Ce travail a commencé 26 ans après la découverte de cette bactérie, au moment où la
séquence du génome de C. metallidurans est devenue disponible et exploitable. Le séquençage et la
fermeture du génome (en partie grâce à ce travail, voir annexes) ont permis d'établir un catalogue
des gènes de résistance aux métaux lourds portés par le chromosome, le mégaplasmide et les deux
plasmides. Les analyses transcriptomiques faites en PCR quantitative et sur puces à ADN ont
apporté une meilleure compréhension de la réponse de la bactérie aux ions métalliques.
A ce jour, C. metallidurans CH34 semble porter le plus grand nombre de gènes de résistance
aux ions métalliques de toutes les bactéries connues. Au moins 170 gènes de résistance ont été
répertoriés, ils correspondent à des déterminants déjà identifiés chez CH34 ou correspondant à des
homologues connus chez d'autres bactéries. La majorité des gènes correspondent aux systèmes
HME-RND (66 gènes) et aux systèmes des ATPases de type P (55 gènes). Les deux systèmes sont
associés dans les régions cop et czc de pMOL30, pour accroître l'efficacité de détoxification ou
permettre de détoxifier plusieurs compartiments à la fois (périplasme et/ou cytoplasme).
IV.1. Tous les gènes identifiés comme potentiellement impliqués dans la
résistance sont-ils activés en présence d'ions métalliques ?
Les deux plasmides pMOL28 et pMOL30 portent à eux seuls plus de la moitié des gènes de
résistance aux ions métalliques. L'analyse transcriptomique réalisée en PCR quantitative et en puce
à ADN montre que seuls les opérons cnr (pMOL28), czc et sil (pMOL30) sont surexprimés en
présence d'ions métalliques (section III.2.1). Ce résultat a été confirmé avec des fusions lux (Nies et
al., 2006). Les gènes des autres opérons HME-RND sont donc, soit non fonctionnels, soit activés
dans d'autres conditions. Ainsi, d'autres expériences de puces à ADN devraient être réalisées en
faisant varier les conditions testées telles que le milieu de culture, le temps d'induction, la phase de
croissance de la bactérie, la concentration ou la nature de l’ion métallique ajouté (As, Cr, U, Mn,
Fe, Sn…)...
Des analyses transcriptomiques sur puces à ADN devraient être aussi réalisées avec des
concentrations en ions métalliques plus faibles sur une souche dérivée de CH34 dépourvue de
plasmides. En effet, les gènes de résistance du chromosome/mégaplasmide pourraient ne s'activer
qu’en réponse à de faibles concentrations en ions métalliques (nous avons montré dans la section
III.2.1 qu’ils ne répondaient pas aux hautes concentrations). L’expression de ces gènes serait non
induite en présence de plasmides spécialisés dans la résistance aux hautes concentrations.
Sur les huit ATPases de type P identifiées dans le génome de C. metallidurans CH34, six
sont surexprimées en présence d'ions métalliques. Les observations transcriptomiques confirment
les prévisions de la bioinformatique qui ont permis de grouper les ATPases en trois classes (section
III.2.2). L'une des ATPases, ZntA, (codée par le mégaplasmide) présente une structure étonnante
composée d'un domaine poly-histidine localisée du côté NH2-terminal. Cette structure pourrait
autoriser une affinité et un transport d'ions très lourds. Après mutagenèse du gène zntA, la résistance
de C. metallidurans aux ions Tl(I) et Bi(III) est réduite, ce qui semblerait indiquer que ZntA est
capable d'extruder ces ions. Il serait intéressant de résoudre la structure de ZntA afin de comprendre
le rôle du domaine poly-histidine et son implication dans le transport d’ions indépendamment de
leurs tailles ou de leurs valences. La surexpression de ZntA dans des souches de C. metallidurans
afin d’accroître la résistance à de hautes concentrations en ions très lourds, associée à la
séquestration de ces ions par bioprécipitation pourraient être utilisées pour l’immobilisation des
ions métalliques très lourds dans des sols pollués afin d'éviter leurs dispersions dans
l’environnement. La surexpression du domaine poly-histidine et sa fixation sur des membranes
pourraient également permettre de filtrer des effluents contaminés en ions lourds.
IV.2. Combien de gènes sont vraiment impliqués dans la résistance aux
ions Cu(II) ?
La section III.2.3 décrit une région cop constituée de 19 gènes codant pour des protéines
impliquées dans l'efflux des ions Cu(I)/Cu(II). Cette région contient des gènes codant pour des
protéines impliquées dans la détoxification du périplasme (copRSABCDI) et du cytoplasme
(copJGLF). Les autres gènes, en particulier copV, copT, copK et copM, coderaient pour des
protéines impliquées dans la séquestration des ions Cu(II) comme premier mécanisme de résistance
puis leur relargage dans le cytoplasme après le processus d’intense efflux. Ces protéines joueraient
donc un rôle dans l’homoeostasie pour éviter une carence de la cellule vis-à-vis du Cu(II) après le
grand nettoyage.
L'analyse transcriptomique montre que des gènes, localisés dans la région adjacente à cop,
sont surexprimés en présence de Cu(II). Ainsi, la région de résistance aux ions Cu(II) pourrait en
réalité compter 32 gènes. Ces nouveaux gènes seraient impliqués dans la détoxification du
périplasme et du cytoplasme (silCBA) et la restauration des membranes ayant subi des dommages
dus à la biosorption du métal (gtrABM). Des études en cytométrie de flux sont envisagées pour
valider le rôle des protéines GtrABM dans la biosynthèse des lipopolysaccharides de surface.
D'autres gènes pourraient également être impliqués dans cette résistance tels que dsbC, ou des gènes
IV.3. Un "appel aux armes" en présence d'ions métalliques ?
Les gènes cop sont surexprimés en présence de Cu(II) mais aussi en présence de Zn(II),
Cd(II), Ni(II) et Pb(II) (section III.2.3). Les gènes cop sont même parmi les gènes les plus
surexprimés en présence de Zn(II), Cd(II) et Ni(II). Cette observation est surprenante étant donné
que la région cop est uniquement impliquée dans la résistance au Cu(II). De la même manière, sur
pMOL28, la région cnr qui code pour des protéines impliquées dans la résistance au Cd(II) et Ni(II)
est surexprimée en présence de Cd(II), Ni(II), mais aussi en présence de Cu(II) (section III.2.1). Il
doit exister un ou plusieurs régulateur(s) surexprimé(s) en présence de Zn(II), Cd(II), Ni(II), Cu(II)
et Pb(II) capable(s) d'induire l'expression des gènes cop et des gènes cnr. Des puces à ADN faites
sur des souches de C. metallidurans portant uniquement soit pMOL28 soit pMOL30 devront
permettre de localiser ces régulateurs sur l'un ou l'autre des plasmides.
La réponse multiple pourrait être un appel aux armes en présence de hautes concentrations
en ions métalliques, obligeant la bactérie à surexprimer dans un premier temps l'ensemble de son
arsenal de résistance et ensuite de maintenir l'expression des gènes nécessaires. Cette réponse
pourrait être assujettie à la régulation par les facteurs sigma. Des expériences de puce à ADN
devraient être refaites dans les mêmes conditions avec des souches de C. metallidurans CH34
mutées pour un ou plusieurs des facteurs sigma. Déjà, des études montrent que la mutation de
certains facteurs sigma (rpoJ, rpoI, rpoL, rpoM, rpoE, rpoR et cnrH) provoque une diminution de la
résistance aux métaux lourds (Grosse et al., 2007).
Cette surexpression massive des déterminants de résistance n'est pas avantageuse d'un point
de vue énergétique pour la bactérie sauf dans le cas d'environnements pollués par des mélanges de
métaux lourds (ex les sites industriels). Ainsi, la surexpression de gènes par d'autres métaux que
ceux de leurs substrats classiques permettrait une réponse plus rapide de la bactérie dans le cas de
contamination par de multiples ions métalliques. Pour vérifier cette hypothèse, des analyses
phénotypiques (mesures de CMI) et transcriptomiques devraient être conduites en mettant C.
metallidurans CH34 en présence de "cocktails" de métaux similaires à ceux rencontrés dans les
sites pollués.
IV.4. Le catalogue des gènes de résistance est-il complet après sa mise à
jour grâce aux études transcriptomiques ?
L'analyse des données d'expression pour les gènes qui codent pour des protéines de fonctions
inconnues (et parfois uniques à C. metallidurans CH34) devrait être plus approfondie, car c'est dans
cette catégorie que nous pourrons identifier de nouvelles ORFs impliquées dans la
résistance/réponse aux métaux lourds et qui pourraient enrichir notre catalogue. De tels gènes ont
déjà été identifiés sur les plasmides, copV, copM, copN, copQ, copE, pbrU, czcJ, mmrQ et les trois
régions gtr (section III.3.1). Cette approche devra être généralisée pour le chromosome et le
mégaplasmide. L’identification des voies métaboliques induites en présence de Cu(II) et de Pb(II)
(section III.3.2) devrait être complétée grâce aux données d'expression déjà obtenues avec les ions
Zn(II), Cd(II), Hg(II), Co(II), Ni(II). Tous les nouveaux gènes identifiés devraient être mutés pour
vérifier le phénotype en présence d'ions métalliques. Cette étude systématique pourrait passer par la
réalisation d'une banque de mutants plutôt que par celle d'une approche en mutagenèse dirigée.
Enfin, une fois ce catalogue terminé, l'étude transcriptomique de la réponse de C. metallidurans
CH34 pourra être réalisée dans des conditions plus proches de celles trouvées dans son biotope
naturel : mélange de métaux, sources de carbone diverses, température de croissance plus proche de
celle de l'environnement, stress hydrique et différence entre un stress aux ions métalliques de type
chronique ou de type aigu.
IV.5. La structure du génome et l'assemblage en modules de gènes de
résistance aux métaux lourds:
Six génomes appartenant au genre Cupriavidus / Ralstonia sont séquencés et annotés (ou en
cours d'annotation), C. taiwanensis, C. eutrophus H16, C. pinatubonensis JMP134, deux souches de
R. solanacearum GMI1000 et UW551 et enfin C. metallidurans CH34. L'organisation des différents
génomes est similaire: elle comprend un chromosome, un (ou deux) mégaplasmide(s) et un (ou
deux) plasmide(s). Ces derniers semblent contenir les gènes associés à la spécificité de la bactérie
(résistance aux métaux lourds chez C. metallidurans CH34, fixation de l'azote chez R. taiwanensis,
hydrogénotrophie chez R. eutropha H16). La comparaison entre le génome de C. metallidurans
CH34 et celui des autres bactéries du genre Cupriavidus/Ralstonia a mis en évidence de larges
régions de synténie entre les chromosomes. La synténie est moindre et plus "éclatée" entre les
mégaplasmides. De plus, alors que les gènes de résistance aux métaux lourds semblent concentrés
sur les plasmides au sein d'îlots génomiques, ces déterminants se répartissent de manière homogène
sur le mégaplasmide de CH34.
Les plasmides des bactéries du genre Cupriavidus/Ralstonia, pMOL28 (plasmide de C.
metallidurans CH34), pSym (plasmide de R. taiwanensis) et pHG1 (plasmide de C. eutrophus
H16), contiennent un noyau de gènes communs impliqués dans la réplication, la maintenance et le
transfert conjugatif (voir article en annexe). Ce noyau de gènes suggère une origine commune des
différents plasmides, puis l'acquisition de modules en fonction de leurs environnements via les
éléments génétiques mobiles. Ceux-ci se trouvent souvent à proximité ou même portent des
déterminants de résistance aux métaux lourds (l'îlot "serpentine" sur le plasmide pMOL28, les îlots
"thallium", l'îlot RMGI-2(C) qui porte les gènes cadA et pbrA). D'autre îlots génomiques ont aussi
été détectés dans le chromosome : une allusion y est faite dans la section suivante.
Les données de puces à ADN indiquent une surexpression des gènes impliqués dans la
transposition des Tn4378 et Tn4380 en présence des ions Cd(II) et Pb(II). Cette surexpression
suggère un possible rôle des métaux lourds dans la dissémination de ces transposons.
En complément, les puces à ADN révèlent la surexpression de gènes codant pour des
transposases qui appartiennent à des éléments IS tronqués. L'un de ces gènes, porté par pMOL30,
est surexprimé 20.1 fois en présence de Cd(II), 7.3 fois en présence de Zn(II), 5.9 fois en présence
de Ni(II). Ces "transposases" ont perdues une partie de leur domaine catalytique (motif DDE), elles
ne sont donc pas impliquées dans la transposition, mais elles pourraient avoir un autre rôle
biologique dans la bactérie. Chez les eucaryotes, les transposases, intégrases, transcriptases
inverses…réarrangées, constituent un réservoir de nouvelles fonctions qui peuvent être recrutées par
les cellules au cours de l'évolution (Volff, 2006). Dans cet esprit, on peut se demander si les
transposases tronquées induites appartenant à des vestige d'éléments IS, ne pourraient pas avoir
évolué vers d'autres fonctions que la transposition, telle que la régulation (ces transposases
contiennent un site de liaison à ADN intact). Ainsi, il est tentant de lier l'induction de ces ORFs
avec la réponse multiple observée pour d'autres gènes plasmidiens.
IV.6. L'annotation et le décryptage des autres fonctions biologiques de C.
metallidurans CH34, une vie en dehors de la résistance aux métaux
lourds ?
L'annotation complète du chromosome et du mégaplasmide de C. metallidurans CH34 est en
cours via la plate-forme MAGE (http://www.genoscope.cns.fr/agc/mage/). Cette plate-forme facilite
le travail en permettant la visualisation des régions de synténie entre CH34 et les génomes annotés
les plus proches (R. solanacearum, C. pinatubonensis JMP134, et C. eutrophus H16) (Vallenet et
al., 2006). Une fois l'annotation terminée, les données transcriptomiques pour chaque gène seront
ajoutées sur la plate-forme MAGE pour permettre l'identification de nouvelles voies métaboliques
induites en présence d'ions métalliques et des réseaux de régulation (facteurs sigma, les régulateurs
à deux composants, les régulateurs de la famille MerR…).
L'annotation experte du chromosome de C.metallidurans a commencé et met en évidence la
présence de trois nouveaux îlots génomiques présentant une structure fort similaire à celle du
transposon catabolique Tn4371 ((Toussaint et al., 2003), article en annexe). Cet îlot contient trois
blocs de gènes : l'un central gouverne la dégradation du biphényle, il est flanqué, à gauche, par des
par des gènes de transfert (sécrétion de type IV (trb)) très similaires à ceux observés dans le
plasmide Ti.
Du point de vue des résistances aux ions métalliques, seul un de ces îlots nous intéresse car il
semble inclure l'opéron HME-RND hmz. Cet îlot est cependant particulier car le bloc de sécrétion
de type IV est remplacé par trois génes int, tniB, tniQ. Nous avions vu très tôt la possible
association d'un opéron impliqué dans la résistance aux ions métalliques avec un îlot apparenté à
Tn4371, mais l'avions d'abord attribuée à une erreur d'assemblage du chromosome. La séquence
définitive a confirmé donc notre première observation. Toutefois hmz est un opéron qui ne contient
pas d'équivalent czcC : ce dernier est remplacé par nod21, et l'on peut se poser la question de savoir
si cet opéron et l'îlot correspondant ne sont pas plutôt impliqués dans une fonction reliée à
l'interaction avec les plantes et nullement dans la réponse aux métaux lourds. En effet, le génome de
C. metallidurans contient des gènes liés à l’interaction avec les plantes qui ont été révélés par
comparaison avec les déterminants déjà identifiés chez R. solanacearum (A. Cubaka, comm. pers.).
En dehors de la résistance aux métaux lourds, l’annotation du génome de C. metallidurans
CH34 nous réserve aussi de nombreuses surprises sur l'adaptation aux environnements extrêmes,
sur les interactions avec les plantes, la chimiolithotrophie et la dégradation des organiques
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Organisation et expression des gènes de résistance aux métaux lourds chez Cupriavidus metallidurans CH34
(Page 71-99)