques (Mergeay, 2000). L'hypothèse d'une possible colonisation

des milieux volcaniques par le genre Cupriavidus, est appuyée par la découverte récente de

différentes souches comme C. pinatubonensis (en référence au volcan du même nom dans les îles

Philippines) et C. laharensis (qui se réfère au lahar, un terme technique qui décrit les coulées de

boues formées par le mélange de poussières crachées par les volcans en éruption et de la neige de

leurs sommets) (Sato et al., 2006) (voir arbre phylogénétique décrit dans la figure 1). Les souches

de ces deux genres isolées dans ces conditions sont chimiolithotrophes facultatives et capables

d'oxyder l'hydrogène. La souche de R. eutropha JMP134 est en fait un C. pinatubonensis ((Sato et

al., 2006); Peter Vandamme, comm. pers.) (Fig1).

Cupriavidus metallidurans

Cendres volcaniques Biotopes industriels Fixation d'Azote Hydrogénotrophie

Biotopes industriels Pathogènes opportunistes Biotopes industriels

Pathogènes des plantes Dégradation de xénobiotiques

Dégradation de xénobiotiques

Cupriavidus metallidurans Cupriavidus metallidurans Cupriavidus metallidurans

Cendres volcaniques Biotopes industriels Fixation d'Azote Hydrogénotrophie

Biotopes industriels Pathogènes opportunistes Biotopes industriels

Pathogènes des plantes Dégradation de xénobiotiques

Dégradation de xénobiotiques

Fig 1: Taxonomie du genre Ralstonia/Cupriavidus et leurs biotopes environnementaux (P. Vandamme, comm. pers.).

I.3. Le génome de C. metallidurans CH34 : quatre réplicons

Toutes les études, tant fondamentales qu'appliquées, sur cette bactérie ont eu besoin pour progresser du séquençage du génome de CH34 (section III.1 et annexe). Celui-ci a été initié en 2000 et achevé en avril 2006 par le "Joint Genome Institute" (Département of Energy (DOE) et University of California, http://genome.jgi-psf.org/draft_microbes/ralme/ralme.draft.html). Les étapes qui ont mené à la fermeture du génome sont décrites en annexe. Il est constitué de quatre réplicons: un chromosome de 3.9 Mb, un mégaplasmide de 2.6 Mb et deux plasmides pMOL28 et pMOL30 de respectivement 171 kb et 234 kb. L'annotation du chromosome et du mégaplasmide est en cours tandis que celle des deux plasmides est terminée.

La distinction entre le chromosome et le mégaplasmide résulte de la comparaison de ces

réplicons avec ceux de Ralstonia solanacearum GMI1000 qui possède un chromosome de 3.7 Mb

et un mégaplasmide de 2.1 Mb. Le premier partage 60 % de similarité avec le chromosome de

CH34 et le second 30 % de similarité avec le mégaplasmide de CH34 (article I en annexe). Les

origines de réplication correspondantes sont similaires. Enfin, la première carte circulaire du

chromosome de CH34 réalisée par conjugaison (Sadouk & Mergeay, 1993) contient surtout des

gènes de biosynthèse (acides aminés, vitamines, purines) et quelques gènes du métabolisme

énergétique (dégradation de la tyrosine, de l'isoleucine, des acides dicarboxyliques,

chimiolithotrophie). A cette époque, on ne pouvait pas encore soupçonner à côté du chromosome et

des plasmides la présence d'un second très grand réplicon que nous considérons maintenant comme

un mégaplasmide. Les données de séquences actuellement disponibles suggèrent que cette

organisation en deux mégaréplicons soit la règle au sein du genre Ralstonia/Cupriavidus ainsi que

chez les Burkholderia. C. metallidurans, R. solanacearum (Salanoubat et al., 2002), et d'autres espèces telles que C. taiwanensis, C. eutrophus JMP134 (actuellement C. pinatubonensis), C.

eutrophus H16 (Pohlmann et al., 2006) dont les génomes ont été récemment séquencés, possèdent toutes deux grands réplicons et parfois un ou plusieurs plasmides. Il y aurait un lien entre les plasmides (l'îlot génomique porteur des gènes de pathogenèses pourrait jouer le même rôle dans R.

solanacearum) et la niche écologique, voire l'espèce. Par exemple, dans le cas de C. eutrophus H16, le plasmide pHG1 de 452 kb porte les gènes codant pour les enzymes clés de la lithoautotrophie (basée sur l'oxydation de l'hydrogène et la fixation du CO ₂ par la ribulose biphosphate carboxylase et le cycle de Calvin) (Schwartz et al., 2003). Chez R. taiwanensis, le plasmide pSym de 534 kb code pour les enzymes impliquées dans la nodulation et la fixation de l'azote nécessaire à la symbiose de la bactérie avec sa légumineuses hôte, le mimosa (Chen et al., 2001). Dans le cas de C.

metallidurans CH34, la présence des deux plasmides pMOL28 et pMOL30 et de leurs nombreux gènes de résistance semblerait correspondre avec l'adaptation à des écosystèmes industriels riches en métaux lourds.

I.4. La résistance aux métaux lourds I.4.1. Nécessité / toxicité

Une des définitions proposées pour le terme "métaux lourds" englobe tous les éléments métalliques ayant une masse volumique supérieure à 5g/cm3 (Nies, 1999). Parmi les 53 métaux concernés par cette définition, certains ne sont pas bio-disponibles dans les écosystèmes habituels.

Cette bio-disponibilité dépend de la concentration du métal et de sa solubilité dans ces milieux.

Pour pouvoir interagir avec les cellules vivantes, le métal doit être sous une forme soluble et présent à une concentration de l'ordre du nanomolaire au moins.

L'interaction des bactéries avec les métaux se produit sur une gamme de concentrations en métaux allant du nanomolaire (10 ^-9 M) pour l'homoeostasie (métaux essentiels) au millimolaire (10 ^-

3 ) pour la résistance (toxicité pour ces mêmes métaux) et jusqu'au molaire pour certains

chimiolithotrophes acidophiles (Fig 2)). Lors de cette étude, les concentrations métalliques utilisées

correspondent à l'expression d'une résistance chez les Protéobactéries (millimolaire).

Fig 2: Gamme de concentration en métaux lourds et réponse biologique associées (S. Taghavi (1996), thèse de doctorat)

L'interaction bactéries-métaux lourds a été surtout étudiée dans les environnements extrêmes. La nature des interactions dépend du rôle biologique du métal dans la cellule. Certains métaux lourds (Ni, Co, Fe, Zn, Cu …) sont des cofacteurs indispensables de certaines protéines pour leur stabilisation ou leur conformation, mais deviennent toxiques à haute concentration. Par exemple, le nickel est un cofacteur des uréases (Dosanjh et al., 2007) et des hydrogénases (Higuchi et al., 1997; Higuchi et al., 1999; Wu & Mandrand, 1993; Wu et al., 1994) et le cobalt est un cofacteur chez certaines enzymes du métabolisme de la méthionine ou de la vitamine B12 (Wang et al., 2003). D'autres métaux lourds provoquent un stress oxydatif à cause de leur potentiel redox (Cu, Fe...). La grande variété de métaux lourds et de leurs effets biologiques nécessite chez la bactérie une régulation fine pour le maintien (homoeostasie) et le contrôle de leur concentration intracellulaire (Nies, 1999). Cette régulation évite l'expulsion des métaux essentiels présents aux concentrations homéostatiques (dans le domaine nanomolaire), ou l'entrée de métaux en quantité toxique (de l'ordre du micromolaire).

Les ions métalliques lourds entrent dans la cellule par deux types de voies. La première, empruntée par une large gamme de substrats, est rapide, indépendante du métal, fait intervenir des porines exprimées de manière constitutive et dépend uniquement d'un gradient chimiosmotique au travers de la membrane bactérienne. La seconde, requiert une consommation d'énergie souvent sous la forme d'hydrolyse de l'ATP (ex: ABC-transporteurs). Ces systèmes sont inductibles en réponse à des besoins particuliers (Nies & Silver, 1995).

La toxicité intracellulaire des ions métalliques lourds relève de divers mécanismes:

- L'inhibition des activités enzymatiques : les cations métalliques se fixent sur des résidus

cystéine, acide glutamique ou acide aspartique qui font partie du site actif de plusieurs

enzymes. Un grand excès d'ion métallique peut aussi entrer en compétition avec un autre ion

nécessaire à l'activité d'une enzyme et localisé dans son site actif (As, Sb, Se, W, F). Certain ions ont une structure proche du phosphate ou de l'ADP / ATP et dès lors peuvent inhiber des ATPases, c'est le cas du vanadate (Nies, 1999) ou encore des ions Al, Be, Sc, Y, Zr (Kabata-Pendias & Pendias, 1992). D'autres ions métalliques peuvent occuper les sites de groupements phosphate et nitrate essentiels. C'est le cas des oxyanions tels qu'arsenate, fluorate, borate, bromate, selenate, tellurate et tungstate (Kabata-Pendias & Pendias, 1992).

- L'altération de la structure des acides nucléiques : la fixation des cations métalliques sur les groupements phosphates des acides nucléiques peut entraîner des modifications de structure empêchant la transcription ou la traduction des gènes (Hengstler et al., 2003).

- L'interaction avec des espèces oxygénées réactives issues des processus cellulaires respiratoires, ce qui entraîne la formation de radicaux libres, lesquels peuvent endommager l'ADN (provoquant des mutations), les protéines (en créant des pontages entre molécules ou en leur sein), ou encore les acides gras insaturés de la membrane cellulaire.

I.4.2. Mécanismes de résistance

Les micro-organismes doivent développer des mécanismes de résistance contrebalançant

l'effet des hautes concentrations en métaux lourds tout en assurant le maintien du rôle biologique

des ions essentiels. Il convient de faire la différence entre la résistance aux métaux lourds dans des

domaines de concentrations situés juste au dessus de la CMI (comme c'est le cas chez E. coli) et les

véritables résistances aux métaux lourds conduisant à l'adaptation à des milieux extrêmes (comme

c'est le cas chez C. metallidurans). Des mécanismes de résistance aux métaux lourds tels que la

biominéralisation, la séquestration, ou la conversion enzymatique différent des véritables

résistances aux métaux lourds qui sont eux liés à la présence de gènes portés par des éléments

génétiques mobiles tels que les plasmides. Ceux-ci portent des déterminants de résistance qui

assurent l'extrusion des métaux (CDF, RND, ATPases de type P). La biodisponibilité et la

toxicité/nécessité des ions métalliques pour la bactérie dépendent de leurs caractéristiques physico-

chimiques. Il existe une grande diversité de mécanismes de résistance aux ions métalliques, liée à

leur valence, leur taille, leur indice de solubilité, leur potentiel rédox ainsi que la forme sous

laquelle l'élément il se trouvent dans l'environnement. Les conditions physicochimiques du milieu

(et en particulier le pH et l'Eh mais également la présence de complexes argilo humiques...) influent

sur la biodisponibilité des éléments-traces métalliques et donc leur toxicité (voir par exemple la

figure 3 qui illustre les différentes formes du chrome en fonction des conditions d'oxygénation et

d'acidité du milieu).

Fig 3: Ce diagramme de Pourbaix pour le chrome, montre que les conditions redox et de pH conditionnent la forme sous laquelle se trouve l'ion métallique dans l'environnement.

On voit sur les plasmides des combinaisons de mécanismes (RND, ATPases, CDF…) généraux ou associés à des mécanismes plus spécifiques d'un métal (copABCD, chrABF…) qui permettraient une résistance à des concentrations plus élevées. Nous retrouvons ici le thème familier de l'arsenal modulaire, typique des éléments génétiques mobiles et du transfert horizontal de gènes ("horizontal gene pool").

I.4.2.1. Séquestration, biosorption, immobilisation, biominéralisation:

La séquestration du métal dans un compartiment de la cellule ou sur la surface externe de la membrane est un mécanisme efficace mis en place par les bactéries pour résister aux métaux lourds.

Cette séquestration peut agir comme première ligne de défense pour immobiliser rapidement les

métaux et éviter leurs effets toxiques. Cette séquestration peut agir en complément d'autres

mécanismes de résistance (tels que les mécanismes d'efflux) évitant la réentrée du métal expulsé, en

particulier dans les situations extrêmes. Contrer cette réentrée peut coûter beaucoup d'énergie. Pour

en diminuer le coût, tous les phénomènes de biominéralisation, biosorption, séquestration, piégeage

intracellulaire ainsi que le métabolisme, peuvent jouer un rôle dans la résistance. Dans certains cas,

ces mécanismes de séquestration pourraient s'enclencher en présence de stimuli toxiques et ainsi

assurer seuls la résistance aux métaux lourds. Chez les bactéries à Gram ^- la séquestration dans un

compartiment de la cellule ou la biosorption à la surface de la membrane externe s'effectue souvent

en combinaison avec d'autres systèmes et nécessite parfois des protéines à hautes affinités pour les

ions métalliques telles que la métallothionéine SmtA (Blindauer et al., 2002), les sidérophores dont

certains ont une forte affinité pour les métaux lourds, même si elle reste inférieure à celle observée

pour le fer, les agents complexants tel que les acides organiques (oxalate, citrate…) ou encore les polyphosphates.

La séquestration peut aussi se faire sous forme de cristaux (biominéralisation) lié à une alcalinisation du milieu résultant de l'activité cellulaire, et à la formation de carbonates à la surface cellulaire qui, lorsqu'il y a sursaturation, cristallisent avec les ions métalliques présents. Les cristaux formés peuvent s'adsorber de manière non spécifique sur la paroi extracellulaire (Diels et al., 1995a;

Podda et al., 2000).

I.4.2.2. Conversion enzymatique

La conversion enzymatique consiste à convertir le métal en une forme moins toxique ou en une autre forme qui peut être plus facilement et plus rapidement évacuée de la cellule. Cette transformation peut se faire par voie enzymatique, par oxydation ou réduction comme pour le mercure (Silver & Phung, 1996), ou encore après réaction avec un produit du métabolisme énergétique de la cellule (comme la réduction du sélénium par les produits soufrés tel que les thiosulfate ou les sulfites). Le mécanisme de la résistance au mercure est décrit dans la section I.5.5.

I.4.2.3. Le thème principal: porter le métal hors du cytoplasme (mais aussi du périplasme)

I.4.2.3.1. Les transporteurs membranaires

Chez les bactéries, la résistance aux métaux lourds nécessite, le plus souvent, un système d'efflux ou extrusion. Chez les bactéries Gram ^- , ce transport actif, qui doit être capable de faire passer les ions à travers deux membranes, est principalement assuré par les transporteurs primaires et secondaires. Pour les premiers, le transport est directement couplé à l'hydrolyse de l'ATP (transporteur ABC, ATPase). Pour les seconds, le passage au travers de la membrane se fait grâce à un gradient électrochimique (protéines RND, MFS, CDF).

I.4.2.3.1.1. Les transporteurs primaires: ATPases de type P

La fraction la plus récalcitrante des métaux lourds à extruder est celle qui est liée au pool cytoplasmique des thiols. Leur extrusion ne peut se faire que via un système consommant de l'énergie. Les ATPases de type P sont des acteurs majeurs dans la résistance aux cations divalents en assurant leur extrusion de la cellule.

Ces ATPases doivent leur étiquette P au motif DKTG impliqué dans la phosphorylation de

l'aspartate. Ce type de protéine se retrouve chez tous les organismes vivants. Grâce à l'hydrolyse de

l'ATP, ces enzymes génèrent un gradient d'ions au travers de la membrane interne. Les ATPases de type P, sont séparés en deux sous groupes, P1-A et P1-B.

Les membres de la sous-famille P1-A sont généralement impliquées dans le transport du potassium (K(I)) bien qu'il existe des exemples d'ATPases de type P1-A impliquées dans le transport d'ions lourds (oxyanions principalement) (Saier, 1994). Ces ATPases, assez rares et encore mal définies, ont un motif distinct pour le site de fixation du nucléotide par rapport aux autres membres de cette superfamille. Les protéines ArsA et ArsB d'E. coli sont parmi ces rares exemples : l'ATPase de type P1-A est formée par l'assemblage d'une sous-unité ATPasique, correspondant à un dimère de ArsA, et d'une sous-unité canal, correspondant à ArsB (Chen et al., 1996; Dey &

Rosen, 1995).

Les ATPases de la sous-famille P1-B, aussi connues sous le nom de HM-ATPases (pour Heavy Metal) contrôlent la concentration cytoplasmique d'une grande variété de métaux. La sous-famille P1-B se divise en deux classes principales. La première comporte les protéines de type CadA de Staphylococcus aureus (Nucifora et al., 1989) impliquées dans l'extrusion des ions cadmium (Silver

& Phung, 1996), tandis que la seconde inclut les ATPases qui transportent les ions cuivre et/ou argent (voir section III.1.1.2). La protéine ZntA d'Escherichia coli est impliquée dans l'efflux des ions Zinc (Rensing et al., 1997b).

Les ATPases de type P1 sont définies par quatre particularités (Palmgren, 1998; Rensing et al., 1999; Solioz & Vulpe, 1996) (Fig 4):

- Au moins un site de fixation au métal du côté N-terminal, qui peut être un domaine à cystéines de type "CXXC" et/ou un domaine riche en histidine.

- Une séquence conservée "CPX" (X pouvant être un résidu histidine, sérine ou cystéine) qui joue un rôle au niveau du canal permettant le passage de l'ion.

- Une séquence dipeptidique conservée "HP" dans le second domaine cytoplasmique dont le rôle n'est pas encore défini.

- Une topologie membranaire unique (Solioz & Vulpe, 1996) (Fig 4):

o a) du côté N-terminal, il y a quatre hélices membranaires qui précèdent la première boucle cytoplasmique (au lieu de deux chez les autres ATPases).

o b) du côté C-terminal, après la seconde boucle cytoplasmique, il n' y a que deux

hélices transmembranaires (au lieu de quatre).

Fig 4: Structure schématiques des ATPases de type P1 impliquées dans le transport des métaux lourds (V. Auquier). Le site phosphatase (TGES), le site de phosphorylation (DKTGT) et le site de fixation de l'ATP (GDGXNDXP) sont communs à toutes les ATPases de type P1. Les sites CPX, HP et les sites de fixation au métal (poly-His, CXXC) sont spécifiques des ATPases de type P1 impliquées dans le transport des métaux lourds (V. Auquier, comm. pers.).

I.4.2.3.1.2. Les transporteurs secondaires

I.4.2.3.1.2.1. Les systèmes RND (chimioosmotiques)

Les transporteurs bactériens impliqués dans la résistance, la nodulation et la division cellulaire constituent la base de la superfamille des systèmes RND (Resistance-Nodulation-Cell Division) (Dong & Mergeay, 1994; Saier et al., 1994). Ce type de transporteur intervient dans la résistance aux métaux lourds, le transport de molécules organiques, la nodulation, chez Rhizobium, ou la division cellulaire chez Escherichia coli (Tseng et al., 1999). Au sein des systèmes RND ont trouve les systèmes RND-HAE (Hydrophobic and Amphiphilic compounds Export) et RND-HME (Heavy Metal Efflux) (Nies, 2003).

Le système RND est de type antiport cation-proton. Le flux de cations est équilibré par un

flux stœchiométrique de protons en sens opposé. Ce système à trois composants est constitué d'une

protéine de membrane externe (de la famille OMF: Outer Membrane Factor), d'une protéine

transpériplasmique (de la famille MFP: Membrane Fusion Protein) qui couple les deux protéines

membranaires et principalement d'une pompe localisée dans la membrane interne (de la famille

RND). L'ensemble des trois protéines forme un canal par lequel les ions sont extrudés à l'extérieur

de la cellule sans nécessiter d'apport énergétique (Fig 5). L'efflux à travers la membrane externe

fait en outre parfois intervenir des porines (OmpC). L'expression des systèmes RND est souvent

régulée par un système senseur/régulateur (dit à deux composants). Lorsque le senseur lie un ion

métallique pour lequel il a une affinité suffisante, il change de conformation, et peut phosphoryler le

régulateur afin de l'activer. Le régulateur active la transcription des gènes de l'opéron qui codent pour les trois composants du système d'extrusion (Diels et al., 1995a).

4

OMP

MFP

RND

4

OMP

MFP

RND Membrane

externe

périplasme Membrane

interne

cations

4

OMP

MFP

RND

4

OMP

MFP

RND Membrane

externe

périplasme Membrane

interne

cations

Fig 5: Représentation schématique d'un complexe de type RND. Celui-ci est composé d'une protéine de la famille des RND (en rouge) qui fonctionne comme une pompe insérée dans la membrane interne, reliée par une protéine périplasmique de la famille des MFP (en vert) à une protéine insérée dans la membrane externe appartenant à la famille des OMF (en jaune) (Nies, 2003). Les cations efflux par ce transporteur chimioosmotique peuvent être pris en charge au niveau du périplasme ou du cytoplasme.

Les pompes RND sont longues de plus de 1000 acides aminés et comprennent deux grandes boucles périplasmiques (~300 aa) et douze hélices α transmembranaires (TMH I à TMH XII) (Dong & Mergeay, 1994; Saier et al., 1994). TMH IV contient des résidus conservés dans la plupart des protéines RND. Récemment, les structures 3-D des trois composants du système RND : la protéine RND d' E. coli (AcrB), la protéine MFP de P. aeruginosa (MexA) et la protéine OMF d' E.

coli (TolC), toutes isolées d'un système d'export multidrogues RND-HAE, ont permis de proposer

un modèle de transport au travers des deux membranes (Fig 6) (Higgins et al., 2004; Koronakis et

al., 2000; Murakami et al., 2002). La protéine RND s'organiserait sous forme d'un trimère formant

une cavité au sein du périplasme, d'où le substrat serait transmis à un trimère de la protéine de

membrane externe (OMF) puis extrudé. La protéine OMF formerait un canal en hélices α au travers

du périplasme se prolongeant dans la membrane externe par un tonneau β, permettant ainsi le rejet

du substrat vers l'extérieur de la cellule. La protéine MFP du complexe RND, servirait

d'intermédiaire entre les protéines RND et OMF pour l'assemblage du complexe (Fig 6). Son absence dans le complexe CBA ferait perdre la plupart du temps la résistance apportée à la cellule:

elle aurait une fonction dynamique clé dans le mécanisme de transport (Andersen et al., 2000).

Fig 6: Modèle d'assemblage des trois composants des pompes de rejet multidrogues (RND-HAE). Ce modèle est composé d'un trimère de la protéine TolC d'E. coli (en rouge), d'un anneau de neuf molécules de MexA de P.

aeruginosa (en Bleu) et d'un trimère d'AcrB d'E. coli (en vert) (Eswaran et al., 2004).

I.4.2.3.1.2.2. Le système CDF (Cation Diffusion Facilitators)

La famille des "Cation Diffusion Facilitators" ou CDF est constituée de systèmes composés d'une seule protéine. Elle forme un canal emprunté par les ions pour sortir de la cellule de manière passive, par simple diffusion. Ces systèmes existent chez les procaryotes et chez les eucaryotes. Les membres de cette famille possèdent six segments transmembranaires dont les quatre premiers, en comptant à partir de l'extrémité N-terminale, sont extrêmement conservés (Paulsen & Saier, 1997).

Cette famille posséde une séquence signature spécifique qui comprend un résidu sérine entre les

segments membranaires I et II ainsi que plusieurs résidus aspartate. En dehors de cette signature,

ces protéines peuvent varier en taille, en séquence et dans leur localisation cellulaire (Paulsen et al., 1997).

La plupart des protéines CDF identifiées transportent le cobalt, le cadmium et/ou le zinc. Le transport est assuré par un gradient chimioosmotique (gradient de potentiel ou de pH) ou un gradient de potassium. La protéine CzcD de Bacillus subtilis qui appartient à cette famille agit comme un antiport Zn(II)/K(I) ou Zn(II)/H(I) (Guffanti et al., 2002). L'échange serait électriquement neutre (Zn(II)/2K(I), Zn(II)/2H(I) ou Zn(II)/K(I)+H(I) et l'énergie nécessaire provient des gradients transmembranaires orientés de façon opposée. Outre le Zn(II), le Co(II) et le Cd(II) peuvent être les substrats de ce transporteur comme démontré pour la protéine CzcD de C.

metallidurans CH34 qui fut le premier CDF décrit (Nies, 1992).

Deux autres familles de transporteurs chimioosmotique plus spécifiques existent, l'un est impliqué dans l'extrusion du Chromate (ChrA) (Juhnke et al., 2002; Silver & Phung le, 2005), l'autre dans l'extrusion de l'Arsenite As(III) (ArsB) (Mukhopadhyay et al., 2002; Silver & Phung le, 2005) et de l'antimonite Sb(III) (Silver & Phung le, 2005)). Ces systèmes sont uniques dans le sens où ils peuvent fonctionner aussi bien seuls comme un système d'extrusion chimioosmotique ou en combinaison avec une autre sous-unité nécessitant de l'énergie sous la forme d'ATP (tel que ArsA).

I.4.2.3.1.2.3. Les protéines MFS (Major Facilitator Superfamily)

Les protéines MFS (Major Facilitator Superfamily) forment une vaste famille de

transporteurs membranaires que l'on retrouve chez les bactéries, les archées et les eucaryotes (Saier

et al., 1999). Ces protéines sont impliquées dans trois formes de transport qui peuvent s'exprimer

par les néologismes de symport, antiport ou uniport de substrats variés tels que les sucres, les

intermédiaires du cycle de Krebs, les antibiotiques, etc... La structure 3-D de trois protéines de cette

famille dont EmrD (Yin et al., 2006) est connue. EmrD est un transporteur multidrogues à douze

segments transmembranaires (Fig 7). La protéine NreB, dont la synthèse est inductible par Ni(II) de

C. metallidurans 31A (anciennement Alcaligenes, Achromobacter xylosoxidans) est le premier

exemple décrit de protéine MFS transportant des métaux (Grass et al., 2001). En présence de nickel,

le gène nreB est induit et gouverne l'efflux de l'ion métallique conférant la résistance à la bactérie.

Fig 7: A et A') Représentation schématique de l'organisation topologique des transporteurs MFS avec 12 ou 14 segments transmembranaires (les zones noircies sont des régions conservées en séquences (Putman et al., 2000). B) Structure cristalline d'un transporteur MFS: dimère de la protéines EmrD, transporteur de drogues d'E. coli (Yin et al., 2006).

I.5. Mécanismes microbiens de résistance aux métaux lourds présents chez C. metallidurans

C. metallidurans CH34 possède un grand éventail de déterminants de résistance aux métaux lourds. Ces gènes de résistance sont principalement portés par les plasmides pMOL28 et pMOL30.

Au total, CH34 possède des déterminants de résistance à au moins 14 cations ou oxyanions

"lourds" différents: Ag(I), AsO2 ^- , As3O4 ^3- (pas de phénotype encore connu), Bi(III), Cd(II), Co(II), CrO ₄ ^2- , Cu(I), Cu(II), Hg(II), Mn(IV), Ni(II), Pb(II), Tl(I), Zn(II) (Fig 8).

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Fig 8: Résistance aux métaux chez C. metallidurans CH34 dans le tableau périodique des éléments, dit aussi de

Mendeleiev (dont on a célèbré en 2007 le premier centenaire de la mort). Les métaux pour lesquels une indication

phénotypique ou génotypique est disponible sont marqués par un astérisque.

Dans cette partie, nous ne décrirons que les mécanismes de résistance aux métaux lourds caractéristiques de C. metallidurans CH34 (souvent CH34 en est le principal sinon l'unique modèle d'étude). Les gènes codant pour les mécanismes de résistance aux métaux lourds présents chez C.

metallidurans CH34 seront détaillés dans la section III.1. Certains de ces mécanismes font en outre l'objet d'un chapitre entier (comme les résistances liés aux ATPases dans la section III.2.2 ou la résistance au cuivre dans la section III.2.3).

I.5.1. Résistance à l'argent :

Sept gènes (silESRCBAP) au moins sont impliqués dans un mécanisme de résistance à l'argent (l'ion Ag(I)) décrit chez des souches de Salmonella typhimurium (Gupta et al., 1999) isolées de plaies traitées par la sulfadiazine d'argent. Ces génes sont portés par un plasmide.Le gène silP code pour une ATPase de type P et les gènes silCBA pour un système d'extrusion de type antiport cation/proton. Ce couplage entre deux mécanismes complémentaires de résistance à l'argent est l'un des premiers à avoir été décrits. L'expression de cet opéron est régulée par un système à deux composants, le répresseur SilR et le senseur/kinase SilS (Gupta et al., 1999). Le gène silE co- transcrit avec silRS code pour une protéine périplasmique qui peut lier quatre Ag(I) par monomère.

Les gènes structurels silCBA sont transcrits dans la direction opposée à silRSE. Les gènes silCBA sont similaires aux gènes czcCBA et cnrCBA (voir section III.1.1.1). Chez C. metallidurans un opéron silCBA est localisé sur pMOL30 (voir section III.1.1.1).

I.5.2. Résistance au cadmium, au cobalt et au zinc :

Les ions Cd(II) sont non essentiels et très toxiques pour la plupart des bactéries (comme le Hg(II), le Tl(I)…). Cet ion peut agir comme inhibiteur compétitif vis-à-vis de cations essentiels tel que le Zn(II).

I.5.2.1. Via un transporteur ATP-dépendant:

Le système de résistance le mieux caractérisé est codé par l'opéron cad porté par le plasmide pI258 de Staphylococcus aureus (Endo & Silver, 1995; Novick & Roth, 1968; Nucifora et al., 1989;

Yoon & Silver, 1991). Des opérons similaires se trouvent chez des bactéries à Gram ⁺ et Gram ^- .

L'opéron cad de S. aureus code pour un répresseur transcriptionnel, CadC (Endo & Silver, 1995), et

une ATPase de type P1-B CadA similaire à celle associée à la maladie de Menkes (marquée par un

trouble du métabolisme du cuivre) (Silver et al., 1993). La protéine régulatrice CadC appartient à la

famille ArsR des répresseurs transcriptionnels (Cook et al., 1998; Silver & Phung, 1996; Sun et al.,

2001). Sous la forme d'un dimère, elle se lie à l'ADN au niveau d'une région opératrice, provoquant

la répression de la transcription de cadA (Endo & Silver, 1995). La liaison de cations tels que

Cd(II), Zn(II) ou Pb(II) à CadC entraîne un changement de conformation de la protéine, sa dissociation de la molécule d'ADN et l'expression de CadA (Endo & Silver, 1995; Rensing et al., 1998). La résistance aux cations Cd(II) provient de leur extrusion active à l'extérieur de la cellule grâce à CadA qui peut aussi expulser de la cellule d'autres cations tels que Pb(II), Zn(II), lorsqu'ils sont présents en hautes concentrations (voir section III.1.1.2).

Les ions Zn(II) sont des cofacteurs essentiels à l'activité ou la stabilité conformationnelle de certaines protéines, mais ils sont toxiques au-delà d'un certain seuil de concentration, un peu plus élevé que pour d'autres métaux lourds. L’opéron zntA d' E. coli (Rensing et al., 1997b) code pour une ATPase de type P qui partage une forte identité avec la protéine CadA. ZntA est capable d'extruder le Zn(II), le Pb(II) et le Cd(II) lorsque leurs concentrations intracellulaires deviennent trop élevées (Rensing et al., 1997b; Rensing et al., 1998). La régulation de l'expression de ZntA est contrôlée par ZntR, un répresseur transcriptionnel de la famille MerR.

Les ATPases de type P identifiées chez C. metallidurans CH34 seront décrites dans les sections III.1.1.2 et III.2.2.

I.5.2.2. Via l'extrusion chimioosmotique: le système czc

La région czc portée par le plasmide pMOL30 de C. metallidurans CH34 (voir les sections III.1.1.1 et III.2.1) est impliquée dans la résistance au Cd(II), au Zn(II) et au Co(II). Les ions métalliques entrent dans la cellule par un système de transport du Mg(II) et sont rejetés activement hors de la bactérie lorsque les gènes czc sont exprimés via les mRNA czcN, czcI, czcCBA et czcDRS, czcE et czcP (Fig 9).

Les protéines CzcA, CzcB et CzcC sont essentielles pour la résistance et forment au travers des deux membranes un complexe de rejet cationique qui agit comme un antiport cation-proton (Nies, 1995). CzcA appartient à la famille des pompes RND. C'est elle qui assure l'antiport cation- proton. CzcB, de la famille des MFP, assure le lien entre CzcA, dans la membrane interne et la protéine canal CzcC, de la famille des OMP, insérée dans la membrane externe (Goldberg et al., 1999; Rensing et al., 1997a).

Les protéines CzcR et CzcS constituent un système de régulation à deux composants

(Koretke et al., 2000) qui active l'expression des gènes czcCBA (Grosse et al., 1999) (voir section

III.1.1.1). Les protéines CzcI et CzcN seraient aussi impliquées dans la régulation de l'opéron czc

(Anton et al., 1999; Grosse et al., 1999). CzcN est probablement liée à la membrane cytoplasmique

(Anton et al., 1999; Grosse et al., 1999). L'intervention d'autres gènes (czcE, J, P, M (ex-mgtC)…)

n'est pas exclue mais leur fonction n'est pas connue (voir section III.1.1.1) (voir aussi pour czcJ la

section III.3.1.3…).

Fig 9: Représentation schématique du système de résistance czc de C. metallidurans CH34 (Nies, 2000).

I.5.2.3. Via le système CDF (Cation Diffusion Facilitator)

Outre les gènes décrits ci-dessus, l'opéron czc gouverne la synthèse de la protéine CzcD de la famille des CDF. Cette protéine est le premier transporteur chimioosmotique procaryotique de la famille des CDF a avoir été décrit (Anton et al., 1999; Kunito et al., 1996; Nies, 1992; Paulsen &

Saier, 1997). Elle possède au moins quatre hélices α transmembranaires et permet le passage des ions à travers la membrane interne. Des études de mutagenèse ont montré que cette protéine agit comme un répresseur du système CBA en extrudant les cations inducteurs (Anton et al., 1999).

I.5.3. Résistance au chromate

Le chromate entre dans la cellule par le système d'entrée des sulfates (perméase à sulfate)

(Nies et al., 1990). Chez C. metallidurans CH34, deux régions codant pour la résistance au

chromate ont été identifiées. L'une comprend 6 gènes chrIB 1 A 1 CEF 1 , localisés sur le plasmide

pMOL28. L'autre comprend trois gènes, chrB 2 A 2 F 2 , localisés sur le mégaplasmide (Juhnke et al.,

2002). La transcription des gènes chr est activée par l'accumulation de Cr(VI). La résistance est

basée sur l'extrusion du chromate par la pompe ChrA, appartenant à la famille des transporteurs

CHR (Juhnke et al., 2002). La protéine ChrC est une superoxyde dismutase à fer (Fe-SOD) (Juhnke

et al., 2002), c'est même la seule superoxyde dismutase qui s'exprime quelques soient les conditions testées chez C. metallidurans CH34 (Roux & Coves, 2002). La protéine ChrE serait impliquée dans le clivage des complexe chrome-gluthation (Juhnke et al., 2002). Les protéines ChrB, ChrF, ChrI sont probablement impliquées dans un système de régulation avec, respectivement, ChrB comme activateur et ChrF et ChrI comme répresseur (Juhnke et al., 2002).

I.5.4. Résistance au cuivre :

Les ions cuivre sont notamment impliqués dans les activités d’oxydoréduction enzymatique.

C'est pour cette raison, que le transport et la résistance aux ions cuivre ont été largement étudiés ces dernières années, en particulier chez E. coli (Brown et al., 1992; Lee et al., 2002; Rensing & Grass, 2003; Tetaz & Luke, 1983) et Enterococcus hirae (Solioz & Stoyanov, 2003). Les ions cuivre existent sous les formes Cu(II) et Cu(I). Le Cu(II) est plus abondant dans les environnements aérobes tels que les milieux extracellulaires et est beaucoup moins toxique que le Cu(I), qui lui se trouve paradoxalement à l'intérieur de la cellule (bien que, sans doute, jamais sous la forme d'un cation libre). La réduction du Cu(II) en Cu(I) se fait au niveau de la surface de la cellule avant ou pendant son transport à l'intérieur de celle-ci, si bien que le cuivre qui se trouve dans la cellule est exclusivement du Cu(I).

L'organisation des déterminants de résistance au cuivre de C. metallidurans CH34 sera décrite dans la section III.2.3.

I.5.4.1. Via les ATPases d'efflux:

La protéine CopA est l'ATPase à Cu(I) de type P d'E. coli (Rensing & Grass, 2003). Elle est responsable du maintien d'une basse concentration intracellulaire en cuivre. Il n'existe probablement aucun ion Cu(I) sous forme libre dans la cellule. Chez E. coli, l'oxidase périplasmique CueO, protége la cellule de concert avec le système de transport RND (cusCFBA) (Franke et al., 2003;

Rensing & Grass, 2003; Singh et al., 2004). Malgré toute la recherche effectuée sur le métabolisme du cuivre chez E. coli, le mécanisme de captation du cuivre et le mouvement intracellulaire de celui-ci par des enzymes spécifiques ne sont toujours pas connus (Rensing & Grass, 2003).

L'ATPase CopA est capable d'extruder les ions cuivre comme CadA les ions cadmium. Mais, on ne connaît peu de chose sur la spécificité des ATPases pour un ion métallique, ou sur les différences entre les ATPases d'exports et celles d'imports.

Chez C. metallidurans CH34, il existe deux orthologues à l'ATPase CopA de E. coli; CupA et CopF. Le gène cupA est localisée sur le chromosome (section III.1.1.2), et le gène copF est portée par le plasmide pMOL30 (section III.1.1.2 et III.2.3).

Chez les cyanobactéries, deux ATPases de type P sont impliquées dans l'entrée du cuivre, CtaA qui

apporte le cuivre dans le cytoplasme et PacS qui pompe les cations cuivre du cytoplasme vers le

compartiment du thylakoïde (où a lieu la photosynthèse) (Cavet et al., 2003). Une troisième protéine Atx1, fonctionne comme un chaperon des ions cuivre Cu(I) durant leur transit à travers le cytoplasme, de manière à ne jamais libérer l'ion (Cavet et al., 2003).

I.5.4.2. Via l'extrusion chimioosmotique:

Le système RND d'extrusion de type cation-proton antiport à trois composants d'E. coli:

CusCFBA a été étudié en détail (Franke et al., 2003; Rensing & Grass, 2003). Ce complexe confère une résistance au Cu(II) en condition anaérobique ou quand le gène cueO est muté (Franke et al., 2003). En condition aérobique, le système CusCFBA confère une résistance à l'Ag(I) mais pas au Cu(II). C'est pour cette raison qu'il avait été nommé Agr pour Ag(I) résistance (Gupta et al., 1999).

Les séquences des protéines CusC, CusB et CusA sont très similaires à celles des protéines SilC, SilB et SilC qui confèrent la résistance à Ag(I) (Gupta et al., 1999). Les gènes cusCBA codent respectivement pour une protéine de membrane interne (CusA), une protéine de couplage des membranes interne et externe (CusB), et une protéine de membrane externe (CusC). Six résidus A399 D404 D412 M573 M623 M672 conservés dans la séquence de la protéine RND CusA sont nécessaires pour conférer la résistance aux cations cuivre (Franke et al., 2003). La petite protéine CusF, localisée dans le périplasme, serait un chaperon périplasmique qui présenterait le Cu(I) au système d'extrusion CusCBA.

Les gènes agr et cus respectivement identifiés sur le chromosome et le mégaplasmide de CH34 seront décrits dans la section III.1.1.1 et III.2.1, tout comme les gènes sil identifiés sur le plasmide pMOL30.

I.5.4.3. Via le système pco/cop (périplasmique):

Quelques souches d'E. coli possèdent un plasmide (pRJ1004) contenant d'autres gènes de résistance au cuivre , les gènes pcoABCD pcoRS pcoE. Ils sont impliqués dans le transport du cuivre périplasmique. PcoA, PcoE et PcoC sont des protéines qui lient le cuivre. PcoA est (comme CueO) une oxydo-reductase (Brown et al., 1992; Brown et al., 1995) (Fig 10). Des équivalents de ces gènes ont été identifiés sur le plasmide pPT23D (copABCD, copRS (Cooksey, 1994) et sur le chromosome de P. syringae, sur le plasmide de virulence pLVPF de Klebsiella pneumoniae CG43 (Chen et al., 2004), sur le plasmide R478 de Serratia marcescens (Gilmour et al., 2004) sur le chromosome (copSR copABCD) et sur le plasmide pMOL30 de C. metallidurans CH34 (voir section III.2.3). L'organisation de ces régions cop diffère entre les β et γ protéobactéries. La transcription est divergente chez les β-protéobactéries (copSR et copABCD) alors que tous les gènes sont transcrits dans la même direction chez les γ-protéobactéries (pcoABCDRSE et copABCDRS).

Des gènes complémentaires sont parfois présents comme pcoE chez E. coli ou copI chez C.

metallidurans (section III.2.3).